A Novel Ex vivo Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das embryonale Herz für die ex vivo-Kultur herauszuschneiden. Dazu wird zunächst das Gebärmutterhorn einer trächtigen weiblichen Maus entnommen. Als nächstes wird ein Embryo entnommen und für die Sektion vorbereitet.

Dann wird die embryonale Brustwand geöffnet, um das Herz sichtbar zu machen. Schließlich wird das Herz herausgeschnitten und in eine Kulturvertiefung gegeben, die verdünntes Matrigel enthält. Letztendlich können durch die Betrachtung unter einem Hellfeldmikroskop Ergebnisse erzielt werden, die ein gesundes lebendes Herz zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie dem Schaukeln von Kulturen besteht darin, dass das Herz entweder mit lokalen Wirkstoffen wie einem Protein, das an die Kügelchen konjugiert ist, oder mit globalen Wirkstoffen, wie dem Hinzufügen eines kleinen Moleküls zum Matrigel, behandelt werden kann. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, da sie es ermöglicht, die Ereignisse in spezialisierten Segmenten des Herzens im Kontext des gesamten intakten Organs zu untersuchen. Nachdem Sie eine zeitlich begrenzte trächtige Maus am gewünschten Embryonaltag eingeschläfert haben, besprühen Sie das Weibchen mit einer von Ihrem Institut genehmigten Technik großzügig mit 70% Ethanol, bevor Sie die Bauchhöhle öffnen und das Gebärmutterhorn entnehmen und herausschneiden.

Legen Sie das Gebärmutterhorn in eine Petrischale, die kaltes XPBS enthält, und spülen Sie es aus. Stellen Sie die Schüssel auf Eis, bis sie zum Sezieren bereit ist. Schneiden Sie dann das Gebärmutterhorn über die Mittellinie auf, um die anhaftenden Embryonalsäcke freizulegen.

Schneiden Sie einen embryonalen Sack auf und legen Sie einen Embryo in eine zweite Petrischale mit kaltem PBS. Stellen Sie die Schüssel mit dem Gebärmutterhorn auf Eis. Nachdem Sie den Embryo enthauptet haben, legen Sie den Embryo auf den Rücken und schneiden Sie ihn ab.

Öffne die Brustwand, um Herz und Lunge sichtbar zu machen. Je nach Stadium kann die Brustwand transparent sein. Wenn eine Genotypisierung durchgeführt werden soll, retten Sie den Schwanz des Embryos.

Heben Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Herz an und schneiden Sie die darunter liegenden Gefäße. Schneide dann über die großen Gefäße, um das Herz zu befreien. Entfernen Sie bei Bedarf Fremdgewebe.

Legen Sie das Herz in eine Mulde einer 24-Well-Schale, die mit kaltem PBS gefüllt ist, und legen Sie es auf Eis. Wiederholen Sie die Dissektion, um alle embryonalen Herzen zu isolieren. Kombinieren Sie in einer Laminar-Flow-Haube kaltes Matri-Gel und das gewünschte Kulturmedium im Verhältnis eins zu eins, während Sie das verdünnte Matri-Gel auf Eis halten.

Pipettieren Sie 500 bis 1000 Mikroliter der Lösung in die Vertiefungen einer 24-Well-Kultur. Servieren Sie das auf Eis. Entnehmen Sie vorsichtig die herausgeschnittenen Herzen und legen Sie sie in die einzelnen Vertiefungen der Matrigel-haltigen Kulturschale.

Wenn die Ausrichtung eines eingebetteten Herzens entscheidend ist, verwenden Sie 70%iges Ethanol, um ein inverses Mikroskop und den umgebenden Raum großzügig zu besprühen. Dann, nachdem Sie in der Haube gearbeitet haben, legen Sie das Herz in die Vertiefung des Mattengels auf Eis. Stellen Sie die Platte auf einen Mikroskoptisch und richten Sie das Herz schnell aus, während sich das matte Gel zu verfestigen beginnt.

Stellen Sie die Kulturschale in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator und lassen Sie das Matri-Gel etwa 30 Minuten lang festigen. Geben Sie einen Milliliter vorgewärmte Kultur, Medium in jede Vertiefung, die ein Herz enthält. Die Herzen können mindestens vier Tage in Kultur bleiben.

Falls gewünscht, fügen Sie einen fluoreszierenden Lebendzellstempel hinzu, z. B. cyto 16. Um die Live-Herzfotografie zu visualisieren, wird die Herzfotografie auf die Seite des Herzens beschränkt, die aufgrund der Position, in der sie eingebettet wurde, sichtbar ist. Wenn eine Bildgebung oder ein Schnitt der gesamten Montierung durchgeführt wird, entfernen Sie das Kulturmedium.

Ersetzen Sie es durch kaltes 4%iges Formaldehyd und stellen Sie das Gericht 30 Minuten lang auf Eis. Nachdem sich das Matrigel aufgelöst hat, ersetzen Sie das Fixiermittel und das Matrigel durch frisches Formaldehyd und fixieren Sie die Herzen über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Herzen mit PBS oder Triss und lagern Sie sie bis zu weiteren Analysen bei vier Grad Celsius.

Wenn das koronare Gefäßsystem 24 Stunden lang ex vivo kultiviert wird, ähnelt es einem Herzen, das aus einem vergleichbar alten Embryo herausgeschnitten wurde, der in utero gehalten wurde, wie hier gezeigt. Die Hämat-, Toin- und Eoin-Analyse von Herzen, die bei E 16,5 exzidiert und vier Tage lang ex vivo kultiviert wurden, zeigt, dass die Gesamtmorphologie, einschließlich der Wände der großen Arterien und des ventrikulären und interventrikulären Septummyokards des Herzens, trotz der fehlenden Durchblutung intakt bleibt. Die koronaren Osteo sind sichtbar, wie durch die Pfeilspitze angedeutet.

Die DNA-Fragmentierung, die mit Pfeilen gekennzeichnet ist und sowohl bei h als auch bei d und DAPI beobachtet wird, ist jedoch im kompakten Myokard und um die großen Gefäße herum sichtbar. Darüber hinaus ist das Myokard weniger dicht als ein Herz aus einem E 18,5-Embryo, der sich in utero entwickelt hat, obwohl das ex vivo kultivierte Herz noch schlägt. Daher gibt es Beschränkungen für die Zeitdauer oder das Stadium, in dem diese Herzen aufrechterhalten werden können.

Diese Kulturtechnik kann auch zur Fluoreszenzmarkierung von Herzen verwendet werden, während in der Kultur nach der Inkubation mit einem endothelspezifischen Fluoreszenzfarbstoff die Herzen 48 Stunden lang kultiviert werden. In diesem Fall ist die Visualisierung aufgrund der Ausrichtung des Herzens und der Opazität des Gewebes eingeschränkt. Nachfolgende histologische Schnitte durch das ventrikuläre Myokard bestätigen, dass Cyto 16 in die äußeren Zellschichten eindringen kann, um subepikardiale Gefäße innerhalb der Ventrikel zu markieren und mit seinem Selektin zu lokalisieren, wie hier gezeigt. Nach 30-stündiger Ex-vivo-Kultivierung zeigt ein Herz, das aus einem E 14,5-Embryo herausgeschnitten wurde, eine konsistente Kontraktilität und Stimulation zwischen den Vorhöfen und Ventrikeln.

Bei dieser Technik ist es wichtig, beim Herausschneiden des Herzens vorsichtig und vorsichtig zu sein. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein embryonales Mausherz herausschneidet und kultiviert.