Name: Gründung Fungal Entomopathogens als Endophyten: Gegen Endophytic Biological Control (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Lernen Sie zwei Inokulationsmethoden zur Etablierung von Beauveria bassiana als Endophyt in Phaseolus vulgaris. Dieses Protokoll demonstriert Blattsprühung und Bodengießung für biologische Schädlingsbekämpfung.

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Die Produktion und der experimentellen Arbeiten hier vorgestellten spiegeln die engagierten und enthusiastischen Hilfe von Reynaldo Pareja. Gefördert durch Verwaltungsabteilung Kolumbiens für Wissenschaft, Technologie und Innovation (Colciencias) und durch einen Zuschuss von der Bill &amp; Melinda Gates Foundation durch die Grand Challenges Explorations-Initiative.

Ein. Pflanzen <ol><li> Oberflächenaktive sterilisieren Bohnensamen (cv. Calima) durch Eintauchen für zwei Minuten in 0,5% Natriumhypochlorit und zwei Minuten in 70% Ethanol. Spülen Sie die Samen dreimal in sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Bewerten Sie den Erfolg Ihrer Sterilisation durch Ausplattieren 100 ul der letzten Spülwasser auf Kartoffel dextroxe Agar (PDA) Medien und Inkubation der Platte für 10 Tage bei 25 ° C. Beenden und neu starten das Experiment, wenn kein Wachstum auf der Platte zu sehen ist. </li><li> Pflanzen die Samen in Gruppen von drei in Töpfen mit einer sterilen Mischung von Erde und Sand im Verhältnis 2:1. Übertragen der Töpfe in eine Wachstumskammer bei 25 ° C, ca.. 50% RH und 12 h Photoperiode. Eine Woche nach der Keimung, beseitigen die beiden mindestens kräftige Sämlinge. Wasser alle 2-3 Tage mit sterilem destilliertem Wasser und düngen 10 und 20 Tage nach der Pflanzung mit einem 6 g / L Wasser-Lösung von NPK 15-15-15 Dünger. </li></ol> 2. Pilz <ol><li> Besorgen Sie sich eine komsoziale Formulierung Beauveria bassiana Stamm GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Kolumbien). </li><li> Um eine einzelne Sporen Stammkultur erzeugen, auszusetzen ca. ein Impföse voll von Konidien in 1 ml einer 0,1% igen wässrigen Lösung von Triton-X 100 und Vortex für 10 Sekunden. Dann Platte 100 ul der Suspension auf 2,5% Noble-Agar und Inkubation für 24 Stunden bei 25 ° C. Übertragen einer einzigen keimenden Konidien in eine 100 mm Platte mit PDA und wachsen, bis sie die gesamte Platte (ca. 3-4 Wochen) abdeckt. </li><li> Unter sterilen Bedingungen, kratzen die Pilzwachstum von der Oberfläche des Mediums und suspendieren in 10 ml steriler 0,1% Triton X-100. Vortex für eine Minute. Dann filtern die Suspension durch eine sterile Gaze um Hyphen zu entfernen und die Stoffsuspension. </li><li> Verwenden Sie eine Zählkammer die Konidien Konzentration der Stoffsuspension zu schätzen. Um Konidien zählt zu erleichtern, bereiten eine 10.000-fach Verdünnungsreihe der Aktie, jedes Mal, wenn die Übertragung 100 ul of Konidienaufschwemmung in 900 ul 0,1% Triton-X 100 und Vortexen für 10 Sek. vor der nächsten Verdünnung. </li><li> Um das Inokulum zu erzeugen, Einstellen der Stoffsuspension auf eine Endkonzentration von 10 8 Sporen / ml, nach der Formel: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="Gleichung 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Um Konidien Lebensfähigkeit Platte 100 ul der 10.000-fachen Verdünnung auf 2,5% Noble-Agar und Inkubation für 24 Stunden zu beurteilen bei 25 ° C. Dann untersuchen drei zufällige Gruppen von 100 Konidien auf Prozent der Keimung zu schätzen. Betrachten wir ein Conidium gekeimt wenn eine sichtbare Keimschlauch länger als die Hälfte des Durchmessers der Conidium Projekte daraus. Verwenden Sie nur die Aussetzung, wenn die durchschnittliche prozentuale Keimung 90% übersteigt. </li></ol> 3. Impfung <ol><li> Beimpfen Pflanzen, wenn sie ihre erste echte Blatt-Stadium (ca. 14 Tage nach dem Einpflanzen) zu erreichen. Wasserpflanzen zu