Name: Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Lernen Sie Recombineering zur Erzeugung homologer Rekombinationsvektoren in Drosophila. Diese Methode ermöglicht präzise Genmodifikationen und Protein-Tagging für funktionelle Genetikstudien.

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Wir möchten Hugo Bellen und Bloomington Stock Center für Reagenzien danken. Wir danken Koen weiter Venken, Hugo Bellen und alle Mitglieder der Buszczak und Hiesinger Labors für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health in ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) und MB (RO1GM086647), einen Zuschuss von der Cancer Prevention Research Institute of Texas in MB und PRH (RP100516) und der Welch unterstützt Foundation (I-1657), um PRH. MB ist ein EE und Greer Garson Fogelson Scholar in der biomedizinischen Forschung und PRH ist ein Eugene McDermott in Biomedical Research Scholar am UT Southwestern Medical Center.

<ol><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li>
<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li>
<li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ends-out%2C+or+replacement%2C+gene+targeting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
<li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5Bacman%5D%3A+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li>
<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+P%5Bacman%5D+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen in Bezug auf den hier skizzierten Techniken.

Die Macht der genetischen Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung wird weitgehend auf den verfügbaren Werkzeugen zur genetischen Manipulation basiert. Die kleinen Modelle C elegans und Drosophila insbesondere ermöglichen kostengünstige und schnelle molekulargenetische Analysen von kompletten Wege und Gen-Familien in vielzelligen Entwicklung oder Funktion gebracht. In den letzten Jahren bedeutende Fortschritte in der Entwicklung von Werkzeugen für die Manipulation von Genen in Drosophila<...

Reinigen molekular definierten Manipulationen einzelner Gene auf ihre endogenen Loci bieten ein unschätzbares Werkzeug, um eine Vielzahl von relevanten Fragen eukaryotischen Biologie zu studieren. Drosophila umkehren genetische Techniken zur Erzeugung von loss-of-function-Allele hatten nachweislich eine Herausforderung sein, bis Golic und Kollegen in eingeführt vivo Gen-Targeting mit homologe Rekombination Drosophila 1-3. Sie zeigten, dass spezifische Loci konnten gezielt mit einem linearen DNA-Fragment von einem integrierten transgenen Konstrukts werden. Diese lineare &quot;Donor&quot;-DNA wird in vivo durch FRT-vermittelte Rekombination (Verbrauchsteuerpflichtige die DNA aus dem Chromosom eines ringförmigen Moleküls) durch Linearisierung der Meganuclease I-SceI gefolgt erzeugt. Obwohl diese Methode wurde erfolgreich verwendet worden, um eine Vielzahl von definierten Läsionen zu erzeugen, ist die Technik nicht leicht skalierbar zur Manipulation zahlreicher Gene in parallel, weil jeder einzelnenDual-Knockout-Konstrukt erfordert deutliche und individuelles Design. Beispielsweise Schwierigkeiten nahtlos Umgang mit großen DNA-Fragmente (&gt; 5 kb) in vitro unter Verwendung klassischer Restriktionsenzym / Ligation Klonen oder PCR, sowie die Größe Einschränkungen herkömmlicher in vivo Transformationsvektoren oft die schnelle Entwicklung der homologen Rekombination gezielt beeinflussen Vektoren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, kombinierten wir die Rekombination / Transgenese P [Pacman]-System, das die Sub-Klonierung und Transgenese von bis zu 100 kb ermöglicht der DNA, wobei die Enden-out Gen-Targeting-Methoden, um eine effiziente und relativ schnelle Plattform zu etablieren, dass erleichtert Drosophila Gen-Targeting. Rekombination vermittelte Gentechnik (Rekombination) ist ein leistungsfähiges homologe Rekombination basierende Technologie des Klonens 4,5. Im Gegensatz zu herkömmlichen Restriktionsenzym / Ligase Klonen wird nicht durch Rekombination der Sequenz oder siz begrenzte der manipulierten DNA. Recombineering verwendet eine spezielle E. coli-Stamm, der Rekombination Maschinen durch eine defekte λ Prophagen 4 vorgesehen birgt. Diese Technik wurde kürzlich für den Einsatz in Drosophila 6,7 angenommen worden. Recombineering in Drosophila beruht auf einer modifizierten bedingt amplifizierbare bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Vektor genannt P [Pacman] 6,7. Dieser Vektor trägt zwei Replikationsstartpunkte: oriV, die hohe Kopienzahl produziert auf chemische Induktion für die Reinigung von großen Mengen an DNA für die Sequenzierung und Embryo-Einspritzung und Oris, die Low-Kopienzahl unterhält unter basalen Bedingungen erforderlich. Zusätzlich wird die P [Pacman] Vektor wird mit einer bakteriellen Befestigung (attB) Website ausgestattet. Die attB-Stelle dient als Substrat für ΦC31 Integrase-vermittelten Gentransfer, dass der Einbau von großen DNA-Fragmente können in eine vorbestimmte Landeplatz im Drosophila Genom 8,9. Wir haben ein P [Pacman] Vektor (bezeichnet als P [Pacman]-KO 1.0), die als Targeting-Vektor für Enden-out homologe Rekombination 10,11 verwendet werden können, erzeugt. Um übernehmen Enden-out-Gen-Targeting-Technologie in das System, haben wir zwei FRT und zwei I-SceI-Websites. Wir haben auch eine Gateway-Kassette in diesem modifizierten Vektor, um den Prozess der Einarbeitung der Homologie Arme in P [Pacman]-KO 1.0 straffen enthalten. Dies stellt eine schnelle und einfache Art und Weise nahezu jede genomischen Region von Interesse in den Targeting-Vektor einzuführen. In diesem Protokoll werden wir beschreiben, wie ein Targeting-Vektor mit P [Pacman]-KO 1.0, und wie man diesen Vektor in vivo mobilisieren, um die endogenen Locus gezielt konstruieren. Für die Zwecke dieses Protokolls verwenden wir den RFP / Kan-Kassette, ein Gen von Interesse zu ersetzen, sondern eine Vielzahl von Kassetten, die ein Antibiotikum Selektionsmarker enthalten, können mit diesem Protokoll verwendet werden. Wir haben entworfen und erfolgreich eingesetzt eine Reihe von Kassetten fürGen-Ersatz-und-Tagging 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 Rekombinations-kompetente Bakterien</td><td>NCI-Frederick-Rekombinationsbakterien</td><td>(SW102, SW105 und SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 Elektrocopmpetent E. coli</td><td>Epicenter</td><td>EC300110</td><td>Enthält CopyControl Induktionslösung</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Use Gateway BP ClonaseII Enzym Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak und Hiesinger Labs</td><td>Auf Anfrage</td><td></td></tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak und Hiesinger Labs</td><td>Upon Anfrage</td><td></td></tr><tr><td>Flystocks</td><td>Bloomington Lager Lager</td><td>Lagernummern: 25680, 25679</td><td>y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>Elektroporationsmaschine</td><td>Biorad GenePulser Xcell mit PC-Modul</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>Küvetten</td><td>der Marke Fisher</td><td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

