Name: Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Lernen Sie Recombineering zur Erzeugung homologer Rekombinationsvektoren in Drosophila. Diese Methode ermöglicht präzise Genmodifikationen und Protein-Tagging für funktionelle Genetikstudien.

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Wir möchten Hugo Bellen und Bloomington Stock Center für Reagenzien danken. Wir danken Koen weiter Venken, Hugo Bellen und alle Mitglieder der Buszczak und Hiesinger Labors für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health in ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) und MB (RO1GM086647), einen Zuschuss von der Cancer Prevention Research Institute of Texas in MB und PRH (RP100516) und der Welch unterstützt Foundation (I-1657), um PRH. MB ist ein EE und Greer Garson Fogelson Scholar in der biomedizinischen Forschung und PRH ist ein Eugene McDermott in Biomedical Research Scholar am UT Southwestern Medical Center.

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<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
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<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen in Bezug auf den hier skizzierten Techniken.

Die Macht der genetischen Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung wird weitgehend auf den verfügbaren Werkzeugen zur genetischen Manipulation basiert. Die kleinen Modelle C elegans und Drosophila insbesondere ermöglichen kostengünstige und schnelle molekulargenetische Analysen von kompletten Wege und Gen-Familien in vielzelligen Entwicklung oder Funktion gebracht. In den letzten Jahren bedeutende Fortschritte in der Entwicklung von Werkzeugen für die Manipulation von Genen in Drosophila<...

Reinigen molekular definierten Manipulationen einzelner Gene auf ihre endogenen Loci bieten ein unschätzbares Werkzeug, um eine Vielzahl von relevanten Fragen eukaryotischen Biologie zu studieren. Drosophila umkehren genetische Techniken zur Erzeugung von loss-of-function-Allele hatten nachweislich eine Herausforderung sein, bis Golic und Kollegen in eingeführt vivo Gen-Targeting mit homologe Rekombination Drosophila 1-3. Sie zeigten, dass spezifische Loci konnten gezielt mit einem linearen DNA-Fragment von einem integrierten transgenen Konstrukts werden. Diese lineare &quot;Donor&quot;-DNA wird in vivo durch FRT-vermittelte Rekombination (Verbrauchsteuerpflichtige die DNA aus dem Chromosom eines ringförmigen Moleküls) durch Linearisierung der Meganuclease I-SceI gefolgt erzeugt. Obwohl diese Methode wurde erfolgreich verwendet worden, um eine Vielzahl von definierten Läsionen zu erzeugen, ist die Technik nicht leicht skalierbar zur Manipulation zahlreicher Gene in parallel, weil jeder einzelnenDual-Knockout-Konstrukt erfordert deutliche und individuelles Design. Beispielsweise Schwierigkeiten nahtlos Umgang mit großen DNA-Fragmente (&gt; 5 kb) in vitro unter Verwendung klassischer Restriktionsenzym / Ligation Klonen oder PCR, sowie die Größe Einschränkungen herkömmlicher in vivo Transformationsvektoren oft die schnelle Entwicklung der homologen Rekombination gezielt beeinflussen Vektoren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, kombinierten wir die Rekombination / Transgenese P [Pacman]-System, das die Sub-Klonierung und Transgenese von bis zu 100 kb ermöglicht der DNA, wobei die Enden-out Gen-Targeting-Methoden, um eine effiziente und relativ schnelle Plattform zu etablieren, dass erleichtert Drosophila Gen-Targeting. Rekombination vermittelte Gentechnik (Rekombination) ist ein leistungsfähiges homologe Rekombination basierende Technologie des Klonens 4,5. Im Gegensatz zu herkömmlichen Restriktionsenzym / Ligase Klonen wird nicht durch Rekombination der Sequenz oder siz begrenzte der manipulierten DNA. Recombineering verwendet eine spezielle E. coli-Stamm, der Rekombination Maschinen durch eine defekte λ Prophagen 4 vorgesehen birgt. Diese Technik wurde kürzlich für den Einsatz in Drosophila 6,7 angenommen worden. Recombineering in Drosophila beruht auf einer modifizierten bedingt amplifizierbare bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Vektor genannt P [Pacman] 6,7. Dieser Vektor trägt zwei Replikationsstartpunkte: oriV, die hohe Kopienzahl produziert auf chemische Induktion für die Reinigung von großen Mengen an DNA für die Sequenzierung und Embryo-Einspritzung und Oris, die Low-Kopienzahl unterhält unter basalen Bedingungen erforderlich. Zusätzlich wird die P [Pacman] Vektor wird mit einer bakteriellen Befestigung (attB) Website ausgestattet. Die attB-Stelle dient als Substrat für ΦC31 Integrase-vermittelten Gentransfer, dass der Einbau von großen DNA-Fragmente können in eine vorbestimmte Landeplatz im Drosophila Genom 8,9. Wir haben ein P [Pacman] Vektor (bezeichnet als P [Pacman]-KO 1.0), die als Targeting-Vektor für Enden-out homologe Rekombination 10,11 verwendet werden können, erzeugt. Um übernehmen Enden-out-Gen-Targeting-Technologie in das System, haben wir zwei FRT und zwei I-SceI-Websites. Wir haben auch eine Gateway-Kassette in diesem modifizierten Vektor, um den Prozess der Einarbeitung der Homologie Arme in P [Pacman]-KO 1.0 straffen enthalten. Dies stellt eine schnelle und einfache Art und Weise nahezu jede genomischen Region von Interesse in den Targeting-Vektor einzuführen. In diesem Protokoll werden wir beschreiben, wie ein Targeting-Vektor mit P [Pacman]-KO 1.0, und wie man diesen Vektor in vivo mobilisieren, um die endogenen Locus gezielt konstruieren. Für die Zwecke dieses Protokolls verwenden wir den RFP / Kan-Kassette, ein Gen von Interesse zu ersetzen, sondern eine Vielzahl von Kassetten, die ein Antibiotikum Selektionsmarker enthalten, können mit diesem Protokoll verwendet werden. Wir haben entworfen und erfolgreich eingesetzt eine Reihe von Kassetten fürGen-Ersatz-und-Tagging 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 Rekombinations-kompetente Bakterien</td><td>NCI-Frederick-Rekombinationsbakterien</td><td>(SW102, SW105 und SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 Elektrocopmpetent E. coli</td><td>Epicenter</td><td>EC300110</td><td>Enthält CopyControl Induktionslösung</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Use Gateway BP ClonaseII Enzym Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak und Hiesinger Labs</td><td>Auf Anfrage</td><td></td></tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak und Hiesinger Labs</td><td>Upon Anfrage</td><td></td></tr><tr><td>Flystocks</td><td>Bloomington Lager Lager</td><td>Lagernummern: 25680, 25679</td><td>y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>Elektroporationsmaschine</td><td>Biorad GenePulser Xcell mit PC-Modul</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>Küvetten</td><td>der Marke Fisher</td><td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