Boden Kapazität mit sterilen destillierened Wasser 24 Stunden vor Impfungen. </li><li> Für die Blatt-Sprühverfahren, verwenden eine manuelle Zerstäubers um die Konidienaufschwemmung (Behandlung) oder 0,1% Triton-X 100 (Kontrolle) der adaxial (oberen) Oberfläche der Blätter bis sie Sättigung erreichen anzuwenden. Decken Sie die Oberseite des Topfes mit Aluminiumfolie Konidien Abfluss in den Boden vermeiden. Nach dem Aufsprühen decken Pflanzen mit einer Plastiktüte für 24 Stunden, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu erleichtern Pilz Invasion zu halten. </li><li> Für den Boden drench Verfahren, verwenden Sie einen Meßzylinder auf 10 ml Konidiensuspension (Behandlung) oder 0,1% Triton-X 100 (Kontrolle) auf die Oberfläche des Bodens auf der Basis der Pflanze. Gelten </li><li> Nach Impfungen, zurückzukehren Pflanzen zu den Klimakammern ordnet sie in einer randomisierten vollständigen Block-Design. Nicht weniger als vier zusätzliche experimentelle Blöcken installiert werden, um Auswertungen des Pflanzenwachstums zu ermöglichen, zusätzlich zu Auswertungen endophytischen Kolonisierung im gleichen Experiment. </li></ol> 4. Evaluations <ol><li> Auswertung des Versuchs ein Block in einer Zeit, die Auswahl der Blöcke in zufälliger Reihenfolge. Dies ist insbesondere wichtig für große Experimente, die nicht an einem einzigen Tag ausgewertet werden können. </li><li> Vor der Verarbeitung einer Pflanze, messen und aufzeichnen seine Höhe von der Basis zu dem apikalen Meristem. Dann vorsichtig entwurzeln und gründlich unter fließendem Leitungswasser. </li><li> Von jeder Pflanze, Probe zwei Blättchen, zwei Stücke von Wurzel und zwei Stücke von Stammzellen. Wählen Sie Broschüre Proben zufällig aus der ersten echten Blatt der Pflanze. Dann erhält man zwei Proben Schaft, 3 cm langen jeweils von der Mitte der Pflanze und von der Nähe der Bodenoberfläche. Schließlich erhalten zwei taproot Proben, auch 3 cm lang jeweils von der Mitte der Wurzel und von 1 cm hinter der Wurzelspitze. Legen Sie die Proben auf drei separaten Papiertüten und Label angemessen. </li><li> Nach dem Waschen und Abtasten aller Pflanzen in einem Block, durch Verarbeiten der Blätter startet, dann Wurzeln, und schließlich werden die Stiele. </li><li> Oberfläche zu sterilisieren tFragen in einem sterilen Laminarströmungshaube wie in 1,1 oben. Spülen Sie jede Probe dreimal durch Eintauchen in sterilem destilliertem Wasser und lassen es trocken in sterilen Tuch Papier. Dann zerlegen und entsorgen ihren äußeren Rändern, wo Endophyten beseitigt haben könnten aufgrund der mit Desinfektionsmitteln zu kontaktieren. </li><li> Schneiden Sie den getrimmt Probe in sechs Abschnitte mit durchschnittlich 6x6 mm für Blätter und 6 mm-lange Stängel und Wurzeln. Platte die sechs Abschnitte über eine 60 mm Petrischale mit PDA Medien mit dem Antibiotika Tetracyclin, Streptomycin und Penicillin bei 2 mg / L jeweils ergänzt. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren im Dunkeln bei 25 ° C. Jede Pflanze liefert sechs Platten, zwei pro Anlagenteil. </li><li> Anderer das Wasser nach der Verarbeitung jedes Blocks eines gegebenen Pflanzenteil spülen. Vor der Entsorgung des verwendeten Spülwassers, Platte eine 100 ul Probe auf PDA Medien und inkubieren für 10 Tage bei 25 ° C zu beurteilen Sterilisation Erfolg. Wenn Pilzwachstum erfolgt, berücksichtigen nicht die entsprechenden Proben für Analysen. </li><li> Überprüfen Sie die Platten alle 2-3 Tage für 20 Tage zu beobachten und aufzuzeichnen Pilzwachstum. Verbrauchsteuern und Transfer Anlagenteile ausstellenden Vorhandensein von Pilz-Endophyten auf Platten mit frischem PDA. Dies wird eine Kontamination benachbarter Anlagenteile in der Original-Platte. </li><li> Rekord B. bassiana Wachstum von Anlagenteilen. Beauveria bassiana kann durch charakteristische weiße dichten Myzel immer