Name: Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Lernen Sie ein ex-vivo-Verfahren zur hochauflösenden Bildgebung der Cilienmotilität in Maus-Atemwegsepithelien. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Schlagfrequenz und Flüssigkeitsfluss für die Atemwegsforschung.

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Das Projekt wurde vom NIH U01HL098180 vom National Heart, Lung, and Blood Institute unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt den offiziellen Standpunkt des National Heart, Lung, and Blood Institute oder die National Institutes of Health

1. Reagenzien-Setup 1.1 Dissection und Imaging Medium Leibovitz L-15-Medium (L15) mit FBS (10%) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten / ml Penicillin G-Natrium und 100 ug / ml Streptomycin Sulfat) ergänzt wird sowohl während der Ernte und Abbildung Luftröhre Proben verwendet. 2. Shallow Walled Kultur Chamber Assembly Die Kammer zur Luftröhre Gewebe halten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Boden der Kammer ist der Glasboden 35 mm Kulturschale. Die obere und die Seite der Kammer wird, indem ein kleines Stück 0,3 mm dicken Silikon Folie über die Glasschale generiert. Der Rand der Platte geschnitten wird, um die runde Bodenschale passen und das Zentrum weiter getrimmt, um eine flache zentrale Kammer zu bilden (siehe Schritte 2.1-2.3). Am Anfang dieser Montage wird ein 18 mm runden Deckglas platziert, um eine geschlossene Kammer für Bildgebung erzeugen. <ol><li> Komplett decken ein 18 mm runden Deckglas mit einem Quadrat von 0,3 mm dicke Folie Silikon. </li><li> Mit Standard scharfe Sektion Schere überstehendes Silikon Folie aus um den Rand des Deckglases (resultierend in einer kreisförmigen Schicht aus Silikon-Folie). </li><li> Mit einem scharfen Skalpell ausgeschnitten und Entfernen eines zentralen Platz von Silikon-Folie (ca. 10 mm im Quadrat) von der Mitte der überdachten Deckglas (wodurch die Oberseite und die Seiten des bildgebenden Kammer). </li></ol> 3. Luftröhre Ernte und Vorbereitung <ol><li> Euthanize Mäusen in Übereinstimmung mit den örtlichen Institutionen Tierpflege und verwenden Ausschuss und / oder staatlichen Richtlinien und entfernen Luftröhre in einem Standard-Kunststoff 35 mm Kulturschale mit genug L15 Medien zu versenken Gewebe (Autoren haben Mäuse kurz vor der Geburt bei Trächtigkeitstag 16.5 verwendet, bis hin zu Neugeborenen, Neugeborenen und erwachsenen Tieren 2). </li><li> Entfernen nicht-Trachea zugehörigen Gewebe an der Außenseite desdie Luftröhre mit stumpfen Dissektion. </li><li> Entfernen Sie den Kehlkopf mit einem Schnitt quer unterhalb des Ringknorpels mit Mikro Schere Dissektion (2A, Zeile 1). </li><li> Entfernen Sie die linke und rechte primäre bronchiale Äste mit einem Schnitt quer oberhalb der Carina mit Mikro Schere Dissektion (2A, Zeile 2). </li><li> Halten Sie das Luftröhre mit feinen Pinzetten und bündig die Lumen 2-3 mal mit ~ 1 ml der Baden L15 Medium mit einem P1000 und P1000 Pipetman Spitze, um Schleim und Blut zu löschen. </li><li> Schneiden Sie einen Ring 3-4 Segment der Luftröhre mit einem Schnitt quer mit Mikrodissektion Schere (2B, Zeile 1). </li><li> Schneiden in Längsrichtung durch die Mitte des trachealis Muskel dieser kurzen Luftröhrensegment mit Mikro Schere Dissektion (2B, Zeile 2). </li><li> Schneiden in Längsrichtung durch die Mitte der Trachealknorpels Ringe mittels Mikrodissektion Schere (2C </strong&gt;, Zeile), so dass zwei Abschnitte der Luftröhre Gewebe geeignet zur Bildgebung (einzigen Abschnitt in 2D gezeigt). </li></ol> 4. Cilia Imaging <ol><li> Übertragen Luftröhre Gewebe Segmenten Lumen unten, auf der Mitte eines 35 mm Glasboden Kulturschale mit 100-200 ul L-15-Medium. </li><li> Zur Quantifizierung Zilien generierte Strom eine geringe Menge von 0,20 um fluoreszierenden