recombineering homologen rekombination konstrukte in<em&gt; drosophila</em

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Die Weiterentwicklung von Techniken für schnelle, großflächige Manipulation der endogenen Genorte verbreitern den Einsatz von Drosophila melanogaster als genetischer Modellorganismus für menschliche Krankheiten Forschung. In den letzten Jahren haben technische Fortschritte wie die homologe Rekombination und Rekombination gesehen. Allerdings erzeugt eindeutige Null-Mutationen oder Tagging endogenen Proteinen bleibt ein erheblicher Aufwand für die meisten Gene. Hier beschreiben wir demonstrieren und Techniken für den Einsatz Recombineering-basierte Klonen Methoden, um Vektoren, die verwendet werden, um gezielt zu manipulieren und endogenen Loci in vivo zu generieren Insbesondere haben wir eine Kombination von drei Technologien etabliert:. (1) BAC Transgenese / Rekombination, ( 2) Enden-out homologen Rekombination und (3) Gateway-Technologie, um eine stabile, effiziente und flexible Verfahren zum Manipulieren endogenen genomischen Loci. In diesem Protokoll, bieten wir Ihnen Schritt-für-Schritt-Anweisungen, wie man (1) Design individual Vektoren, (2) wie man große Fragmente genomischer DNA in der homologen Rekombination mit Vektor Lücke Reparatur, und (3) wie zu ersetzen oder zu kennzeichnen Gene von Interesse innerhalb dieser Vektoren mit einem zweiten Runde der Rekombination klonen. Schließlich werden wir auch ein Protokoll, wie Sie diese Kassetten in vivo zu mobilisieren, um einen Knockout oder eine markierte Gen über Knock-in generieren. Diese Methoden können leicht für mehrere Ziele parallel angenommen werden und ein Mittel zur Manipulation der Drosophila-Genom in eine rechtzeitige und effiziente Art und Weise.