cream bis blassgelb am Rande identifiziert werden. Wenn Sie Zweifel haben, montieren Sie die Probe in einem Tropfen Wasser und überprüfen unter dem Mikroskop auf der Suche nach globose Konidien und Zick-Zack-förmigen Konidienträgern, charakteristisch für die Spezies. </li><li> Verwenden Sie zusätzliche experimentelle Blöcke, um die Auswirkungen der Behandlungen auf pflanzlicher Biomasse zu evaluieren. Zunächst messen deren Höhe von der Basis bis zur Spitze des apikalen Meristem. Dann vorsichtig entwurzeln und waschen Pflanzen in Leitungswasser und lassen Sie sie trocknen bei 45 ° C für drei Tage, um ihre Trockengewicht zu bestimmen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Viele Faktoren können Einfluss auf die konkrete Ergebnis eines Experiments, eine Pilz Entomoerreger als Endophyten zu etablieren. Unsere Ergebnisse zeigen die Inokulation Verfahren ist eines davon. Biologische Faktoren zu experimentieren sind die Pflanzenart oder Sorte ausgewählt und die Pilz Entomoerreger Arten Belastung oder isolieren. Andere Faktoren zu berücksichtigen Manipulation beinhalten die Konzentration des Inokulums, das Alter der Anlage während Impfungen und der Anlage Anbaubedingungen. Es wäre ideal für eine Impfung Methode der systemischen pflanzlichen Kolonisation durch eine Pilz Entomoerreger 14,17,18,21 führen. Stattdessen geht hervor, dass Methoden zur Inokulation ein spezifisches Muster von lokalen Kolonisierung bevorzugen. In Kaffee beispielsweise begünstigen Blattsprays Blatt Kolonisierung Erwägung Boden Drenchen Wurzelbesiedlung 17 begünstigen. Wir fanden das gleiche Muster in der gemeinsamen Bohne. Letztlich sollte die Wahl der Impfung Methodegeleitet von dem vorgesehenen Standort des Endophyten innerhalb einer Anlage, vermutlich passenden Nische des Ziels Herbivore oder Pflanzenpathogen. Obwohl häufig verwendet, Endophyten Detektion und Quantifizierung basierend auf Medienkulturen kann teuer werden, schwierig und fehleranfällig. Beispielsweise wurden insgesamt 10.800 Teilanlagen (plattiert auf Petrischalen 1800) in einem Experiment evaluiert nach B. optimieren bassiana Impfungen auf Banane 16. Von diesen wurden 4.496 Abschnitte durch eine vermeintliche B. kolonisiert bassiana, wie sie vor allem durch Kolonie Morphologie identifiziert. Natürlich wäre eine mikroskopische Überprüfung der Arten für jede Kolonie eine wünschenswerte, aber nicht finanzierbare Schritt. Auf der anderen Seite wurden 1176 Teile von anderen Pilzen besiedelt und wurden verworfen und behandelt wie fehlende Daten 16. Die Wahrscheinlichkeit besteht jedoch, dass B. bassiana war ein armer Konkurrenten oder langsamer zu wachsen, und konnte schließlich aus diesen Abschnitten entstanden sind, wenn einllowed genügend Zeit. Daher sind Endophyten Nachweisverfahren auf Medienkulturen Basis unterliegen falsche Positive und falsche Negative. Dementsprechend ist die Entwicklung zuverlässiger Nachweis und die Quantifizierung Methoden, beispielsweise solche auf Basis von Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Assays 20,21,24, ist gut begründet. Das ultimative Ziel für Impfversuche sollte es sein, eine effiziente Behandlung, die dauerhaft systemische Resistenz gegen Insektenfraß und / oder Krankheit zu entwickeln. Eine plausible, aber noch nicht getestet, ist Hypothese, dass das Ausmaß der endophytischen Kolonisierung sollte positiv korreliert mit dem Ausmaß der Endophyten-vermittelte Resistenz. Eine natürliche nächste Schritt nach Verfeinerung Impfung Methoden, daher könnte es sein, diesen Zusammenhang zu untersuchen. Mehrere Video-Protokolle können Forschern helfen entwerfen eine geeignete Resistenzassay für ein Ziel Schädlings oder Krankheitserregers 29-31. Letztlich ist es dieser Assay, was den Erfolg der Inokula bestimmenmethode und die damit verbundene Potenzial für endophytischen biologische Kontrolle.