recombineering homologen rekombination konstrukte in<em&gt; drosophila</em

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Die Weiterentwicklung von Techniken für schnelle, großflächige Manipulation der endogenen Genorte verbreitern den Einsatz von Drosophila melanogaster als genetischer Modellorganismus für menschliche Krankheiten Forschung. In den letzten Jahren haben technische Fortschritte wie die homologe Rekombination und Rekombination gesehen. Allerdings erzeugt eindeutige Null-Mutationen oder Tagging endogenen Proteinen bleibt ein erheblicher Aufwand für die meisten Gene. Hier beschreiben wir demonstrieren und Techniken für den Einsatz Recombineering-basierte Klonen Methoden, um Vektoren, die verwendet werden, um gezielt zu manipulieren und endogenen Loci in vivo zu generieren Insbesondere haben wir eine Kombination von drei Technologien etabliert:. (1) BAC Transgenese / Rekombination, ( 2) Enden-out homologen Rekombination und (3) Gateway-Technologie, um eine stabile, effiziente und flexible Verfahren zum Manipulieren endogenen genomischen Loci. In diesem Protokoll, bieten wir Ihnen Schritt-für-Schritt-Anweisungen, wie man (1) Design individual Vektoren, (2) wie man große Fragmente genomischer DNA in der homologen Rekombination mit Vektor Lücke Reparatur, und (3) wie zu ersetzen oder zu kennzeichnen Gene von Interesse innerhalb dieser Vektoren mit einem zweiten Runde der Rekombination klonen. Schließlich werden wir auch ein Protokoll, wie Sie diese Kassetten in vivo zu mobilisieren, um einen Knockout oder eine markierte Gen über Knock-in generieren. Diese Methoden können leicht für mehrere Ziele parallel angenommen werden und ein Mittel zur Manipulation der Drosophila-Genom in eine rechtzeitige und effiziente Art und Weise.

