Name: Hochdurchsatz-, Automated Extraktion von DNA und RNA aus klinischen Proben mit TruTip Technologie Gemeinsames Liquid Handling Robots (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Lernen Sie die automatisierte DNA-Extraktion aus Vollblut mit TruTip-Technologie und dem Hamilton Star Liquid Handling Workstation. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige, kontaminationsfreie Isolierung genomischer DNA für klinische Anwendungen.

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Teile dieser Arbeit wurden durch die National Institutes of Health (NIH) unter dem Förderkennzeichen 44 R AI072784 unterstützt. Wir danken Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson und Amy Dean des Labors für Viruskrankheiten, Wadsworth Center in New York State Dept of Health für quantifiziert Influenza-Virionen und Zugang zu klinisch validiert Influenza Echtzeit PCR-Assays.

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Die Autoren sind Mitarbeiter von Akonni Biosystems, Inc., die Materialien, die in diesem Artikel verwendet zu produzieren. Freier Zugang und Produktion dieses Artikels wird durch Akonni Biosystems, Inc. gesponsert

Die Einfachheit des TruTip Konzept und Workflow (Abbildung 1) machen es leicht angepasst, automatisierte, effiziente und effektive für eine Reihe von klinischen Probenmatrices, Eingang Probenvolumina und Liquid-Handling-Systeme. Es sollte jedoch erkannt werden, dass jede klinische Probe einzigartig ist, und eine mit der nächsten in der Viskosität, Partikel, Schleim, Oberflächenverunreinigungen, mikrobiellen und / oder menschlichen genetischen Hintergründen variieren. Angesichts erwarteten Variationen in der klinischen Probe Zusammensetzung und Verwendungen von einer automatisierten Probenvorbereitung TruTip Protokoll, kann es daher notwendig sein, bestimmte Schritte in einer TruTip Verfahren zu modifizieren, um die gewünschten Ergebnisse für eine bestimmte Art Probe zu erreichen. Unabhängig von der Art der Probe enthalten jedoch TruTip Parameter, die haben in der Regel den größten Einfluss auf Nukleinsäure Reinheit und / oder Verwertung: <ol><li> Beispiel Mischen und Homogenisieren mit Lysepuffer (und Alkohol). Während TruTips eine erneute habenlativ große Porengröße Probenhomogenisierung und Verflüssigung ist sehr wichtig für eine effiziente Lyse und nachfolgende Bindung Schritte zum TruTip Monolith. Mit einer homogenen und gut Flüssiggas Lysat können Proben durch die TruTip mit höheren Flussraten, die die gesamte Probe Bearbeitungszeit reduziert bewegen. Das große Volumen Plasma-Protokoll zeigt das Potenzial für die Nutzer, um gründlich zu homogenisieren und zu verflüssigen schwierigen Proben (on-line oder off-line), trotz der großen Eingang Probenvolumen. </li><li> Flussraten. Langsamer Flussraten während Nukleinsäurebindung oder Elution der Regel in höheren Ausbeuten führen Nukleinsäure, wenn auch auf Kosten der gesamten Bearbeitungszeit. Langsamer Strömungsgeschwindigkeiten kann auch die Ausdehnung der DNA Scherung. </li><li> Zyklus-Nummern. Die optimale Anzahl der Aspiration und verzichten Zyklen abhängig ist Probe Typ, total Probenvolumen und Strömungsgeschwindigkeiten. Schritt 1 in 1 ist typischerweise der Punkt, an dem Zyklus numbers (und Strömungsgeschwindigkeiten) kann einige empirische Optimierung, mit Proben wie Nasen-Rachen absaugen (Abb. 5), die eine der schwierigeren Lysate auf Grund des Angebotes von NPA Viskositäten von verschiedenen Patienten zu optimieren. </li><li> Trocknen. Vollständige Trocknung der TruTip Monolith ist zwingend notwendig, um das restliche organische Lösungsmittel aus co-eluiert mit der gereinigten Nukleinsäure-Probe und hemmende Folgeprozesse oder Tests zu verhindern. Da TruTip nicht über Zentrifugieren oder Vakuumfiltration getrocknet, ist es wichtig, sowohl die Strömungsgeschwindigkeit und Taktzahlen während der Trocknungsstufe zu maximieren. Manchmal gibt es ein Restrisiko Tropfen Waschlösung auf der Endstation der TruTip nach der Trocknung Zyklen abgeschlossen sind. Die Hamilton Roboter hat die Fähigkeit, eine &quot;Tip Touch&quot; auf der Seite der Vertiefung, um die Tröpfchen Freilegung, wodurch eine lösungsmittelfreie Elution. Die epMotion System nicht über diese Funktion, sondern eine der TruTip Terminus in el Vorspülenution Puffers programmiert ist, den gleichen Effekt zu erzielen. </li></ol> Da die Geometrie Pipettenspitze Material und Befestigungsart der