Fungal Entomopathogens sind wichtige Regulatoren der Insekten-Populationen mit erheblichem Potenzial als mycopesticides 1. Erst kürzlich haben jedoch gezeigt worden pilzlichen Entomoerreger als Endophyten, sowohl natürlich als auch in Reaktion auf verschiedene Methoden Inokulation 2 auftreten. Die ökologische Funktion der endophytischen Pilz Entomopathogens weitgehend unbekannt, aber einige Studien haben sie in das Pflanzenwachstum 3,4, Pflanzenfresser Widerstand 5-8 und Krankheitsresistenz 9,10 verwickelt. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, ein Pilz Entomoerreger als Endophyten einzuführen, in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) ist die am besten untersuchte endophytischen Pilz Entomoerreger 5-9,11-19, und es ist als kommerzielles mycopesticide. Inokulation Methoden getestet, um festzustellen <em&gt; B. bassiana als Endophyten sind Boden durchnässt 14,17, Samenbeschichtungen 18 und Tauchgänge 14, radicle Dressings 13,15, Wurzel und Rhizom Tauchgänge 11,16,18, Stammzellen-Injektionen 17, Blattsprays 14,17,20 und Blüten Sprays 19. Mit Hilfe dieser Methoden haben die Forscher B. eingeführt bassiana in Bananenblätter 11, bean 7, Kakao 13, Kaffee 17, Mais 7, Baumwolle 7, Dattelpalme 12, Jute 21, Schlafmohn 20, Kürbis 7, radiata Kiefer 18, Sorghum 14, Tomate 7 und Weizen 7. Neuere Erkenntnisse legen nahe, dass endophytischen B. bassiana hat das Potential, nicht nur aus Pflanzen Arthropodenschädlinge 5-7,22-27 schützen, sondern auch aus einigen Pflanzenpathogene 9. Die gemeinsame Bohne (Phaseolus vulgaris) gehört zu den Pflanzen besonders anfällig für Schädlingeund Krankheiten. Es kann durch mehr als 400 Schädlinge und 200 Erreger, dessen Angriff wird angenommen, dass die Begrenzung der bean Produktionsfaktor in den Regionen 28 werden betroffen sein. Dementsprechend kann der gemeine Bohne ein hervorragendes Modell Ernte sein, um das gesamte Spektrum der endophytischen biologische Kontrolle von B. zu untersuchen bassiana. Als ersten Schritt in diese Richtung, beschreibt dieser Artikel Blattsprays und Boden durchnässt als Impfung Methoden B.bassiana als Endophyten in der gemeinen Bohne vorstellen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Name des Reagenzes/Materials</td><td>Firmenkatalognummer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Edelagar</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale (100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Kartoffel-Dextrose-Agar</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Normales Bleichmittel (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfatsalz</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dreifache Quitte (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB Mikroskop</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

gründung fungal entomopathogens als endophyten: gegen endophytic biological control

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Beauveria bassiana eine Pilz Entomoerreger mit der Fähigkeit zu Pflanzen endophytisch kolonisieren. Als Endophyt, B. bassiana eine Rolle beim Schutz der Pflanzen vor Insektenfraß und Krankheit spielen. Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden B. etablieren bassiana endophytisch in der gemeinen Bohne (Phaseolus vulgaris), in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle. Die Pflanzen werden von der Oberfläche sterilisiert Samen für zwei Wochen, bevor er eine B. gewachsen bassiana Behandlung von 10 8 Sporen / ml (oder Wasser) angewendet entweder als Blattspray oder eines Bodens durchnässen. Zwei Wochen später werden die Pflanzen geerntet und ihre Blätter, Stängel und Wurzeln werden abgetastet, um endophytischen Pilzbesiedlung bewerten. Hierzu werden Proben einzeln sterilisiert Oberfläche geschnitten in mehrere Abschnitte und inkubiert in Kartoffeldextroseagar Medium für 20 Tage. Die Medien kontrolliert wird alle 2-3 Tage, um Pilz-Wachstum zu beobachtensociated mit Anlagenteilen und notieren das Auftreten von B. bassiana zu schätzen den Umfang ihrer endophytischen Kolonisation. Analysen der Impfung Erfolg vergleichen das Auftreten von B. bassiana innerhalb einer bestimmten Anlagenteil (dh Blätter, Stängel und Wurzeln) über Behandlungen und Kontrollen. Neben der Impfung Verfahren, das konkrete Ergebnis des Experiments kann auf die Zielkultur Art oder Sorte abhängen, belasten die Pilz Entomoerreger Arten oder isolieren verwendet, und die Pflanze Anbaubedingungen.