Verstärkung des LA und RA Homologie Arme sollten produzieren 500 bp Produkte und die PCR-Reaktion sollte SOE eine 1,0 kb Produkt (Abschnitte 2.1-2.4; Abbildung 2) zu erhalten. Die BP-Reaktion in Abschnitt 2.5 durchgeführt wird, ist in der Regel sehr effizient und bakterielle Transformation der Ausbeuten 5-100 Kolonien im Durchschnitt. Fast alle Kolonien mit PCR getestet überprüfen die erwartete PCR-Produkt. In der ersten Runde der Rekombination (§ 3) erwarten, 20-40 Kolonien...

Homologe Rekombination Techniken stark voranbringen<em&gt; Drosophila</em&gt; Genetik, indem sie die Erstellung von molekular genauen Mutationen. Die jüngste Verabschiedung Rekombination ermöglicht es, große Stücke von DNA manipulieren und transformieren sie in<em&gt; Drosophila</em<sup&gt; 6</sup&gt;. Die hier vorgestellten Methoden kombinieren diese Techniken, um schnell erzeugen große homologe Rekombination Vektoren.

Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, schnell große Vektoren für die homologe Rekombination herzustellen, die verwendet werden können, um endogene oph-Loci geziilt anzusteuern und zu verändern. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Back-Clone ausgewählt wird, der den gewünschten genomischen Bereich abdeckt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Homologiemerkmale in einen Vektor für die homologe Rekombination zu klonen.Der dritte Schritt besteht darin, genomische DNA mithilfe einer Lückenschließung in den Vektor für homologe Rekombination einzuklonen. Der letzte Schritt ist der Austausch des genomischen Bereichs durch die Targeting-Kassette. Letztendlich ermöglichen diese Verfahren die Konstruktion eines Targeting-Vektors für die Enzo-homologe Rekombination, um eindeutige Nullmutationen zu erzeugen oder endogene Proteine in Drosophila durch rekombinationsbasierte Techniken zu markieren.Außerdem enthält die schriftliche Arbeit auch ein Protokoll, wie diese Kassetten in vivo mobilisiert werden können, um mittels Knock-in ein Gen zu löschen oder zu markieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie problemlos parallel für mehrere Zielstrukturen angewendet werden kann und eine Möglichkeit bietet, das Oph-Genom zeitnah und effizient zu verändern. Um dieses Ziel zu erreichen, kombinieren unsere Methoden Rekombinations- und Gateway-Technologien, um die Vektoren für die homologe Rekombination zu erzeugen.Im Gegensatz zur herkömmlichen Beschränkung durch Restriktionsenzyme beim Ligase-Klonieren sind diese Technologien nicht durch die Größe oder Sequenz der DNA begrenzt, was den Klonierungsprozess erheblich erleichtert. Obwohl dieses Protokoll eine Methode zur Erzeugung einer Targeting-Kassette für einen Gen-Knockout beschreibt, kann es ebenso verwendet werden, um praktisch jeden endogenen Locus auf beliebige Weise zu verändern. Dazu gehört das Markieren eines Gens der Wahl, das Ersetzen eines Gens der Wahl durch GAL4 oder die Erzeugung von Protein-Verkürzungs- oder Reporteralinien, um ein Rückkreuz mit dem Gen der Wahl zu erhalten, welches CG32095 ist.Öffnen Sie in diesem Beispiel eine Suche nach dem Gen@flybased.org. Rufen Sie die Liste der Rückstände ab. Suchen Sie im Abschnitt „Bestände und Reagenzien“ und überprüfen Sie den Abschnitt mit dem Titel genomische Klone.Suchen Sie unter den verfügbaren Optionen einen Klon, der mindestens 10 Kilobasen upstream und fünf Kilobasen downstream des interessierenden Gens umfasst. Diese Bereiche werden als Homologiearme verwendet. Dies kann durch Ausrichtung der Sequenzen des 5'-Endes und des 3'-Endes des Rückgrats mit dem Drosophila-Genom erfolgen.Alternativ können Klone im Pac-Man-Vektor auch unter pacmanfly.org gefunden werden. Wählen Sie nun Primer aus, um die 500 Basenpaare am Ende jedes der Homologiearme zu amplifizieren. Diese Fragmente, bezeichnet als LA und RA, werden verwendet, um den genomischen Bereich zwischen den Homologiearmen in den Pacman einzubringen.KO 1,0-Plasmid. Stellen Sie sicher, dass