Mikrosphären auf den L-15-Medium baden die Luftröhre Gewebeprobe (~ 1 x 10 11 Partikel / ml oder 20 ul / ml des Fluoresbrite 2,5% wässrige Mikrokugel-Suspension). </li><li> Legen Sie die Imaging-Kammer zuvor (siehe Vorgehensweise 1-3 oben) auf der Oberseite der Luftröhre Probe Silikon-Blatt nach unten vorbereitet, mit der Luftröhre Probe in der Mitte des flachen ummauerten Kammer durch das Fenster in die Silikon-Folie geschnitten gebildeten (Abbildung 1 ). </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf dem Deckglas, um im Platz zu sichern und entfernen Sie überschüssiges L-15 Medien aus dem Kanten usinga P1000 und P1000 Pipetman Spitze. </li><li> Montieren Sie das 35 mm Glasboden Kulturschale und Luftröhre Probe auf einem inversen Mikroskop mit 100x-Objektiv und DIC-Optik. </li><li> Mit einem High-Speed-Kamera und Film-Erfassungs-Software sammeln Filme von Zilien Motilität bei 200 + Frames pro Sekunde entlang der Luftröhre ciliated Epithelien der zusammengerollt Rand des trachealis Muskel (Abbildung 2D eingerahmten Feld, E: Beispiel Standbild aus aufgezeichneten Film) (Supplementary Film 1). </li><li> Mit FITC epifluoreszenten Bildgebung und ein wenig Licht CCD-Kamera (siehe Ausstattungsliste oben), sammeln Filme von fluoreszierenden Mikrokügelchen Bewegung über die Oberfläche des ciliated trachealen Epithel später Quantifizierung der Zilien erzeugte Strömung (Ergänzende Movie 2) zu ermöglichen. </li></ol> 5. Quantifizierung von Cilia Motilität <ol><li> Legen DIC abgebildeten Filme in der ImageJ Software-Paket und im Anschluss an die Technik, die von I beschriebenain Drummond 13 verwenden Sie die Zeile Werkzeug, um ein Raster-Linie über den Wimpern schlagen zu ziehen. A &quot;reslice&quot; dieser Linie erzeugt eine Art Bild kymograph wo Zilien Bewegung über die Linie erzeugt ein Wellenmuster. Die Anzahl der Pixel zwischen jedem Wellenberg ist sie gemessen (ein Pixel = ein Film-Frame), aus denen die Anzahl der Schläge pro Minute (dh Hz) kann dann berechnet werden. </li><li> Um Zilien erzeugte Strömung Last fluoreszierenden Kügelchen Filme in der ImageJ Software-Paket zu messen, und verwenden Sie das Plugin MTrackJ 14 manuell verfolgen fluoreszierende Kügelchen über die Oberfläche der Luftröhre Epithelien und lassen Sie die Software erzeugen Wulst Geschwindigkeit und Ausrichtung für jede Perle verfolgt. </li></ol> Es sollte darauf geachtet bei der Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen zu fließen wie der Abstand von dem schlagenden Cilien quantifizieren stark beeinflussen können gemessenen Flußbetrags werden. Der Wulst Bewegung in Supplemental Movie 2 ist ein gutes Beispiel dafür. In diesem Beispiel WulstBewegung an der Oberfläche des schlagenden Cilien schnell und deutlich fällt für Perlen weiter weg in den baden-Medien. Um dies zu kontrollieren, sollte Wulst Kurven nur in einem festen Abstand über der Flimmerepithelien in allen Proben gesammelt werden, damit die korrekte Vergleich möglich ist. Schließlich, um repräsentative Daten über Strömung zu erhalten, sollte Perlen für so lange wie möglich verfolgt werden; wir lieber zu Wulst Tracks, 10 + Flimmerzellen decken zur Berechnung Strömung verwenden.

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</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Messung der Zilien Überlagerungsfrequenz (CBF) ist relativ einfach mit hoher Leistung Mikroskop-Objektive und schnelle Bildaufnahme Hardware 13,15, und erklärt, warum CBF-Messungen die Grundlage der meisten Studien untersuchen mukoziliäre Clearance bei Gesundheit und Krankheit bilden. Doch während CBF-Messung ist für das Verständnis mukoziliäre Clearance, Messung der CBF allein wesentlichen ignoriert die zugrunde liegende Bedeutung sowohl ciliary erzeugt Strom und Cilienschlag Wellenform, die beide mehr schwe...