B. bassiana konnte endophytisch besiedeln P. vulgaris in Reaktion auf die Impfung nachgewiesen Behandlungen (Abbildung 1). Beide Blattsprays und Boden durchnässt führte endophytischen Besiedlung durch B. bassiana in über 80% der behandelten Pflanzen (Abbildung 2). Allerdings hing das Ausmaß der Besiedelung auf der Anlage Teil ausgewertet und die Impfung Methode verwendet. Leaves reagiert am besten auf spray Impfungen. Wurzeln, auf der anderen Seite, reagiert nur zu durchnässen Impfungen. Schließlich Stiele ähnlich beiden Inokulation Methoden reagiert. B. bassiana wurde in keinem der Steuerdaten Anlagenteile erfasst. Unabhängig von der Behandlung, mit Ausnahme von B. Endophyten bassiana wuchs von 15% der ausgewerteten Anlagenteile, aber sie wurden aus den Medien Platten zerlegt, bevor sie angrenzenden Abschnitte könnten eindringen und die Ergebnisse beeinflussen. Behandlung und Kontrolle Pflanzen waren sichtlich unterscheiden zwei Wochen nach Impfungen. Es wurden keine Unterschiede in ihrer Trockengewicht und in ihrer Höhe festgestellt. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse der Impfung Behandlungen auf endophytischen Kolonisierung der Bohne (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Durch Beauveria bassiana Oben links:. Kontrollplatten ohne Wachstum. Oben rechts: Fungal Endophyten aus einem Anlagenteil verunreinigen gesamte Platte. Unten links: B. bassiana wächst aus zwei Anlagenteilen. Unten rechts: Endophytic B. bassiana Konidien und Konidiophoren wie unter einem Mikroskop betrachtet. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Wirkung der Impfung Behandlungen auf endophytischen Kolonisierung bean (Phaseolus vulgaris cv. Calima) von Beauveria bassiana, zwei Wochen nach Impfung mit dem Stamm GHA. Prozent Kolonisierung repräsentiert die Anzahl der besiedelten Anlagenteilen durch die Anzahl der gebildeten Abschnitte unterteilt.

Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden, um den Pilz Entomoerreger einzuführen<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Als Endophyten in der gemeinsamen Bohne (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), In Vorbereitung für nachfolgende Auswertungen der endophytische biologischen Kontrolle.

Gründung Fungal Entomopathogens als Endophyten: Gegen Endophytic Biological Control

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

Hallo. Mein Name ist Ush Parsa und ich bin Entomologe bei SEA am Internationalen Zentrum für tropische Landwirtschaft. Ich bin ViiV Artiz, ebenfalls vom Internationalen Zentrum für tropische Landwirtschaft, und ich bin Fernando Vega vom Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten. Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, zu demonstrieren, wie die Etablierung eines pathogenen Pilzes gefördert und überprüft werden kann.Als Endophyt ist es in der Natur üblich, ein Insekt oder eine Milbe zu finden, die mit einem pathogenen Pilz infiziert ist, und es gibt eine lange Geschichte der Verwendung dieser pilzlichen Endoparasiten als biologische Pestizide. In jüngerer Zeit wurden pilzliche Endoparasiten gelegentlich auch bei der Infektion von Pflanzen gefunden, jedoch ohne offensichtliche Symptome ihrer Anwesenheit hervorzurufen. Diese Entdeckung deutet auf ihr Potenzial als schützende Endophyten gegen landwirtschaftliche Schädlinge hin.Um dieses Potenzial zu untersuchen, ist es zunächst unerlässlich, eine Inokulationsmethode zu entwickeln, die zuverlässig einen Pilzpathogen als Endophyten in einer Zielkultur etabliert. B. bassiana ist einer der am besten untersuchten Pilzpathogene und ist leicht als kommerzielles Pflanzenschutzmittel erhältlich. Dieser Pilz wurde als Endophyt in vielen Pflanzenarten nachgewiesen, darunter Bananen, Kaffee und Muskatnuss.Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass B. bassiana das Potenzial besitzt, Pflanzen nicht nur vor Arthropodenschädlingen, sondern auch vor einigen Pflanzenkrankheitserregern zu schützen. Die Mechanismen, die diesen breiten Schutz erklären, sind bisher nur unzureichend verstanden. Dennoch könnte der Einsatz im Bereich der Tropfbewässerung vielversprechend für Kulturen sein, die keine genetische Resistenz gegen einen Schädling oder Erreger aufweisen; besonders für Kulturen, die typischerweise gleichzeitig von mehreren Schadorganismen befallen werden, ist fas vulgaris ein herausragendes Beispiel.Es kann von mehr als 400 Schädlingen und 200 Krankheitserregern befallen werden, deren Angriffe als der am stärksten limitierende Faktor für die Bohnenerzeugung in verschiedenen Regionen gelten. Aus diesem Grund halten wir die Gemeine Bohne für eine geeignete Kulturpflanze, um das Schutzpotenzial von Endo bbar zu untersuchen. Als erster Schritt in diese Richtung demonstriert Arvid die Wirksamkeit von Blattspritzungen und Bodengüssen als Inokulationsmethoden, um Bana als Endophyten zu etablieren.Die Samen der Gemeinen Bohne von der Bohne namens TOMA werden durch zweiminütiges Eintauchen in 0,5 % Natriumhypochlorit oberflächensterilisiert, gefolgt von einem zweiminütigen Eintauchen in 70 % Ethanol und drei Spülungen mit steriler destillierter Wasser, um den Sterilisationserfolg zu überprüfen. Eine Probe von hundert Mikroliter des Spülwassers wird auf einer 100-Millimeter-Petri-Schale mit PDA-Medium ausgestrichen und 10 Tage lang im Dunkeln bei 25 Grad Celsius inkubiert. Das Experiment sollte abgebrochen und neu gestartet werden, wenn in diesen Kontrollen Wachstum beobachtet wird.Samen werden in Gruppen von jeweils drei in Töpfe mit einer Breite von 11,5 Zentimetern ausgesät, die eine dampfsterilisierte Mischung aus Erde und Sand im Verhältnis zwei zu eins enthalten. Die Pflanzen werden unter kontrollierten Bedingungen bei 25 °C, 50 % relativer Luftfeuchtigkeit und einem 12-Stunden-Photoperiode bei einer Lichtintensität von 9.200 Lux eine Woche nach der Keimung gezüchtet. Die Pflanzen werden auf je eine pro Topf ausgedünnt, um Vitalität sicherzustellen und Konkurrenz auszuschließen.Sie werden nach Bedarf alle zwei bis drei Tage bewässert und 10 und 20 Tage nach der Pflanzung mit einer wässrigen NPK-Düngerlösung von sechs Gramm pro Liter gedüngt. Um die genetische Uniformität unserer Pilze sicherzustellen, sollten Isolate aus einzelnen kanadischen Kulturen gezüchtet werden. Stellt man den Pilzursprung bei einem Insekt mit Mykose fest, bringt man das Exemplar in die laminare Luftströmungshaube und verwendet eine Inokulationsnadel, um eine kleine Probe des DYS-sporulierenden Pilzes auf PDA-Nährmedium zu übertragen.Weitere Übertragungen auf neue Nährbodenplatten können notwendig sein, um Kontaminationen zu entfernen, sobald ein Zielpilz in einer reinen Kultur wächst und Sporen bildet. Die kleine Probe von Kedia wird in einem Milliliter einer 0,1%igen Wasserlösung von Triton X-100 suspendiert und vortexiert. Triton X-100 ist ein Tensid, das die Oberflächenspannung von Wasser verringert und eine bessere Verteilung von Kedia ermöglicht. Ein 100-Mikroliter-Aliquot dieser Suspension wird auf einer 100-Millimeter-Petri-Schale ausgestrichen, die eine dünne Schicht aus 2,5% Noble Agar enthält, um die Visualisierung der Kedia unter dem Stereomikroskop zu ermöglichen.Die Platte wird 24 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, woraufhin ein einzelnes keimendes Pen-Medium in die Nährstoffplatte mit PDA überführt und drei bis vier Wochen lang wachsen gelassen wird, bis es die gesamte Nährstoffplatte und Spaten bedeckt. Diese Methode liefert eine Reinkultur des Pilzes für nachfolgende Experimente. Für diese Demonstration verwenden wir eine Reinkultur von Bavaria bassiana, Stamm GH HA, die aus dem kommerziellen Produkt Microt gewonnen wurde.Das Inokulum wird unter sterilen Bedingungen hergestellt. In einer sterilen Flusskammer verwenden wir einen sterilen Spatel, um etwa ein Gramm des Pilzwachstums von der Oberfläche des Mediums abzukratzen und in 10 Milliliter steriler 0,1 % Triton X zu suspendieren. Die Suspension wird eine Minute lang verwirbelt und durch steriles Mulltuch filtriert, um die Canadia von der Hy-Vee zu trennen. Dieser Schritt ergibt eine stückige Suspension, die auf eine Endkonzentration von 10 hoch acht Kedia pro Milliliter für die Inokulationen eingestellt werden muss.Zunächst wird die Konzentration der Stammlösung in einer seriellen Verdünnung geschätzt, die das Zählen der Kedia erleichtert. In einem Hema-Zytometer werden 100 Mikroliter der Stammlösung in 900 Mikroliter 0,1 % Triton X verdünnt und vortexiert, was einer Verdünnung 1:10 entspricht. Das Verfahren wird seriell dreimal zusätzlich wiederholt, um eine Verdünnung 1:10.000 zu erhalten.Kedia werden in der ersten Verdünnung in extrem hohen Zahlen und in der letzten Verdünnung in geringen Zahlen, die leicht gezählt werden