Roboter-Arm-Kanal einzigartig für jedes Instrument Hersteller sind, ist eine andere TruTip Konstrukt für jede Liquid-Handling-System erforderlich. Die TruTip Monolith Abmessungen (Durchmesser, Dicke und Porengröße) haben mit Nukleinsäure-bindende Kapazität (und Elution Wirkungsgrade) korrelieren, ist wie bei jedem Festphasenextraktion Technik erwartet. Während dicke (&gt; 4 mm) Matrizen zu einer 1 ml TruTip auf Nukleinsäure-bindende Kapazität für großvolumige Proben zu erhöhen und / oder die Bindung auszugleichen Kapazität über spezifische TruTip Formate eingebettet sein kann, gibt es einen Kompromiss zwischen TruTip Dicke und Flussraten während die anfängliche Bindung Schritt (in Gegenwart von Rohlysaten). Daher ist es manchmal vorteilhaft, größeren Durchmesser Monolithen in größerem Volumen Pipettenspitzen einzubetten für die ersten Schritte eines automatisierten Protokoll (zB &lt;/ Em&gt; die 5 ml Hamilton / Akonni TruTips für großvolumige Extraktionen). Angesichts der spezifischen TruTip Konfigurationen durch die Hersteller von Liquid Handling-Roboter diktiert, jedoch haben wir nicht unbedingt erwarten TruTip Nukleinsäure Renditen identisch sein über Liquid Handling-Plattformen verschiedener Hersteller, oder über verschiedene TruTip Größen. Klinische Proben (per Definition) enthalten erhebliche Mengen an humaner genomischer DNA, wenn sie aus einer normalerweise sterilen Websites (zB Rückenmarksflüssigkeit) erworben werden. Manchmal ist die humane genomische DNA gewünscht wird (wie in 6), während in anderen Anwendungen der menschlichen DNA stellt einen unerwünschten Hintergrund Genom (wie bei Figur 5). Die Anwesenheit von Hintergrund-DNA ist in der Regel unproblematisch, solange die Gesamtmenge von Nucleinsäure in der Probe nicht mehr als die Bindungskapazität des Monolithen und die Hintergrund-DNA als Träger zu dienen, wenn das gewünschte Ziel-NukleinsäureSäure ist in Spuren vorhanden. Das Ziel des hochvolumigen Plasmaextraktion Protokoll (Fig. 7) zu isolieren (fragmentierten) fötale DNA in Gegenwart einer 10-20 fachen Überschuß der mütterlichen DNA, die ähnlich wie die Probenvorbereitung Ziel Infektionskrankheit Tests ist, außer dass die Sequenzen hohe Kongruenz und kann nur durch sehr spezifische molekulare Tests und / oder Größe Diskriminierung unterscheiden. In diesem Fall wird die gesamte Umlauf-DNA isoliert mit einer 5 ml TruTip und anschließende hochmolekularen und niedermolekularen fetalen DNA durch getrennt nachfolgende Bindung und Elution mit einem 1 ml TruTip durch Veränderung der Bindung Pufferbedingungen. Selektive Größe Trennung und Anreicherung von Ziel-Nukleinsäuren auf ihre Bindung und Elution Eigenschaften auf eine Silica-Monolith basiert, ist ein deutlich anderen Wirkmechanismus als durch Membranen oder Größenausschluss-Spin-Säulen erreicht. Größe Trennung und Anreicherung von mikrobieller DNA aus humanen genomischen DNA kann eine seinccomplished in zukünftigen Anwendungen über Customizing TruTip verbindlich und Elutionspuffer. Die automatisierten Protokolle gezeigt betonen die Nützlichkeit der TruTip Monolith selbst zum Verarbeiten diverse klinische Proben, und wie sie für große Mengen und spezifischen Liquid-Handling-Roboter angepasst werden. Die optimierte Methoden in der Regel schneller Extraktion Protokolle im Vergleich zu anderen automatisierten Systemen führen. Die Einfachheit des TruTip Technologie, aber auch bietet einige Kostenvorteile für die Interessenten in den Kauf eines neuen, automatisierten Aufreinigung von Nukleinsäure-System, weil die primären Hardware für die Automatisierung TruTip Verfahren erforderlich ist die Pipettenkanal Arm selbst eher als magnetische Stäbe, Vakuum-Systeme oder On-Board-Zentrifugen. Verwendung Fertigspritze Reagenz Platten können auch zu einer Verminderung Raum und erforderlichen Verbrauchsmaterialien und die doppelte Durchsatz pro Lauf. Minimierung Deck mit TruTip Protokolle ermöglicht auch fortgeschrittene Anwender zu integrieren stromaufwärts oder downstream automatisierte Prozesse mit dem TruTip. Zum Beispiel Hamiltons easyBlood Lösung zur Fraktionierung Vollblut können mit dem automatisierten TruTip Extraktionsverfahren, die deutlich straffen würde Bio-Banking-Prozesse integriert werden. Post-Extraktionsverfahren wie Nukleinsäure Quantifizierung, Normalisierung, PCR Set-up, oder DNA-Sequenzierung sind auch leicht mit TruTip auf den größeren Liquid-Handling-Plattformen integriert.