Verstärkung des LA und RA Homologie Arme sollten produzieren 500 bp Produkte und die PCR-Reaktion sollte SOE eine 1,0 kb Produkt (Abschnitte 2.1-2.4; Abbildung 2) zu erhalten. Die BP-Reaktion in Abschnitt 2.5 durchgeführt wird, ist in der Regel sehr effizient und bakterielle Transformation der Ausbeuten 5-100 Kolonien im Durchschnitt. Fast alle Kolonien mit PCR getestet überprüfen die erwartete PCR-Produkt. In der ersten Runde der Rekombination (§ 3) erwarten, 20-40 Kolonien...

Homologe Rekombination Techniken stark voranbringen<em&gt; Drosophila</em&gt; Genetik, indem sie die Erstellung von molekular genauen Mutationen. Die jüngste Verabschiedung Rekombination ermöglicht es, große Stücke von DNA manipulieren und transformieren sie in<em&gt; Drosophila</em<sup&gt; 6</sup&gt;. Die hier vorgestellten Methoden kombinieren diese Techniken, um schnell erzeugen große homologe Rekombination Vektoren.

Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, schnell große Vektoren für die homologe Rekombination herzustellen, die verwendet werden können, um endogene oph-Loci geziilt anzusteuern und zu verändern. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Back-Clone ausgewählt wird, der den gewünschten genomischen Bereich abdeckt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Homologiemerkmale in einen Vektor für die homologe Rekombination zu klonen.Der dritte Schritt besteht darin, genomische DNA mithilfe einer Lückenschließung in den Vektor für homologe Rekombination einzuklonen. Der letzte Schritt ist der Austausch des genomischen Bereichs durch die Targeting-Kassette. Letztendlich ermöglichen diese Verfahren die Konstruktion eines Targeting-Vektors für die Enzo-homologe Rekombination, um eindeutige Nullmutationen zu erzeugen oder endogene Proteine in Drosophila durch rekombinationsbasierte Techniken zu markieren.Außerdem enthält die schriftliche Arbeit auch ein Protokoll, wie diese Kassetten in vivo mobilisiert werden können, um mittels Knock-in ein Gen zu löschen oder zu markieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie problemlos pa

recombineering-homologous-recombination-constructs-in-drosophila

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Biology

Biologie

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

In diesem Video beschreiben wir die Southern-Blotting-Technik zur Identifizierung homologer Rekombinationsereignisse im Genom embryonaler Stammzellen von Mäusen mit Hilfe von radioaktiv markierten Sonden. DNA-Regionen, die homologe Rekombinationsereignisse enthalten, erscheinen als unterschiedliche Banden, wenn die Membran, die die sondengebundene DNA enthält, Röntgenstrahlen ausgesetzt wird.

Southern-Blot zum Nachweis homologer Rekombination im Genom embryonaler Stammzellen der Maus

Gen-Targeting-Methoden können verwendet werden, um transgene Mäuse mit Knockout-, Knock-in- und getaggten Allelen zu erzeugen.  Hier beschreiben wir eine verbesserte Methode der Rekombination in E. coli, die wir als "Subklonierung plus Insertion" bezeichnen und die zur schnellen Generierung benutzerdefinierter Gen-Targeting-Vektoren verwendet werden kann.

Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila der erste kodierende Exon Gene durch Transkription Treiber ersetzen. CRISPR/Cas9-basierte Methode stellt eine transaktivator Sequenz der endogenen Verordnung eines Gens ersetzt und somit erleichtert Transctivator Ausdruck ausschließlich im Gen-spezifischen räumlich-zeitliche Muster.

Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern blotting und/oder PCR. Diese Methode ist durch die Generierung von Nonmuscle Myosin II genetische Ersatz Mausmodellen mit traditionellen embryonalen Stammzell-basierte homologe Rekombination-vermittelten targeting-Technologie veranschaulicht.

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Ziel dieses Protokolls ist es, das Design und die Leistung von In-vivo-Experimenten in Drosophila melanogaster zu skizzieren, um die funktionellen Folgen seltener Genvarianten im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu bewerten.

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein optimiertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen vor, ein entscheidender Schritt für die Entstehung transgener Fliegen.

Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila

Wolbachia Bakterielle Infektion in Drosophila

Lernen Sie Recombineering zur Erzeugung homologer Rekombinationsvektoren in Drosophila. Diese Methode ermöglicht präzise Genmodifikationen und Protein-Tagging für funktionelle Genetikstudien.

Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in

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