können, vorhanden sein. Jede der beiden Kammern des Hema-Zytometers wird mit 10 Mikrolitern der 1:10.000-Verdünnung beladen und unter ein Mikroskop gebracht, um Kedia zu zählen. Der skalierte Bereich des Hema-Zytometers besteht aus neun großen Quadraten, von denen jedes 100 Nanoliter oder entsprechend 0,0001 Milliliter fasst.Zur Abschätzung der Konzentration von ED in der Probe zählen wir die ED in den vier großen Eckfeldern jeder Kammer, bilden den Durchschnitt und teilen diesen durch 0,0001. Durch Multiplikation dieser Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor 10.000 ergibt sich die Konzentration der Stammlösung, um nun das endgültige Volumen zu berechnen, auf das die Stammlösung eingestellt werden muss. Um den Inokulum von 10³⁸ ED pro Milliliter zu erhalten, wenden wir die Formel an.Das Endvolumen entspricht dem Produkt aus Bestandsvolumen und Bestandskonzentration dividiert durch die Endkonzentration. In unserer Demonstration muss der Bestand auf ein Endvolumen von 195,5 Milliliter eingestellt werden, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Vor der Verwendung des Inokulums ist es wichtig, einen Keimtest durchzuführen, um die Kanalviabilität zu bewerten.Für diesen Test geben wir 100 Mikroliter der 1:10.000-Verdünnung auf eine 100-Millimeter-Petri-Schale mit 2,5 % Noble-Agar oder Medium. Die Probe wird mit einem sterilen Glasstab auf der Oberfläche des Mediums verteilt und 24 Stunden im Dunkeln bei 25 Grad Celsius inkubiert. Die Lebensfähigkeit wird unter dem Mikroskop bewertet, indem der Prozentsatz der Kedia mit wachsendem Keimrohr geschätzt wird.Für drei zufällige Proben von jeweils 100 kanadischen Samen kann die kanadische Suspension nur verwendet werden, wenn die durchschnittliche Keimung über 90 % liegt. In dieser Demonstration beträgt die durchschnittliche Keimung 97 %. Wir werden zwei Inokulationsmethoden demonstrieren: Blattsprühungen und Bodengossungen, die beide angewendet werden, sobald die Pflanzen das Stadium des ersten echten Blattes erreicht haben. Ungefähr 14 Tage nach der Aussaat wird die Blattsprühmethode mit einem manuellen Zerstäuber durchgeführt, wobei die Suspension gezielt auf die adaxiale oder obere Blattoberfläche aufgebracht wird, bis diese gesättigt ist. Die Oberseite jedes Topfes wird mit Aluminiumfolie abgedeckt, um eine Abgabe der Suspension in den Boden zu verhindern. Nach dem Besprühen wird jede Pflanze 24 Stunden lang mit einer Plastiktüte abgedeckt, um eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, die die Pilzbesiedlung fördert.Die Bodenspül-Inokulationsmethode wird bei Wasserkapazität des Bodens durchgeführt. Etwa 24 Stunden nach der Bewässerung der Pflanzen bis zur Bodensättigung werden 10 Milliliter einer Zellsuspension auf die Oberfläche des Bodens aufgetragen. Am Pflanzenansatz erhalten die kontrollierten Pflanzen sterilisiertes 0,1 %iges Triton X, das auf dieselbe Weise wie bei den entsprechenden Behandlungen appliziert wird.Die Pflanzen werden in Wachstumskammern zurückgestellt und in einem randomisierten vollständigen Blockdesign mit drei Wiederholungen pro Behandlung angeordnet. Die Etablierung wurde zwei Wochen nach den Inokulationen blockweise ausgewertet. Die Pflanzen werden sorgfältig geerntet und einzeln von jeder Pflanze unter fließendem Leitungswasser gewaschen.Es werden zwei Blättchen, zwei Wurzelstücke und zwei Stängelstücke entnommen. Die Blättchen werden zufällig aus dem ersten echten Blatt der Pflanze ausgewählt und zu quadratischen Stücken zugeschnitten. Proben mit einer Länge von etwa drei Zentimetern werden aus der Mitte der Pflanze sowie nahe der Bodenoberfläche entnommen. Pfahlwurzelproben ähnlicher Länge werden aus der Mitte der Wurzel sowie einen Zentimeter hinter der Wurzelspitze entnommen.Jede Probe wird einzeln in einer sterilen Haube zwei Minuten lang in 0,5 %iger Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert, anschließend zwei Minuten in 70 %igem Ethanol behandelt und dreimal mit steriler destillierter Wasser gespült, bevor sie trocknen gelassen wird. Auf steriler Papiertuchunterlage wird die sterilisierte Probe dann vorsichtig disseziert, um ihren äußeren Rand zu entfernen, wo Endophyten durch den Kontakt mit Desinfektionsmitteln eventuell abgetötet wurden. Die zugeschnittene Probe wird danach in kleinere Stücke geschnitten, die durchschnittlich sechs mal sechs Millimeter bei Blättern