Analyse von beweglichen Zilien Funktion im Atemwegsepithelien ist experimentell wichtig für die Aufklärung der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die mukoziliäre Clearance und pulmonale Gesundheit 1 beeinflussen können. Das einfache Protokoll für die Bildgebung der Maus Atemwegsepithelien entwickelt bietet eine effiziente Methode, um Atemwege Zilien Motilität in Mutanten und Knockout Mausmodelle verhören und erfordern nur Grundkenntnisse in Maus Luftröhrengewebe Dissektion und ex-vivo-Bildgebung der Atemwege Zilien Motilität mit hoher Auflösung Videomikroskopie. Dieses Protokoll wurde gegründet und während eines großen Maus Mutagenese Bildschirm verfeinert, um eine schnelle Auswertung der beweglichen Zilien Funktion (Zilien Überlagerungsfrequenz, Cilienschlag Form, Zilien erzeugte Strömung) in Mutanten mit angeborenen Herzfehlern mit Heterotaxie 2-5 ausgesetzt sind. Aktuelle Techniken zur Atemwege Zilien Motilität studieren kann entweder in der akuten ex vivo-Typ oder lon gruppiert werdenger Begriff in vitro experimentelle Ansätze. Akute Experimente umfassen ex vivo Visualisierung der menschlichen Nase / Atemwege Pinsel Biopsien 6,7 und Analyse einfacher quer Atemwege Abschnitte 8. Die in-vitro-Ansätze nutzen verschiedene Techniken, um Zellkultur Blatt differenzierte Flimmerepithelien wie in Luft Grenzfläche Kulturen oder Atemwege Suspensionskulturen 9-11 erzeugen. Jedoch erfordern diese Atemwegsepithelien reciliation Techniken sehr bedeutende Investition in Zeit und Training, bevor irgendwelche brauchbaren Flimmerepithelzellen zum Experimentieren (4-6 Wochen 9,10) hergestellt werden. Während akute ex vivo Analyse der Atemwegsepithelzellen Pinsel Biopsien häufig für klinische Studien am Menschen verwendet werden, ist diese Methode nicht verwendbar in Mäusestudien aufgrund verschärft mechanische Gewebeschädigung 12. Die Technik in diesem Protokoll für die Analyse von mous skizziertene tracheal Atemwegsepithelien ist nicht nur einfach auszuführen, aber es erfordert keine speziellen Fähigkeiten Dissektion noch irgendeine spezielle Ausrüstung außer denjenigen Standard für die Bildgebung von Videomikroskopie. Es gibt viele Vorteile dieser einfachen Protokoll. Zunächst wird, wie die Maus Luftröhre Gewebe Ernte ist schnell und einfach durchzuführen, ermöglicht es eine schnelle Beurteilung der Atemwege Cilien-Funktion in einer großen Anzahl von Mäusen. Dazu kann auch scharfsinnige Analyse der kurzfristigen Auswirkungen der verschiedenen in vitro-Behandlungen. Zweitens ist eine Ex-vivo-Technik bleibt die ciliated Atemwegsepithel attached to it zugrunde Stützgewebe und behalten somit verbundenen Zelle Signalwege. Daher im Vergleich zu in vitro reciliated Atemwegsepithelien, ist dieses Präparat eine bessere Darstellung des natürlichen Gewebe in vivo Umgebung. Drittens erlaubt das Protokoll der Erwerb einer Reihe von verschiedenen quantitativen Parameter, die die objektive Beurteilung der beweglichen Zilien f liefern kannSalbung. Schließlich, im Gegensatz zu anderen aktuellen Methoden zur Sicherung der Atemwege Zilien Visualisierung, ermöglicht dieses Protokoll für die Visualisierung der Flimmerhärchen im rechten Winkel zu der Cilienschlag Richtung, so dass Profilansicht der Zilien, die optimal für hochauflösende Bildgebung von Cilienschlag und metachronal Welle Generation . Dieses Protokoll kann in einer Reihe von Möglichkeiten, um eine breite Palette von experimentellen Anforderungen wie die Rolle von pharmakologischen Mitteln, genetische Faktoren, Umwelteinflüsse und / oder mechanische Faktoren wie Schleim Belastung der Atemwege Cilien-Funktion und Erzeugung / Wartung adressieren geändert werden Atemwege Cilienschlag und metachronal Wellenausbreitung.