die 500 Basen langen Homologe-Arme keine BAM H1-Restriktionsstellen enthalten, da diese zum Linearisieren des Plasmids gespalten werden. Richten Sie zwei separate PCR-Ansätze ein, um die LA- und die RA-Fragmente zu amplifizieren. Für das LA-Fragment verwenden Sie einen Vorwärtsprimer und integrieren die TTV1- und ISC1-Sequenzen in den Rückwärtsprimer.Integrieren Sie AB MH eine Bindungsstelle sieben Basen drei-primär zur komplementären Sequenz, die dem entgegengesetzten Homologiearm entspricht. Für das RA-Fragment schließen Sie AB MH eine Bindungsstelle sieben Basen drei-primär zur komplementären Sequenz, die dem entgegengesetzten Arm entspricht, in den Vorwärtsprimer sowie die at TB zwei- und I sce E eins-Sequenzen in den Rückwärtsprimer als Vorlage ein. Verwenden Sie ein Mikroliter Back-DNA aus einer unzureichend gereinigten Minipräparation oder ein halbes Mikroliter Back-Bakterien, die über Nacht kultiviert und in diesem und allen nachfolgenden PCR-Ansätzen erhitzt wurden.Stellen Sie sicher, dass eine DNA-Polymerase mit Proofreading-Fähigkeit verwendet wird. Dies ist jedoch für die PCR-Überprüfungen nicht erforderlich. Führen Sie die PCR-Proben auf einem 1%igen Agarosegel durch und isolieren Sie die Produkte mithilfe eines XMO Clean DNA Recovery-Kits.Eluieren Sie die DNA mit 10 Mikrolitern sterilem Wasser. Verwenden Sie anschließend 10 bis 30 Nanogramm von jeder amplifizierten DNA und führen Sie eine Verknüpfung mittels Überlappungsverlängerungs-PCR durch.Dabei werden normalerweise etwa ein Zwanzigstel der gereinigten PCR-Produkte verwendet. Nun mittels einer BP-Reaktion gemäß Herstellervorschrift das LARA-gekoppelte Fragment in das Pacman-KA-Plasmid klonen. Dieses Plasmid kann beim Boost Truck Lab angefordert werden. Inokulieren Sie SW102-Zellen, die das gewünschte Genomfragment enthalten, in vier Milliliter LB-Medium mit dem geeigneten Selektionsantibiotikum, in diesem Fall 25 Mikrogramm pro Milliliter.Chloramphenicol: Kultivieren Sie die Kultur über Nacht bei 32 Grad Celsius und 250 U/min. Achten Sie darauf, dass die Temperatur 32 Grad Celsius nicht überschreitet, da sonst am folgenden Tag die Rekombinationsmaschinerie der Zellen aktiviert wird. Verdauen Sie 0,4 Mikrogramm des Pac-Man-KO, das das LA und RA enthält, mit etwa 20 Einheiten Bmh.Eine in einem 25-Mikroliter-Reaktionsansatz bei 37 Grad Celsius. Führen Sie eine lange Reaktion von mindestens drei Stunden durch, da dies entscheidend für die Eliminierung von Falschpositiven ist. Inokulieren Sie anschließend ein Milliliter der gesättigten SW-1-0-2-Stammsuspension in 44 Milliliter LB mit Chloramphenicol.Züchten Sie es bei 32 Grad Celsius unter Schütteln auf einen OD 600 von 0,2 bis 0,3, was gewöhnlich zwischen 60 und 90 Minuten dauert. Beginnen Sie außerdem eine parallele Kultur als Nicht-Hitzeschock-Kontrolle. Das Auftreten vieler Kolonien auf dieser Kontrolle deutet gewöhnlich auf eine Transformation mit undigestedem Plasmid hin.Während die Kultur wächst, führen Sie das mit BAM H1 geschnittene Plasmid auf einem Gel durch, extrahieren anschließend das Gel und verdünnen die DNA in 10 Mikrolitern erwärmtem Wasser, aber auf keinen Fall in Puffer. Bei Temperaturen bis zu 55 Grad Celsius können Salze und Puffer stören.Die Elektroporation führt dazu, dass die Kultur im Wasserbad genau 15 Minuten lang einer Hitzeschockbehandlung bei 42 Grad Celsius unterzogen wird, während die Kontrollkultur ohne Hitzeschock bei 32 Grad gehalten wird. Anschließend beide Kulturen unverzüglich in gekühlte 50-Milliliter-Konischgefäße überführen und fünf Minuten in einer Eiswasserschlamm-Mischung ruhen lassen. Es ist entscheidend für die Kompetenz der Zellen, diese bei niedrigen Temperaturen zu halten.Resuspendieren Sie die Zellen niemals durch wiederholtes Pipettieren oder Vortexen. Zentrifugieren Sie nun die Kulturen, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet in eiskaltem 10 % Glycerin; fügen Sie zunächst fünf Milliliter Glycerin hinzu. Als