beziehungsweise sechs Millimeter Länge bei Stängeln und Wurzeln betragen.Die Schnitte werden auf 60 Millimeter Petrischalen mit PDA, das mit den Antibiotika Tetracyclin, Streptomycin und Penicillin jeweils mit zwei Milligramm pro Liter ergänzt ist, ausgestrichen. Abschließend werden die Schalen mit Paraffin versiegelt und 10 Tage im Dunkeln bei 25 Grad Celsius inkubiert. Das Spülwasser wird nach der Bearbeitung jedes Blocks gewechselt, jedoch vor dem Ausstrich einer 100-Mikroliter-Probe auf eine 100-Millimeter-Petrischale mit PDA-Medium, die dann 10 Tage bei 25 Grad Celsius inkubiert wird, um zu überprüfen, ob die Seriendilution erfolgreich war.Wenn bei dieser Kontrolle ein Wachstum festgestellt wird, wird der Block verworfen und nicht weiter berücksichtigt. Die Platten werden über einen Zeitraum von 20 Tagen alle zwei bis drei Tage auf Pilzwachstum untersucht und dokumentiert. Besiedelte Pflanzenteile werden einzeln ausgeschnitten und auf neue Nährbodenplatten übertragen, um eine Kontamination benachbarter Abschnitte zu vermeiden.Das Wachstum von B. bassiana wird anhand charakteristischer weißer, dichter Myzelien aufgezeichnet, die sich am Rand cremefarben bis blassgelb verfärben. Bei Unsicherheit wird die Probe am selben Tag, an dem die Besiedlung bewertet wird, in einem Wassertropfen auf einem Lichtmikroskop präpariert und auf die für die Art typische globale Scannia- und Zickzackform der Kedia-Kraft untersucht. Außerdem schätzen wir die Auswirkungen unserer Behandlungen auf das Pflanzenwachstum ein.Wir messen zunächst die Pflanzenhöhe von der Basis der Pflanze bis zur Spitze des Wachstumspunkts. Anschließend ziehen wir die Pflanzen vorsichtig aus und waschen sie mit Leitungswasser, lassen sie dann drei Tage lang bei 45 Grad Celsius trocknen, um ihr Trockengewicht zu bestimmen. Für diese Demonstration haben wir das gesamte Experiment zweimal durchgeführt, um repräsentative Ergebnisse zu erhalten.Beide Inokulationsmethoden führten bei über 80 % der behandelten Pflanzen zur Besiedlung durch Bana. Allerdings hing das Ausmaß der Kolonisation vom untersuchten Pflanzenteil und der verwendeten Inokulationsmethode ab. Die Sprosse zeigten die beste Reaktion.Sprühinokulationen der Wurzeln hingegen reagierten nur auf Gießinokulationen. Stängel reagierten schließlich auf beide Inokulationsmethoden ähnlich. Bana wurde in keiner der kontrollierten Pflanzensektionen nachgewiesen, unabhängig von der Behandlung; Endophyten außer Bana wurden aus 15 % der untersuchten Pflanzensektionen isoliert, wurden jedoch von den Kulturplatten entfernt, bevor sie benachbarte Sektionen besiedeln und unsere Ergebnisse beeinflussen konnten.Behandelte und unbehandelte Pflanzen waren zwei Wochen nach der Inokulation optisch nicht voneinander zu unterscheiden, und es wurden keine signifikanten Unterschiede in ihrem Trockengewicht und ihrer Höhe festgestellt. Viele Faktoren können ein bestimmtes Versuchsergebnis beeinflussen, wenn ein Endophytenpathogen als Endeffekt etabliert werden soll. Wie dieses Video zeigt, ist die Inokulationsmethode einer dieser biologischen Faktoren; weitere biologische Faktoren, die variiert werden können, umfassen die ausgewählte Pflanzenart oder Kulturform sowie die Wahl der OMA-Pathogenart oder des Isolats. Weitere zu berücksichtigende Faktoren, die gezielt verändert werden können, sind die Konzentration des Inokulums, das Alter der Pflanze während der Inokulation sowie die Wachstumsbedingungen der Pflanze.Das endgültige Ziel dieser Experimente sollte die Entwicklung einer effizienten Behandlung sein, die eine dauerhafte systemische Resistenz gegen INE oder Krankheiten bietet. Wenn Sie bereit sind, die auf Endophyten vermittelte Resistenz zu testen, empfehlen wir Ihnen, ein Video anzusehen, das die Mechanismen der pflanzlichen Resistenz charakterisiert und ebenfalls im Journal of Visualized Experiments veröffentlicht wurde. Bitte beachten Sie, dass Endophyten in Pflanzen sehr verbreitet sind und wahrscheinlich Ihre Fähigkeit beeinflussen, einen Ziel-Pilzpathogen als Endophyt dauerhaft zu etablieren und nachzuweisen.Wir hoffen, dass diese Demonstration für Sie hilfreich ist. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Entwicklung von<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Als Mycoinsektizid: Von der Isolation bis zur Field Performance

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