Nukleinsäure-Aufreinigung notwendig ist für die meisten molekularen Diagnostik, Forschung nur zu verwenden, und Life-Science-Anwendungen. Verschiedene Ansätze wurden seit der Zeit der Phenol / Chloroform Extraktionen entstanden, von denen viele auf dem grundlegenden Prinzip der Nukleinsäure-Bindung an Silica in der Gegenwart chaotroper Salze 1 basiert. Die Extraktion wurde gestrafft und automatisiert durch den Einsatz von verschiedenen Perlen-und Membran-basierte Formate, mit Spin Filter, magnetische Kügelchen und verwandte Ansätze dominieren die Life Sciences-Industrie (siehe Beispiele in 2-13). Während wirksam, haben Partikel und Membranen Einschränkungen bekannt, wann mit herausfordernden klinischen Matrizen konfrontiert. Zum Beispiel, Membranen und Kügelchen Säulen auf-konform sind, haben kleine Porengrößen (also hohen Gegendrücken) und erfordern irgendeine Art von Unterstützung, um durch eine Zentrifuge oder Vakuum verarbeitet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Membranen und Kügelchen Spalten einesignifikante Strömungswiderstand, der die Art der Proben, die effizient, ohne zu verstopfen die Verbrauchsmaterialien und / oder die Gesamtmenge (Eingang) Probenvolumen, die uni-direktional verarbeitet durch den Strömungsweg können verarbeitet werden begrenzt. Umgekehrt muß magnetischen Teilchen in der Probe durch Rühren verteilt. Die Notwendigkeit, die homogen verteilen magnetischen Teilchen in einer Lösung schränkt die insgesamt eingesetzten Probenmenge, die mit vielen magnetischen Kügelchen Verbrauchsmaterialien verarbeitet werden können. Klinische Probe Attribute (wie Viskosität oder Komplexität) zu ineffizienten Magnetpartikel-Konzentration auf der Seite eines Rohres oder Stabes führen. Darüber hinaus können Silica Feinstaub brechen der Perlen während der Extraktion, verlieren ihre Magnetisierung und verunreinigen das letzte Probe. Die TruTip Technologie wurde entwickelt, um einige dieser Nukleinsäure-Probe Verarbeitung Auflagen und Beschränkungen 14 zu überwinden. Durch die Einbettung eines porösen Monolithen innerhalb einerPipettenspitze, Fluidik Gegendruck abgesenkt, die Ablaufsteuerung ermöglicht durch Vakuum (dh Pipette Aspiration). Diese Funktion ermöglicht die Extraktion und Instrumentierung benötigt, um Nukleinsäuren aus schwierigen Probe Typen zu reinigen, um stark vereinfacht werden (Abbildung 1). Die Geometrie und die Porosität des Monolithen wird hergestellt, um ein Verstopfen zu minimieren, während die Dicke des Monolithen ausreichende Nukleinsäure Bindungskapazität für Probenvolumina im Bereich von 1,0 bis 5,0 ml. Durchfluss in beide Richtungen während Probe Aufnahme und Abgabe ermöglicht längere Verweilzeiten zwischen der Probenlösung und der Monolith für eine effiziente Bindung Nukleinsäuregewinnung und Elution und ermöglicht relativ große Probenvolumina verarbeitet, dass mehr als die Volumenkapazität der Pipettenspitze selbst sein. Wir bereits berichtet die Entwicklung und Anwendung eines manuellen TruTip Verfahren zur Reinigung von Influenza-RNA aus Nasen-Rachen-Proben unter Verwendung eines Single-oder Multi-Channel-Rainin Pipette 15. Equivalent Extraktionseffizienzen wurden zwischen automatisierten und manuellen QIAcube TruTip Methoden bei 10 6 Genkopien Influenza A pro ml Nasen-Rachen absaugen erhalten. Das Ziel dieser Studie war es, mittel-und High-Throughput-, automatisierte TruTip Nukleinsäurereinigung Verfahren zur Nasen-Rachen absaugen (NPA) und anderen klinisch relevanten Probenarten mit Liquid-Handling-Roboter häufig in Bezug klinischen Laboratorien gefunden zu demonstrieren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagenzien/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>TruTip Influenza-Extraktionskit (EPM TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-11120</td><td></td></tr><tr><td>95 % Ethanol</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>99 % Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-4L</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>Life Technologies</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzreservoir, 30 ml</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td>Tieflochplatte 96/2.000 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific</td><td>30502302</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1.000 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Geräte&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>epMotion 5070 System</td><td>Eppendorf</td><td>5070 000.000</td><td></td></tr><tr><td>Dosierwerkzeug TM1000-8</td><td>960001061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservoirhalterung</td><td>960002148</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle 1. &lt;/strong&gt; Reagenzien und Geräte für die automatisierte RNA-Extraktion aus NPA.