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz' s L-15 Medium </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Kein Phenolrot </td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x feine Pinzette </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektionschere </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipettierer </td><td>Gilson, Inc</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Spitzen </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 mm runde Glasabdeckfolien </td><td>Fisher Scientific</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Kulturschalen aus Kunststoff </td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Kulturschalen mit Glasboden </td><td>Warner Instruments</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>Silikonfolie 0,012" (0,3 mm) dick </td><td>AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0,20 &mu; m Durchmesser Fluoresbrite YG Carboxylate Mikrosphären </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop, mit 100x Ölobjektiv und DIC-Filtern </td><td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>Marke ist nicht kritisch. </td></tr><tr><td>100-Watt-Quecksilberlampe, epifluoreszierende FITC-Anregungs-/Emissionsfilter</td><td>Lecia</td><td></td><td>Brand ist nicht kritisch.</td></tr><tr><td>Mikroskoptisch Inkubator</td><td>Lecia</td><td>11521749</td><td>Nicht erforderlich, wenn die Bildgebung von Zilien bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitskamera Hellfeld </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>Marke ist nicht kritisch. Muss schneller als 125 fps</td></tr><tr><td>sein Hochgeschwindigkeits-Leuchtstofflampe </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>Marke ist nicht kritisch. Muss schneller als 10 fps</td></tr><tr><td>sein Filmanalysesoftware</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ mit MtrackJ-Plugin</td><td></td></tr></tbody></table>

ex-vivo-verfahren für high resolution imaging von cilia motilität in nagetier atemwegsepithelien

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Ex-vivo-Imaging-Technik für Maus Atemwegsepithelien für die quantitative Analyse von beweglichen Zilien Funktion wichtig für Einblick in mukoziliäre Clearance-Funktion wurde eingerichtet. Frisch geerntete Maus Luftröhre wird in Längsrichtung durch den trachealis Muskel geschnitten und in einer flachen ummauerten Kammer auf einem Glasboden-Gericht. Die Luftröhre Probe wird entlang seiner Längsachse positioniert, um von der trachealis in Längsrichtung gewellt nehmen. Dies ermöglicht die Abbildung von Flimmerbewegung im Profil entlang der gesamten Länge Luftröhre. Videos mit 200 Bildern / sec werden unter Verwendung von Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie und eine Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera der quantitativen Analyse der Cilienschlag Frequenz und Wellenform ciliary ermöglichen. Mit dem Zusatz von fluoreszierenden Kügelchen während der Bildgebung, Zilien erzeugten Fluidstroms bestimmt werden kann. Das Protokoll Zeit erstreckt sich über etwa 30 min mit 5 min für Kammer Vorbereitung, 5-10 min für ProbeMontage und 10-15 min für Videomikroskopie.

Steuerung Atemwege Zilien muss deutlich sichtbar sein und gesehen in einer koordinierten Art und Weise (Supplemental Film 1; Filmwiedergabe auf 15% verlangsamt Echtzeit) zu schlagen, mit spürbarer Strömung in Richtung der Zilien schlagen (Supplemental Movie 2; Filmwiedergabe ist 100% real time). Die Quantifizierung der Zilien Filme sollten zu Ergebnissen führen ähnlich wie in Abbildung 3 zu sehen. Sammlung von High-Speed-DIC Filme ermöglicht die Quantifizierung der Cili...

Eine einfache und zuverlässige Technik für die Visualisierung und Quantifizierung Atemwege Zilien Motilität und Zilien erzeugte Strömung mit der Maus Luftröhre beschrieben. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um zu bestimmen, wie eine Vielzahl von Faktoren Zilien Motilität beeinflussen, einschließlich pharmakologischer Wirkstoffe, genetische Faktoren, Umwelteinflüssen und / oder mechanische Faktoren wie Schleim zu laden.

Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Beweglichkeit der Atemwegs-CLIA und den von der CLIA erzeugten Fluss unter Verwendung frisch isolierter Maus-Trachea sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine flache Abbildungskammer vorbereitet wird. Die nächsten Schritte des Verfahrens sind die Gewinnung und Montage des Trachealgewebes zur Bildgebung.Anschließend wird gezeigt, wie man die C-Beweglichkeit und den durch CLIA erzeugten Fluss mithilfe eines invertierten Mikroskops mit Hochgeschwindigkeitsvideografie über ein 100×DIC-Objektiv sichtbar macht und aufzeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, das Video zu analysieren, indem die Schlagfrequenz der CLIA und der von der CLIA erzeugte Fluss mit der Image-J-Software quantifiziert werden. Letztendlich können die Ergebnisse Veränderungen in der respiratorischen CLIA-Beweglichkeit und im durch CLIA erzeugten Fluss mittels Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie aufzeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie eine reproduzierbare Abbildung des Atemwegsepithels von Nagetieren ermöglicht, um konsistente quantitative Bewertungen der Flimmerbewegung durchzuführen. Dies kann innerhalb von 20 bis 30 Minuten mit minimalem Schulungsaufwand erreicht werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu den zellulären und molekularen Mechanismen zu beantworten, die die Schleimtransportregulation in den Atemwegen steuern, insbesondere wenn sie in Kombination mit verschiedenen genetisch veränderten und mutierten Mausmodellen eingesetzt wird.Beginnen Sie mit dem Aufbau der Kammer, die als Unterlage oder Kammerboden für die Tracheaproben dient. Verwenden Sie eine 35-Millimeter-Kulturschale mit Glasboden für die Oberseite. Nutzen Sie Silikonfolie mit einer Dicke von 0,3 Millimetern.Legen Sie die Folie über eine runde Glasdeckenscheibe mit 18 mm Durchmesser und schneiden Sie den Rand zurecht. Schneiden Sie anschließend mit einem Skalpell ausgehend von der Mitte des Silikons ein 10 mm großes Quadrat aus. Die Glasdeckenscheibe und das Silikon bilden die Oberseite und Seitenwände der Kulturkammer.Sie werden auf die Probe gelegt, die in der Kulturschale platziert ist. Nach der Tötung einer Maus gemäß den institutionellen Richtlinien wird die Luftröhre chirurgisch isoliert. Sammeln Sie die Luftröhre in einer plastischen 35-Millimeter-Kulturschale mit ausreichend L-15-Medium, um sie vollständig zu bedecken.Entfernen Sie mithilfe einer stumpfen Dissektion das gesamte nicht dem Trachealbereich zugehörige Gewebe um die Luftröhre herum. Entfernen Sie anschließend mit feinen Mikroscheren den Kehlkopf durch einen Querschnitt unmittelbar unterhalb des Ringknorpels. Entfernen Sie nun mit einer feinen Pinzette die linken und rechten primären Bronchialäste durch einen Querschnitt unmittelbar oberhalb der Bifurcatio bronchialis.Halten Sie die Luftröhre vorsichtig fest. Spülen Sie dann mit einer Ein-Milliliter-Pipette das Lumen zwei oder drei Mal mit L-15-Medium aus, um Schleim und Blut zu entfernen. Anschließend schneiden Sie mit einer mikrochirurgischen Schere einen drei- bis vierreihigen Abschnitt der Luftröhre durch einen Querschnitt ab.Danach führen Sie im kleinen Trachealsegment einen Längsschnitt durch die Mitte des Trachealmuskels durch. Zuletzt schneiden Sie mit einer Mikrodissektionspinzette längs durch die Mitte der Tracheaknorpelringe, wodurch zwei Tracheagewebeteile entstehen, die für die Bildgebung geeignet sind. Nach der Dissektion überführen Sie die Tracheagewebeteile mit der Lumenseite nach unten in die Mitte der Glasbodenschale mit etwa 100 Mikrolitern L-15.Um den CLIA-erzeugten Fluss bei 20 Mikrolitern einer 2,5%-Suspension fluoreszierender Mikrokügelchen pro Milliliter L-15-Medium zu quantifizieren. Legen Sie nun die Silikon- und Glasabdeckung über die Luftröhre und drücken Sie sie leicht an, um sie zu befestigen. Entfernen Sie anschließend mit einer Ein-Milliliter-Pipette entlang der Ränder überschüssiges Medium.