nächstes resuspendieren.Suspendieren Sie die Zellen durch Vorsichtiges Antippen und Schwenken und geben Sie anschließend weitere 20 Milliliter Glycerin hinzu. Wiederholen Sie die Zentrifugation und die Resuspendierung in 10 % Glycerin noch zweimal, und zentrifugieren Sie die Zellen danach ein letztes Mal. Zu diesem Zeitpunkt kann der Zellpellet sehr locker sein; beim Entsorgen des Überstandes ist daher Vorsicht geboten.Suspendieren Sie das Pellet nun in einem Milliliter kaltem, 10 %igem Glycerin und überführen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen 30 Sekunden lang bei 12.000 ×g und 4 °C und entfernen Sie das meiste Überstand, wobei etwa 90 Mikroliter der Zellen in Glycerin zurückbleiben. An diesem Punkt können die Zellen bei −80 °C aufbewahrt werden.Dies kann jedoch ihre Kompetenz verringern. Geben Sie nun zwei Mikroliter oder 50 Nanogramm des mit BAM H1 gespaltenen Plasmids zu den Zellen hinzu und mischen Sie sie vorsichtig mit einer Pipettenspitze. Überführen Sie das Gemisch in eine Elektroporationsküvette mit einem Abstand von einem Millimeter, und elektroporieren Sie die Zellen.Fügen Sie anschließend 300 Mikroliter SOC hinzu und lassen Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 32 Grad Celsius ohne Schütteln regenerieren. Nach der Regenerationsphase impfen Sie die Zellen auf LB-Agar mit 50 Mikrogramm Ampicillin pro Milliliter Lösung aus. Inkubieren Sie die Zellen dann am nächsten Tag bei 32 Grad Celsius für 24 bis 30 Stunden.Screenen Sie mithilfe der PCR nach korrekten Gap-Reparaturkolonien. Verwenden Sie die Primer T drei und RA check für das RA-Fragment sowie die Primer T sieben und LA check. Für das LA-Fragment ist es entscheidend, beide Arme zu testen, da manchmal die Integration eines Arms ohne den anderen beobachtet wird.Die Check-Primer müssen 100 bis 200 Basenpaare in Richtung des Zielbereichs hin entworfen werden. Falls nachfolgende Schritte fehlschlagen, können diese Primer mit benachbarten Primern und dem ursprünglichen Back-Primer als Vorlage validiert werden. Die positiven Kolonien aus der PCR zeigen ein Band, das bei 800 bis 1000 Basenpaaren läuft.Züchten Sie die positiven Kolonien über Nacht bei 32 Grad Celsius in vier Millilitern Medium mit Ampicillin; ein gefrorener Stamm dieser Zellen kann für die spätere Verwendung angelegt werden. Beginnen Sie damit, die RFP-Knockout-Kassette mittels der geeigneten Primer aus dem linearisierten Plasmid zu amplifizieren. Reinigen Sie danach das Produkt über ein Gel und lösen Sie es in 20 Mikrolitern sterilen Wassers auf.Das RFP-Kassettenplasmid inklusive der Homologiemerkmale sollte etwa drei Kilobasenpaare lang sein. Inokulieren Sie ein Milliliter der gesättigten SW102 Pac-Man-KO-Kultur in 44 Milliliter LB-Medium mit Ampicillin. Inkubieren Sie die Kultur bei 32 Grad Celsius im Schüttelinkubator, bis eine OD600 von 0,2 bis 0,3 erreicht ist.Schließen Sie außerdem eine identische Probe für die negative Kontrolle ohne Hitzeschock ein. Nachdem die Kulturen die gewünschte Dichte erreicht haben, reinigen Sie sie zur Elektroporation wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Elektroporieren Sie anschließend etwa 100 Nanogramm der Targeting-Kassette in 90 Mikroliter elektrokompententer Zellen mit der zuvor beschriebenen Methode.Nachdem sich die Zellen zwei Stunden lang erholt haben, werden sie auf LB-Agar mit Ampicillin und Kanamycin ausplattiert und die Platten für 24 bis 30 Stunden bei 32 Grad Celsius inkubiert. Am nächsten Tag bereiten Sie 5-Milliliter-Kulturen aus fünf verschiedenen Kolonien zu und lassen diese über Nacht bei 32 Grad Celsius wachsen. Am folgenden Morgen führen Sie eine grobe Mini-Präp durch und laufen die Hälfte der gewonnenen DNA auf einem 1%-Agarosegel, um das Vorhandensein eines Plasmids mit niedrigem Molekulargewicht zu überprüfen.Es sollte kein Plasmid vorhanden sein, das unterhalb von 12 Kilobasen läuft, wie in Band zwei dieses Gels zu sehen ist. Stellen Sie nun eine 