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagenzien/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>TruTip gDNA Blut-Extraktionskit (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-20341</td><td></td></tr><tr><td>95 % Ethanol</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Hamilton gefilterter CO-RE 96-Tip-Rack</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235905</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Hamilton ungefilterter CO-RE 96-Tip-Rack</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235904</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Reagenztrichter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Tieflochplatte 2 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 DWP-2 ml</td><td>Thermofisher</td><td>27874</td><td></td></tr><tr><td>Reagenztrichter</td><td>Fisher</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Geräte&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hamilton STAR System</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173027</td><td></td></tr><tr><td>1 ml unabhängige Pipettierkanäle / Modulararm</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173050</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 96-Kanal-Kopf</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199090</td><td></td></tr><tr><td>Tip-Träger</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Probenhalter/Einsätze</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400/182238</td><td></td></tr><tr><td>Plattenhalter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Multiflex-Träger</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>HHS2 Heiz- und Schüttelgerät</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199033</td><td></td></tr><tr><td>Rack-Träger</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle 2. &lt;/strong&gt; Reagenzien und Geräte für die genomische DNA-Extraktion aus Vollblut in 96-Well-Format.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagenzien/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>TruTip R+D zirkulierende DNA-Extraktionskit (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>Anfrage erforderlich</td><td></td></tr><tr><td>100 % Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Gefilterte 4 ml Tips</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184022</td><td></td></tr><tr><td>Ungefilterte 1 ml Tips</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235939</td><td></td></tr><tr><td>96-Tieflochplatten</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Kegelröhrchen 50 ml</td><td>Corning/ThermoFisher Scientific</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Reagenztrichter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>120 ml Reagenztrichter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182703</td><td></td></tr><tr><td>Reagenztrichter mit großem Volumen, 96-Positionen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Geräte&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>STARplus Autoload-Arbeitsstation Basis / Deck-Modul</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173025/190012</td><td></td></tr><tr><td>1 ml unabhängige Pipettierkanäle / Arm</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173052</td><td></td></tr><tr><td>5 ml unabhängiger Kanal / Modulararm</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184090/173050</td><td></td></tr><tr><td>Plattenhalter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Multiflex-Träger</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Rack-Träger für 50 ml Reagenztrichter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td>Träger für 120 ml Reagenztrichter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>185290</td><td></td></tr><tr><td>Tip-Träger</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Röhrchenhalter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182245</td><td></td></tr><tr><td>24-Positionen Probenhalter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400</td><td></td></tr><tr><td>32-Positionen Probenhalter</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle 3. &lt;/strong&gt; Reagenzien und Geräte für die DNA-Extraktion aus Plasma mit großem Probenvolumen.</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-, automated extraktion von dna und rna aus klinischen proben mit trutip technologie gemeinsames liquid handling robots

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip ist eine einfache Extraktion von Nukleinsäuren Technologie, bei der eine poröse, monolithische Bindematrix in eine Pipettenspitze eingesetzt ist. Die Geometrie des Monolithen können nach bestimmten Pipettenspitzen Bereich im Volumen von 1,0 bis 5,0 ml angepasst werden. Die große Porosität des Monolithen ermöglicht viskosen oder komplexen Proben zu leicht durch sie hindurch mit minimalem Fluidik Gegendruck. Bi-direktionale Flow maximiert Verweilzeit zwischen dem Monolith und Probe und ermöglicht große Probenvolumina innerhalb eines einzigen TruTip verarbeitet werden. Die grundlegenden Schritte, unabhängig von Probenvolumen oder TruTip Geometrie gehören Zell-Lyse, Nukleinsäure-Bindung an den inneren Poren des TruTip Monolith, Waschen entfernt ungebundenen Bestandteile der Probe und Lysepuffern und Eluieren gereinigt und konzentriert Nukleinsäuren in einem geeigneten Puffer. Die Attribute und Anpassungsfähigkeit der TruTip sind in drei automatischen klinischen Probe Verarbeitung Protokolle unter Verwendung einer Eppendorf epMotion 5070 gezeigt, Hamilton STAR und STARPLUS Liquid-Handling-Roboter, einschließlich RNA-Isolation aus Nasopharynx absaugen, genomische DNA-Isolierung aus Vollblut und fetalen DNA-Extraktion und Anreicherung von großen Mengen im mütterlichen Plasma (jeweils).