Überführen Sie nun die Kammer auf ein umgekehrtes Mikroskop, das mit einem 100x-Objektiv und DIC-Optik ausgestattet ist. Sammeln Sie mit einer Hochgeschwindigkeitskamera und einer Software zur Videodatenaufnahme Filme der CLIA-Beweglichkeit mit mehr als 200 Einzelbildern pro Sekunde entlang der cilierten trachealen Epithelien der aufgerollten Kante des Trachealmuskels. Sammeln Sie mit der FS-epi-Fluoreszenzbildgebung und einer CCD-Kamera für schwaches Licht Filme der fluoreszierenden Mikrokugeln, die sich über die Oberfläche des cilierten trachealen Epithels bewegen.Mithilfe dieser Aufnahmen fortfahren mit der Quantifizierung der CLIA-erzeugten Flussproben. Proben können bis zu einer Stunde lang abgebildet werden, ohne dass eine erkennbare Veränderung der Cilien-Schlagfunktion auftritt. Beginnen Sie mit der Berechnung der CLIA-Schläge pro Minute. Laden Sie die mit DIC abgebildeten Filme in das Image-J-Softwarepaket.Befolgen Sie die von Aian Drummond beschriebene Technik. Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Rasterlinie zu zeichnen, die die schlagenden Zilien kreuzt.Erstellen Sie einen Querschnitt dieser Linie, um ein grafikartiges Bild zu erzeugen, bei dem die Bewegung des CA entlang der Linie ein Wellenmuster erzeugt. Zählen Sie nun die Anzahl der Pixel zwischen jedem Wellenmaximum entlang dieser Linie. Aus diesem Zählergebnis.Berechnen Sie die Schläge pro Minute unter der Annahme, dass jeder Filmframe durch ein Pixel entlang der Linie dargestellt wird. Messen Sie anschließend den erzeugten C-Cate-Fluss. Laden Sie die Filme mit den fluoreszierenden Kügelchen in das Bildverarbeitungsprogramm Image J.Verwenden Sie das MT-Track-J-Plugin, um die fluoreszierenden Kügelchen manuell entlang der Oberfläche des Trachealepithels zu verfolgen. Die Software berechnet die Geschwindigkeit und Richtungstendenz für jedes verfolgte Kügelchen. Achten Sie darauf, dass der Abstand zu den bewimperten Zilien die gemessene Strömungsstärke stark beeinflussen kann.In diesem Beispiel ist die Bewegung der Kügelchen an der Oberfläche der zilierten Zellen schnell und nimmt für weiter entfernt liegende Kügelchen im umgebenden Medium ab. Um dies zu berücksichtigen, sollten die Spuren der Kügelchen in allen Proben in einem festgelegten Abstand über dem cilierten Epithel gesammelt werden, um korrekte Vergleiche zu ermöglichen. Schließlich sollten die Kügelchen zur Bestimmung der Flüssigkeitsströmung so lange wie möglich verfolgt werden. Es ist vorzuziehen, Kügelchen zu verwenden, die mehr als 10 cilierte Zellen passieren, um diese Berechnungen durchzuführen.Mit dem beschriebenen Protokoll sollten die Atemwegsflimmerhärchen deutlich sichtbar sein und sich koordiniert bewegen. Ebenso sollte eine wahrnehmbare Strömung in Schlagrichtung erkennbar sein. In der Regel ermöglicht die Aufnahme von Hochgeschwindigkeits-DIC-Videos die Quantifizierung der C-Schlagfrequenz und liefert gute Bilder.Zur qualitativen Beurteilung der CLIA-Schlagform. Die Verfolgung fluoreszierender Kügelchen liefert eine Messung der durch CLIA erzeugten Strömungsgeschwindigkeit. Die Gerichtetheit wird berechnet, indem die gesamte Verschiebung eines fluoreszierenden Kügelchens durch die Länge der Spur des fluoreszierenden Kügelchens geteilt wird.Daher erhält eine geradlinige Bahn eine Punktzahl von eins, während ein gewundener Pfad einen viel niedrigeren Wert erhält. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Traches-Muskel vor dem Schneiden vollständig von sämtlichem umgebenden Bindegewebe und Fettgewebe zu befreien.Da das Einrollen des Traches-Muskels nach dem Durchtrennen für die Positionierung der Atem-CLIA zur idealen Visualisierung unerlässlich ist, können nach diesem Verfahren weitere Methoden wie pharmakologische Untersuchungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie oder warum pharmakologische Wirkstoffe die Aktivität der Atem-C modulieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Al Omran, A. J., et al. Live-Bildgebung der ependymalen Flimmerhärchen in den lateralen Ventrikeln des Mäusegehirns. J. vis. exp. (2015).  Dieses Video zeigt eine Live-Bildgebungstechnik, bei der die Differenzinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) verwendet wird, um das Schlagen von ependymalen Zilien in sagittalen Gehirnschnitten von Mäusen zu beobachten. Ependymale Zilien treiben Liquor cerebrospinalis (CSF) an, und ihre Aktivität wird in Gehirnschnitten aufgezeichnet, die in einem...

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