1:500-Verdünnung der DNA aus einem positiven Klon her und verwenden Sie ein Mikroliter der verdünnten DNA, um in 50 Mikroliter Tmax epi 300 Zellen zu transformieren. Platten Sie die regenerierten epi 300 Zellen auf LB-Agar mit Ampicillin und Kanamycin und inkubieren Sie sie 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag impfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 Milliliter LB plus Antibiotika an und kultivieren sie über Nacht. Am nächsten Morgen säen Sie aus der gesättigten Kultur 100 Milliliter LB an.Fügen Sie die geeigneten Antibiotika hinzu und geben Sie 100 Mikroliter der 1000× Copy-Control-Lösung zu. Inkubieren Sie die Kultur am selben Tag später für fünf bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Führen Sie eine Maxi-Präparation durch und überprüfen Sie durch Sequenzierung die korrekte Insertion des Kassettenkonstrukts an der richtigen Stelle.Entwerfen und führen Sie nun einen Restriktionsenzymverdauungs-Test unter Verwendung eines Klons mit korrekten Sequenzierungsresultaten durch, um den Kombier-Vektor zu charakterisieren. In diesem Beispiel wurde der CG 3 2 0 9 5 Zielvektor nacheinander mit PAC one, ASC one, BH one und A T two verdaut. Das Auftreten sämtlicher vorhergesagter Banden sowie das Fehlen jeglicher inkorrekter Banden bestätigt, dass der Zielvektor korrekt kombiert wurde.Der Vektor kann nun in Fliegen transformiert werden. Fliegen, die Rekombinase exprimieren, können aus ihrem Nachwuchs ausgewählt werden. Beachten Sie, dass große Vektoren anfällig für Scherkräfte sind.Wir vermeiden Einfrier- und Auftauzyklen und stellen die DNA frisch für die Injektion her. Die resultierenden transgenen Fliegen enthalten das Targeting-Konstrukt an einer vordefinierten Landestelle, jedoch noch nicht im endogenen Locus des Genoms. Der letzte Schritt, bei dem der endogene Locus ersetzt wird, erfordert keine weiteren molekularbiologischen Methoden, sondern lediglich publizierte Standardmethoden an Drosophila, die eine durch Hitzeschock vermittelte Mobilisierung des Targeting-Kassetten und ein Fliegen-Screening auf die erneute Integration der Targeting-Kassette weg von der ursprünglichen Landestelle umfassen.Diese Methoden werden in aktuellen Veröffentlichungen beschrieben. Die Amplifikation der homologen Arme LA und RA sollte Produkte mit einer Länge von 500 Basenpaaren ergeben, und die P-C-R-S-O-E-Reaktion sollte ein Produkt von einem Kilobase ergeben. Die BP-Reaktion ist typischerweise sehr effizient.Die bakterielle Transformation des Produkts ergibt normalerweise fünf bis 100 Kolonien. Fast alle Kolonien, die mittels PCR-Überprüfung getestet wurden, zeigen das erwartete Produkt während der ersten Wiederherstellungsrunde. Erwarten Sie nach der Transformation des digerierten Pacman KO 1.0, das die LA- und RA-Arme enthält, in SW102-Zellen, die das Gen der Interesse enthalten, 20 bis 40 Kolonien. 40 bis 60 % dieser Klone tragen das gewünschte Rekombinationsprodukt.In diesem Beispiel wurden etwa 60 Kolonien erhalten, und die PCR-Überprüfung zeigte, dass etwa 60 % der Kolonien das gewünschte Rekombinationsprodukt trugen. Die zweite Runde der Rekombination ist in der Regel deutlich effizienter. Normalerweise werden drei bis 50 Kolonien nach der Transformation beobachtet, wobei 90 bis 95 % den gewünschten Konstrukt tragen. Plasmide mit einer Größe unterhalb von 12 Kilobasen weisen falsch positive Kolonien wie zum Beispiel Klon zwei aus.In diesem Beispiel ist es wichtig zu beachten, dass die Rekombination großer DNA-Fragmente in Bakterien sehr ineffizient ist. Daher ist es entscheidend, hochwertige kompetente Zellen herzustellen und frische DNA zu verwenden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man einen Targeting-Vektor für eine homologe Rekombination mittels N out in Drosophila erstellt. Dieser Vektor könnte verwendet werden, um beliebige saubere, molekular genau definierte Veränderungen einzelner Gene an ihren endogenen Loci herbeizuführen.

