Hochdurchsatz-, Automated Extraktion von DNA und RNA aus klinischen Proben mit TruTip Technologie Gemeinsames Liquid Handling Robots

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, menschliche genomische DNA aus Vollblut zu isolieren, wobei die True-Tip-Extraktionstechnologie mit der Hamilton-Star-Flüssigkeits-Handhabungs-Workstation verwendet wird. Um dies zu erreichen, werden Zellen in einer Lösung, die aus dem Blutproben-Lysepuffer, Proteinase K und Ethanol besteht, mehrfach durch die True Tips angesaugt und abgegeben, wodurch die DNA an die True-Tip-Matrix gebunden wird. Anschließend werden zwei separate Waschpuffer durch die True Tips geleitet, um restliche Proteine, Lysepuffer und andere Kontaminationen von den gebundenen Nukleinsäuren zu entfernen.

Im dritten Schritt wird die Bindungsmatrix der True-Tip getrocknet, indem mehrfach Luft angesaugt und abgegeben wird, um jegliches verbleibendes Waschpuffer zu verdampfen. Im letzten Schritt wird Illusionspuffer hin und her durch die Bindungsmatrix geleitet, um die DNA von der Matrix freizusetzen. Mithilfe der True-Tip-Technologie wird auf diese Weise kontaminationsfreie genomische DNA mit hohem Molekulargewicht gewonnen, die mittels UV/Vis-Absorption, Gelelektrophorese sowie quantitativer PCR oder Sequenzierung bestätigt werden kann. Der Vorteil der True-Tip gegenüber anderen Probenvorbereitungsmethoden, die auf Säulchen oder magnetischen Partikeln basieren, liegt darin, dass die Tru-Tip einfach zu automatisieren ist.

Es erfordert keine kostspieligen Systeme mit Zentrifugen und Magnetstäben, und der einfache Arbeitsablauf spart wertvollen Platz auf der Arbeitsfläche. Obwohl wir uns heute auf Vollblut konzentrieren werden, kann Tru Tip auch auf andere Anwendungen zur genomspezifischen DNA-Gewinnung sowie auf die Gewinnung viraler RNA aus klinischen Abstrichproben oder die Isolierung zellfreier DNA aus Plasma angewandt werden, um nur einige zu nennen. Die Demonstration des Verfahrens übernimmt Dane Brady, ein Automatisierungsingenieur aus unserem Labor, der eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung des Tru Tip-Extraktionsverfahrens auf der Hamilton Liquid Handling Workstation gespielt hat.

In diesem Protokoll extrahiert ein Hamilton Star Flüssigkeits-Handling-Roboter gleichzeitig DNA aus 96 Vertiefungen mit Vollblut. Der Hamilton Star verfügt über eine optionale Heiz-Schüttel-Einheit auf der Plattform, die für die enzymatische Verdauung bestimmter klinischer Matrizes wie Vollblut wichtig ist. Da das System mit einem 96-Kanal-Pipettierkopf ausgestattet werden kann, gibt es eine dedizierte 96-Loch-Platte für jeden der eigentlichen Tip-Schritte und Reagenzien.

Schalten Sie zuerst die mit dem Hamilton Star-Roboter verbundene Ausrüstung und den Computer ein. Öffnen Sie die Hamilton Run Control-Software auf dem Computer. Öffnen Sie die von ACON bereitgestellte Laufdatei für 96 Proben.

Richten Sie nun den Star-Deck-Layout gemäß der Abbildung ein. Platzieren Sie gefilterte 1 ml-Spitzen in allen Positionen, die mit „1“ gekennzeichnet sind; in Position 2 setzen Sie ungefilterte 1 ml-Spitzen. In Position 3 platzieren Sie eine Conni Hamilton 1 ml LPT 2 mm True-Spitze. Orientieren Sie sich weiterhin an der Tabelle, um die verbleibenden Positionen von 5 bis 12 mit den erforderlichen LabWare zu bestücken, laden Sie die Proben jedoch noch nicht ein.

Geben Sie nun die Reagenzien 75 Milliliter Lyse- und Bindungspuffer aus. F sollte in Position fünf des Trichters eingesetzt werden. Alternativ könnten auch Platten, die vorab mit Puffern befüllt sind, verwendet werden, um die Einrichtung zu beschleunigen und die Deck-Layouts zu vereinfachen.

Fahren Sie entsprechend mit dem Befüllen des Roboters fort. Entfernen Sie abschließend die Verschlüsse von den Blutröhrchen und stellen Sie diese in die Probenhaltergestelle oder in die Deckposition vier. Platzieren Sie Probe eins im hinteren Bereich des äußersten linken Halterplatzes und fahren Sie der Reihe nach fort, bis Probe 96 in der vorderen rechten Position endet.

Nachdem alle Proben geladen sind, sollten sie auf Raumtemperatur equilibrieren. Da das Protokoll vollständig automatisiert ist, bleibt kaum Platz für Bedienerfehler. Die Proben müssen in der richtigen Reihenfolge im Rack platziert werden, doch zur Sicherstellung einer korrekten Probenverfolgung kann eine Barcode-Kennzeichnung implementiert werden.