Echtzeit-PCR-Daten für Influenza RNA Extraktion aus NPA sind in 5A gezeigt. Geschätzte Nukleinsäure-Extraktion Effizienz ist vergleichbar zu den Ergebnissen mit der manuellen Version des Protokolls 15 erhalten. Eine lineare Abhängigkeit der durchschnittlichen C t-Werte beobachtet wird zwischen 10 4 und 10 6 ml -1 Genkopien Influenza geändert (R 2 = 0,99 und 0,98 für Influenza A und B bezeichnet), mit Standardabweichungen der durchschnittlichen C T-Werte von weniger als 1 Zyklus. Das Fehlen einer Kreuzkontamination mit der epMotion System ist in Abbildung 5B, wo 12 positive Proben, die NPA 10 6 ml -1 Genkopien NPA mit 12 Puffer Rohlinge durchsetzt demonstriert. Die durchschnittliche C t für die positiven Kontrollen war 30,16 ± 0,14, und alle Puffer Rohlinge waren negativ. Die gesamte Verarbeitung Probe beträgt 16, 28 und 40 min für 8, 16 und 24 Proben.Da eine typische klinische Nasen-Rachen absaugen oder Tupfer enthält 10 7 Genkopien ml -1 (vorausgesetzt 1000 Virionen pro KID 50 16 und&gt; 10 4 TCID 50 ml -1 Influenza 17), wird die automatisierte epMotion Protokoll voraussichtlich auf eine Mehrheit wirksam von klinischen Proben NPA. Da der Bereich der molekularen Tests auf humane genomische DNA durchgeführt wird, ist das primäre Ziel der Nukleinsäure-Extraktion aus Vollblut in schadstofffreier, hochmolekulare genomische DNA zu erzeugen. Die automatisierte Protokoll für 96 Proben innerhalb 1 h, was eine Verbesserung gegenüber anderen automatisierten Systemen (zB Promega MagneSil = 90 min und Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot MDx System = 2,5 h). 6A zeigt die UV / Vis-Absorption Profile für abgeschlossen 45 positive Blutproben gleichzeitig mit 45 Reagenzleerwerte auf der Hamilton STAR-Protokoll verarbeitet, mit einer durchschnittlichen A <sub&gt; 260/280 Verhältnis von 1,96 und die durchschnittliche A 260/230 Verhältnis von 1,93. Ein A ​​260/280 Verhältnis zwischen 1,7-2,0 und A 260/230 Verhältnis&gt; 1,7 sind in der Regel sehr bezeichnend für reine DNA, frei von restlichem Salze, Proteine ​​oder Lösungsmittel, und akzeptabel für die meisten nachgeschalteten molekularen Anwendungen. Die 1%-igen Agarosegel in 6B zeigt, dass die resultierende gDNA mit hohem Molekulargewicht (&gt; 24 kb) mit minimaler Scherung. Die durchschnittliche Nukleinsäure Ausbeute aus dem vollen Satz von 45 positiven Proben beträgt 5,26 ± 0,46 ug menschlichen DNA pro 200 ul Vollblut, basierend auf dem Life Technologies Quantifiler Menschliche DNA Quantifizierung Kit. Kreuzkontamination Studien ähnlich wie in 5B gezeigt sind, wurden mit Puffer Negativkontrolle Rohlinge mit der positiven Proben vermischt und extrahiert parallel durchgeführt, alle Rohlinge wurden erneut negativ durch PCR (nicht gezeigt). Das gereinigte gDNA eignet sich auch für zahlreiche andere PCR-Analysen (nicht gezeigt). Ergebnisse in Echtzeit aus acht Replikatproben einer gepoolten mütterlichen Plasma Probe mit dem großvolumigen TruTip Verfahren verarbeitet werden in 7 gezeigt. Der vollständige Protokoll (einschließlich off-line Proteinase K Inkubation) wird in etwa 2,5 Stunden, ähnlich dem Qiagen Handbuch zirkulierenden Nukleinsäuren Kit (keine vergleichbaren automatisierten Extraktion Kits sind noch nicht verfügbar) beendet. Die durchschnittlichen C t-Werte über alle Wiederholungen sind 34,58 ± 0,66 und 29,76 ± 0,50 für fetale männlich (CHY) und insgesamt (CH1) DNA verbunden, die sehr gute Reproduzierbarkeit des automatisierten Extraktionsverfahren demonstriert. Die Konzentration an fötaler DNA in der Gesamt-DNA-Pool (der Genom-Äquivalente) wird auf der Grundlage fit Punktanalyse Vergleich mit Standards berechnet, wobei die resultierende durchschnittliche% fötaler DNA in allen Proben von 2,8%. Die tatsächliche% fetalen DNA für diese Probe ist unbekannt, weil Proben vor der Durchführung der Extraktion wurden gepoolt. Fetal DNA-Zusammensetzungin nicht-gepoolten Plasma-Proben wurde mit Hilfe der TruTip Verfahren sind in der Regel 1,5-fach höher im Vergleich zu den Ergebnissen mit einem Qiagen Circulating Nucleic Acids Kit (nicht gezeigt). <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die TruTip Extraktion und Workflow, unabhängig von der Liquid-Handling-System. Andere Probenvorbereitung und Liquid-Handling Schritte können in automatisierte Routinen abhängig von den Fähigkeiten des jeweiligen Instruments und Liquid-Handling-Software eingearbeitet werden. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Abbildung 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 Probenteller Layout. (B) Arrangement von Reagenzien / ConsumaBles auf dem Arbeitstisch. Die Probe Platte kann konfiguriert werden für bis zu 24 Proben (Spalten 1, 5 bzw. 9), obwohl die epMotion nur bearbeiten, werden maximal 8 Proben gleichzeitig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Abbildung 3. Hamilton STAR Deckslayout zur Reinigung von genomischer DNA aus Vollblut (nicht maßstabsgetreu) Deck Position 1 = 1 ml Hamilton gefiltert Tipps;. 2 = 1 ml Hamilton nicht gefilterten Tipps, 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips; 4 = Eingang Blutprobe Trägern (Blutentnahme-oder Mikrozentrifugengefäße); 5-9 = 290 ml Reagenz Tröge für Lysis Buffer F, Ethanol, Waschpuffer J, K Wash Buffer und Elution Buffer A2, bzw., 10 = 96 dEEP gut Binding Platte; 11 = 96 Tiefbrunnen waschen J; 12 = 96 Tiefbrunnen waschen K; 13 = 96 Tiefbrunnen Elution Platte; 14 = Hamilton HHS2 Heizung / Shaker mit Nunc 96 Tiefbrunnen Inkubationsplatte; 15 = 50 ml Reagenz Trog Zusatz von Proteinase K. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> Abbildung 4. Hamilton STARPLUS Deckslayout zur Reinigung von DNA aus großvolumigen Plasma-Proben (nicht maßstabsgetreu). Das System ist mit 8 x 5 ml Kanälen und 8 x 1 ml Kanäle (nicht in der Deck-Layout dargestellt) ausgestattet. Deck Position 1 = Hamilton 4 ml filtriert Tipps, 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = Quelle Plasmaproben, 4 = 50 ml konische Röhrchen, 5 = 120 ml Reagenz Tröge mit CN-W1, W2 und CN-CN-W4 Reagengen; 6 = Low-Volume-Reagenz Tröge mit Proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB und CN-W3 Reagenzien; 7 = 290 ml Reagenz Trog mit CN-L1 Reagenz, 8 = 290 ml Reagenz Trog mit CN B1-Reagenz, 9 = 96 Deep Well Platten für Schritt 1, 10 = 96 Deep Well Platten für Schritt 2; 11 = Probenträger für gereinigten Endprodukt; 12 = 1 ml Hamilton ungefilterten Tipps; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Abbildung 5. (A). Echtzeit-PCR-Ergebnisse von automatisierten TruTip Extraktion von Influenza-Virus ergänzt in Nasen-Rachen absaugen (NPA). Eingang NPA volume = 100 ul, Elutionsvolumen = 50 ul. Ergebnisse sind der Durchschnitt von 3 replizieren extractions von 5 verschiedene Hintergründe NPA (n = 15) pro Verdünnung Ebene und Grippe vorbei. qPCR wurde auf dem LightCycler ® 480 System mit Assaybedingungen zuvor beschrieben 15 durchgeführt. (B) Keine Kreuzkontamination wird erkannt, wenn 12 positive Proben ohne NPA-Template-Kontrollen und vorbehaltlich der automatisierten Extraktion durchsetzt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> Abbildung 6. Ergebnisse von menschlicher genomischer DNA Extraktion aus Vollblut. A) UV-Vis-Spuren aus einem ND-1000 (ThermoFisher) von 10 zufällig ausgewählten repliziert. B) 1% Agarosegel von TruTip gereinigte gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Die Bahnen 1 - 4 = ~ 100 ng gereinigte gDNA aus vier zufällig ausgewählte repliziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Abbildung 7. Echtzeit-PCR-Ergebnisse aus acht replizieren TruTip Extraktionen frei zirkulierender DNA aus Plasma. Proben durch Sternchen (* oder **) bezeichnet wurden an unterschiedlichen Tagen extrahiert. CHY quantifiziert männlichen fetalen DNA quantifiziert und CH1 Gesamt-DNA vorhanden ist (Mutter und Kind). qPCR wurde auf einem LightCycler 480 System (Roche) mit bisher veröffentlichten Tests Targeting CHY und CH1 18 durchgeführt.

TruTip ist eine einfache Extraktion von Nukleinsäuren Technologie, bei der eine poröse, monolithische Bindematrix in eine Pipettenspitze eingesetzt ist. Folglich ist die Probenvorbereitung Format kompatibel mit den meisten Liquid Handling Geräte, und kann für viele mittel-bis High-Throughput-klinische Anwendungen und Probe-Typen verwendet werden.