recombineering-homologous-recombination-constructs-in-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

In diesem Video beschreiben wir die Southern-Blotting-Technik zur Identifizierung homologer Rekombinationsereignisse im Genom embryonaler Stammzellen von Mäusen mit Hilfe von radioaktiv markierten Sonden. DNA-Regionen, die homologe Rekombinationsereignisse enthalten, erscheinen als unterschiedliche Banden, wenn die Membran, die die sondengebundene DNA enthält, Röntgenstrahlen ausgesetzt wird.

Southern-Blot zum Nachweis homologer Rekombination im Genom embryonaler Stammzellen der Maus

Gen-Targeting-Methoden können verwendet werden, um transgene Mäuse mit Knockout-, Knock-in- und getaggten Allelen zu erzeugen.  Hier beschreiben wir eine verbesserte Methode der Rekombination in E. coli, die wir als "Subklonierung plus Insertion" bezeichnen und die zur schnellen Generierung benutzerdefinierter Gen-Targeting-Vektoren verwendet werden kann.

Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila der erste kodierende Exon Gene durch Transkription Treiber ersetzen. CRISPR/Cas9-basierte Methode stellt eine transaktivator Sequenz der endogenen Verordnung eines Gens ersetzt und somit erleichtert Transctivator Ausdruck ausschließlich im Gen-spezifischen räumlich-zeitliche Muster.

Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern blotting und/oder PCR. Diese Methode ist durch die Generierung von Nonmuscle Myosin II genetische Ersatz Mausmodellen mit traditionellen embryonalen Stammzell-basierte homologe Rekombination-vermittelten targeting-Technologie veranschaulicht.

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Ziel dieses Protokolls ist es, das Design und die Leistung von In-vivo-Experimenten in Drosophila melanogaster zu skizzieren, um die funktionellen Folgen seltener Genvarianten im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu bewerten.

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein optimiertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen vor, ein entscheidender Schritt für die Entstehung transgener Fliegen.

Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila

Wolbachia Bakterielle Infektion in Drosophila

Lernen Sie Recombineering zur Erzeugung homologer Rekombinationsvektoren in Drosophila. Diese Methode ermöglicht präzise Genmodifikationen und Protein-Tagging für funktionelle Genetikstudien.

Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in

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