Um ein automatisiertes Skript zu starten, wählen Sie die Wiedergabetaste in der oberen linken Ecke des Ausgabedatei-Fensters und geben Sie die Anzahl der zu verarbeitenden Proben ein. Der erste vom Skript ausgeführte Schritt ist die Übertragung von 80 µL Proteinase K auf die Inkubationsplatte an Position 14 des Heiz-Shaker-Moduls. Anschließend gibt das Skript mithilfe des Acht-Kanal-Arms jeweils 200 µL Probe in jedes Probenloch der Inkubationsplatte ab.

Anschließend werden mit dem 96-Kanal-Arm jeweils 600 µL Lysepuffer F in jede Vertiefung der Inkubationsplatte abgegeben. Das Programm mischt dann die Lösung zehn Zyklen lang und inkubiert sie 20 Minuten bei 70 °C und 500 rpm in der Tieflochplatte; die Temperatur beträgt lediglich 60 °C, was im Bereich der Aktivität von Proteinase K liegt. Während die Proben inkubiert werden, setzt das Flüssigkeitsmanagementsystem seine Arbeit fort, indem es die Extraktions- und Elutionsreagenzien aus den Reagenzien-Behältern in die entsprechenden 96-Loch-Platten abgibt; jeweils 100 µL Elucian-Puffer A werden jeder Vertiefung der Tieflochplatte zugegeben.

An Position 13 werden 800 µL Ethanol in jedes Loch der Tieflochplatte gegeben. An Position 10 werden 1,6 mL Waschpuffer K jedem Loch der Tieflochplatte an Position 12 und 1,6 mL Waschpuffer J jedem Loch der Tieflochplatte an Position 11 hinzugefügt. Nach der 20-minütigen Inkubation wird die Probenmischung von der Inkubationsplatte in die Tieflochplatte mit Ethanol an Position 10 übertragen und dort durch 12 Pipettierzyklen vermischt.

Während des gesamten Prozesses werden Reagenzpipettenspitzen bei Bedarf in den Abfallbehälter entsorgt. Das Programm setzt sich vom Lyseprozess zur DNA-Extraktion fort, indem zunächst 96 True-Tips aus der Deckposition drei geladen werden. Im nächsten Schritt werden die Proben an Position 10 über 10 Zyklen aspiriert und dispensiert, wodurch die Nukleinsäuren an den True-Tip-Monolithen gebunden werden.

Danach bewegen sich die True Tips in Position 11, an der das Waschpuffer J fünfmal über die Monolith-Säule zirkuliert wird, um Reste der Lyse, des Puffers und der Probenmatrix zu entfernen. Anschließend bewegen sich die True Tips in Position 12, wo Waschpuffer K fünfmal durch sie hindurch zirkuliert, um Proteine und andere Kontaminationen von den gebundenen Nukleinsäuren zu entfernen. Danach trocknen die True Tips, indem 80-mal bei hoher Geschwindigkeit über der Waschplatte Luft zirkuliert wird.

Jetzt bewegen sich die TrueTips in Position 13, wo der Elutionspuffer zwei Zyklen lang fünfmal durch sie hindurchgeleitet wird, wodurch die DNA in die Deep-Well-Platte freigesetzt wird. Die TrueTips werden nun in den Abfallbehälter ausgeworfen. Das Programm ist nun beendet.

Entfernen Sie die Elutionsplatte vom Gerät und überführen Sie die extrahierten Proben in die geeigneten Röhrchen für die Lagerung oder nachfolgende Anwendungen. Das Programm kann auch so angepasst werden, dass die endgültigen Proben automatisch innerhalb von nur einer Stunde in das gewünschte Röhrchen oder die gewünschte Platte überführt werden. Das automatisierte System extrahierte genomische DNA aus 96 Blutproben mithilfe des Roboters.

Die Absorptionsprofile von 45 positiven Blutproben wurden gleichzeitig mit 45 Reagenzien-Leerproben ausgewertet. Das durchschnittliche Verhältnis von zwei 60 zu zwei 80 betrug 1,96, und das durchschnittliche Verhältnis von zwei 60 zu zwei 30 betrug 1,93, was auf reine Proben in einem 1 %igen Agarose-Gel hindeutet. Zufällige Proben zeigten ein hohes molekulares Gewicht mit minimaler Scherung.

Die durchschnittliche Ausbeute betrug etwa fünf Mikrogramm DNA pro 200 Mikroliter Vollblut. Bei der Optimierung des automatisierten True-Tip-Protokolls wird besondere Sorgfalt darauf verwendet, sicherzustellen, dass keine Kreuzkontamination zwischen den Vertiefungen auftritt. Die Echtzeit-PCR zeigt eine klare Trennung zwischen positiven und negativen Proben, wie hier dargestellt.

Für RNA-Extraktionen kann die gesamte Extraktion von 96 Proben in weniger als einer Stunde abgeschlossen werden, wobei nur minimale manuelle Arbeitsschritte erforderlich sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche genomische DNA aus Vollblut mittels der TRU Technology Automated auf der Hamilton Star Liquid Handling Workstation isoliert.