Hochdurchsatz-, Automated Extraktion von DNA und RNA aus klinischen Proben mit TruTip Technologie Gemeinsames Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, menschliche genomische DNA aus Vollblut zu isolieren, wobei die True-Tip-Extraktionstechnologie mit der Hamilton-Star-Flüssigkeits-Handhabungs-Workstation verwendet wird. Um dies zu erreichen, werden Zellen in einer Lösung, die aus dem Blutproben-Lysepuffer, Proteinase K und Ethanol besteht, mehrfach durch die True Tips angesaugt und abgegeben, wodurch die DNA an die True-Tip-Matrix gebunden wird. Anschließend werden zwei separate Waschpuffer durch die True Tips geleitet, um restliche Proteine, Lysepuffer und andere Kontaminationen von den gebundenen Nukleinsäuren zu entfernen.Im dritten Schritt wird die Bindungsmatrix der True-Tip getrocknet, indem mehrfach Luft angesaugt und abgegeben wird, um jegliches verbleibendes Waschpuffer zu verdampfen. Im letzten Schritt wird Illusionspuffer hin und her durch die Bindungsmatrix geleitet, um die DNA von der Matrix freizusetzen. Mithilfe der True-Tip-Technologie wird auf diese Weise kontaminationsfreie genomische DNA mit hohem Molekulargewicht gewonnen, die mittels UV/Vis-Absorption, Gelelektrophorese sowie quantitativer PCR oder Sequenzierung bestätigt werden kann. Der Vorteil der True-Tip gegenüber anderen Probenvorbereitungsmethoden, die auf Säulchen oder magnetischen Partikeln basieren, liegt darin, dass die Tru-Tip einfach zu automatisieren ist.Es erfordert keine kostspieligen Systeme mit Zentrifugen und Magnetstäben, und der einfache Arbeitsablauf spart wertvollen Platz auf der Arbeitsfläche. Obwohl wir uns heute auf Vollblut konzentrieren werden, kann Tru Tip auch auf andere Anwendungen zur genomspezifischen DNA-Gewinnung sowie auf die Gewinnung viraler RNA aus klinischen Abstrichproben oder die Isolierung zellfreier DNA aus Plasma angewandt werden, um nur einige zu nennen. Die Demonstration des Verfahrens übernimmt Dane Brady, ein Automatisierungsingenieur aus unserem Labor, der eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung des Tru Tip-Extraktionsverfahrens auf der Hamilton Liquid Handling Workstation gespielt hat.In diesem Protokoll extrahiert ein Hamilton Star Flüssigkeits-Handling-Roboter gleichzeitig DNA aus 96 Vertiefungen mit Vollblut. Der Hamilton Star verfügt über eine optionale Heiz-Schüttel-Einheit auf der Plattform, die für die enzymatische Verdauung bestimmter klinischer Matrizes wie Vollblut wichtig ist. Da das System mit einem 96-Kanal-Pipettierkopf ausgestattet werden kann, gibt es eine dedizierte 96-Loch-Platte für jeden der eigentlichen Tip-Schritte und Reagenzien.Schalten Sie zuerst die mit dem Hamilton Star-Roboter verbundene Ausrüstung und den Computer ein. Öffnen Sie die Hamilton Run Control-Software auf dem Computer. Öffnen Sie die von ACON bereitgestellte Laufdatei für 96 Proben.Richten Sie nun den Star-Deck-Layout gemäß der Abbildung ein. Platzieren Sie gefilterte 1 ml-Spitzen in allen Positionen, die mit „1“ gekennzeichnet sind; in Position 2 setzen Sie ungefilterte 1 ml-Spitzen. In Position 3 platzieren Sie eine Conni Hamilton 1 ml LPT 2 mm True-Spitze. Orientieren Sie sich weiterhin an der Tabelle, um die verbleibenden Positionen von 5 bis 12 mit den erforderlichen LabWare zu bestücken, laden Sie die Proben jedoch noch nicht ein.Geben Sie nun die Reagenzien 75 Milliliter Lyse- und Bindungspuffer aus. F sollte in Position fünf des Trichters eingesetzt werden. Alternativ könnten auch Platten, die vorab mit Puffern befüllt sind, verwendet werden, um die Einrichtung zu beschleunigen und die Deck-Layouts zu vereinfachen.Fahren Sie entsprechend mit dem Befüllen des Roboters fort. Entfernen Sie abschließend die Verschlüsse von den Blutröhrchen und stellen Sie diese in die Probenhaltergestelle oder in die Deckposition vier. Platzieren Sie Probe eins im hinteren Bereich des äußersten linken Halterplatzes und fahren Sie der Reihe nach fort, bis Probe 96 in der vorderen rechten Position endet.Nachdem alle Proben geladen sind, sollten sie auf Raumtemperatur equilibrieren. Da das Protokoll vollständig automatisiert ist, bleibt kaum Platz für Bedienerfehler. Die Proben müssen in der richtigen Reihenfolge im Rack platziert werden, doch zur Sicherstellung einer korrekten Probenverfolgung kann eine Barcode-Kennzeichnung implementiert werden.Um ein automatisiertes Skript zu starten, wählen Sie die Wiedergabetaste in der oberen linken Ecke des Ausgabedatei-Fensters und geben Sie die Anzahl der zu verarbeitenden Proben ein. Der erste vom Skript ausgeführte Schritt ist die Übertragung von 80 µL Proteinase K auf die Inkubationsplatte an Position 14 des Heiz-Shaker-Moduls. Anschließend gibt das Skript mithilfe des Acht-Kanal-Arms jeweils 200 µL Probe in jedes Probenloch der Inkubationsplatte ab.Anschließend werden mit dem 96-Kanal-Arm jeweils 600 µL Lysepuffer F in jede Vertiefung der Inkubationsplatte abgegeben. Das Programm mischt dann die Lösung zehn Zyklen lang und inkubiert sie 20 Minuten bei 70 °C und 500 rpm in der Tieflochplatte; die Temperatur beträgt lediglich 60 °C, was im Bereich der Aktivität von Proteinase K liegt. Während die Proben inkubiert werden, setzt das Flüssigkeitsmanagementsystem seine Arbeit fort, indem es die Extraktions- und Elutionsreagenzien aus den Reagenzien-Behältern in die entsprechenden 96-Loch-Platten abgibt; jeweils 100 µL Elucian-Puffer A werden jeder Vertiefung der Tieflochplatte zugegeben.An Position 13 werden 800 µL Ethanol in jedes Loch der Tieflochplatte gegeben. An Position 10 werden 1,6 mL Waschpuffer K jedem Loch der Tieflochplatte an Position 12 und 1,6 mL Waschpuffer J jedem Loch der Tieflochplatte an Position 11 hinzugefügt. Nach der 20-minütigen Inkubation wird die Probenmischung von der Inkubationsplatte in die Tieflochplatte mit Ethanol an Position 10 übertragen und dort durch 12 Pipettierzyklen vermischt.Während des gesamten Prozesses werden Reagenzpipettenspitzen bei Bedarf in den Abfallbehälter entsorgt. Das Programm setzt sich vom Lyseprozess zur DNA-Extraktion fort, indem zunächst 96 True-Tips aus der Deckposition drei geladen werden. Im nächsten Schritt werden die Proben an Position 10 über 10 Zyklen aspiriert und dispensiert, wodurch die Nukleinsäuren an den True-Tip-Monolithen gebunden werden.Danach bewegen sich die True Tips in Position 11, an der das Waschpuffer J fünfmal über die Monolith-Säule zirkuliert wird, um Reste der Lyse, des Puffers und der Probenmatrix zu entfernen. Anschließend bewegen sich die True Tips in Position 12, wo Waschpuffer K fünfmal durch sie hindurch zirkuliert, um Proteine und andere Kontaminationen von den gebundenen Nukleinsäuren zu entfernen. Danach trocknen die True Tips, indem 80-mal bei hoher Geschwindigkeit über der Waschplatte Luft zirkuliert wird.Jetzt bewegen sich die TrueTips in Position 13, wo der Elutionspuffer zwei Zyklen lang fünfmal durch sie hindurchgeleitet wird, wodurch die DNA in die Deep-Well-Platte freigesetzt wird. Die TrueTips werden nun in den Abfallbehälter ausgeworfen. Das Programm ist nun beendet.Entfernen Sie die Elutionsplatte vom Gerät und überführen Sie die extrahierten Proben in die geeigneten Röhrchen für die Lagerung oder nachfolgende Anwendungen. Das Programm kann auch so angepasst werden, dass die endgültigen Proben automatisch innerhalb von nur einer Stunde in das gewünschte Röhrchen oder die gewünschte Platte überführt werden. Das automatisierte System extrahierte genomische DNA aus 96 Blutproben mithilfe des Roboters.Die Absorptionsprofile von 45 positiven Blutproben wurden gleichzeitig mit 45 Reagenzien-Leerproben ausgewertet. Das durchschnittliche Verhältnis von zwei 60 zu zwei 80 betrug 1,96, und das durchschnittliche Verhältnis von zwei 60 zu zwei 30 betrug 1,93, was auf reine Proben in einem 1 %igen Agarose-Gel hindeutet. Zufällige Proben zeigten ein hohes molekulares Gewicht mit minimaler Scherung.Die durchschnittliche Ausbeute betrug etwa fünf Mikrogramm DNA pro 200 Mikroliter Vollblut. Bei der Optimierung des automatisierten True-Tip-Protokolls wird besondere Sorgfalt darauf verwendet, sicherzustellen, dass keine Kreuzkontamination zwischen den Vertiefungen auftritt. Die Echtzeit-PCR zeigt eine klare Trennung zwischen positiven und negativen Proben, wie hier dargestellt.Für RNA-Extraktionen kann die gesamte Extraktion von 96 Proben in weniger als einer Stunde abgeschlossen werden, wobei nur minimale manuelle Arbeitsschritte erforderlich sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche genomische DNA aus Vollblut mittels der TRU Technology Automated auf der Hamilton Star Liquid Handling Workstation isoliert.

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