Gründung Fungal Entomopathogens als Endophyten: Gegen Endophytic Biological Control

Hi.My Name ist Ush Parsa und ich bin Entomologe am SEA am International Center for Tropical Agriculture. Ich bin ViiV Artiz, ebenfalls vom International Center for Tropical Agriculture, und ich bin Fernando Vega vom Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten. Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, zu demonstrieren, wie die Etablierung eines Pilzes als Krankheitserreger erleichtert und überprüft werden kann.

Als Endophyt ist es in der Natur üblich, ein Insekt oder eine Milbe zu finden, die mit einem pathogenen Pilz infiziert sind, und es gibt eine lange Geschichte der Verwendung dieser Pilz- und Krankheitserreger als biologische Pestizide. In jüngerer Zeit wurden gelegentlich Pilz- und Krankheitserreger gefunden, die Pflanzen infizieren, ohne jedoch offensichtliche Symptome ihres Vorhandenseins hervorzurufen. Diese Entdeckung signalisiert ihren potenziellen Einsatz als schützende Endophyten gegen landwirtschaftliche Schädlinge.

Um dieses Potenzial zu erforschen, ist es zunächst unerlässlich, eine Impfmethode zu entwickeln, die einen pilzlichen Krankheitserreger zuverlässig als Endophyten in einer Zielkultur etabliert. B Bassiana ist einer der am besten untersuchten Pilzpathogene und ist als kommerzielles Pestizid leicht erhältlich. Dieser Pilz wurde als Endophyt in vielen Pflanzenarten nachgewiesen, darunter Bananen, Kaffee und Muskatblüte.

Jüngste Hinweise auf die B-bassiana deuten darauf hin, dass sie das Potenzial haben, Pflanzen nicht nur vor Arthropodenschädlingen, sondern auch vor einigen Pflanzenpathogenen zu schützen. Die Mechanismen, die diesen Breitbandschutz erklären, sind kaum verstanden. Noch im Bereich der Tic-Ventile kann es vielversprechend sein für Pflanzen, denen es an genetischer Resistenz gegen einen Schädling oder Krankheitserreger mangelt, aber für Pflanzen, die typischerweise unter dem gleichzeitigen Angriff mehrerer Feinde leiden, ist die häufige Fas vulgaris ein Paradebeispiel.

Sie kann von mehr als 400 Schädlingen und 200 Krankheitserregern befallen werden, deren Befall in allen Regionen als der am stärksten einschränkende Faktor für die Bohnenproduktion gilt. Aus diesem Grund sind wir der Meinung, dass die gemeine Pflanze ein guter Kandidat sein könnte, um das geschützte Potenzial von Endo bbar zu untersuchen. Als ersten Schritt in diese Richtung demonstriert Arvid die Wirksamkeit von Blattsprays und Bodentränkungen als Inokulationsmethoden, um Bana als Endophyten zu etablieren.

In den gewöhnlichen Bohnensamen aus der Bohne namens TOMA werden die Oberfläche durch ein zweiminütiges Eintauchen in 0,5% Natriumhypochlorit, gefolgt von einem zweiminütigen Eintauchen in 70% Ethanol und drei Spülungen in sterilem destilliertem Wasser zum Theoretisierungserfolg sterilisiert. Eine hundert Mikroliter große Probe des Spülwassers wird auf einer 100 Millimeter großen Petriplatte mit PDA-Medien plattiert und 10 Tage lang im Dunkeln bei 25 Grad Celsius inkubiert. Das Experiment sollte abgebrochen und neu gestartet werden, wenn bei diesen Kontrollen ein Wachstum zu beobachten ist.

Die Samen werden in Dreiergruppen in 11,5 Zentimeter breite Töpfe genäht, die eine dampfsterilisierte Mischung aus Erde und Sand im Verhältnis zwei zu eins enthalten. Die Pflanzen werden unter kontrollierten Bedingungen bei 25 Grad Celsius, 50% relativer Luftfeuchtigkeit und einer 12-stündigen Fotoperiode mit einer Lichtintensität von 9.200 Lux pro Woche nach der Keimung angebaut. Die Pflanzen sind dünn bis zu einer pro Topf, um die Vitalität zu gewährleisten und Konkurrenz zu eliminieren.

Sie werden alle zwei bis drei Tage nach Bedarf bewässert und 10 bis 20 Tage nach der Pflanzung mit einer Wasserlösung von NPK-Dünger von sechs Riesen pro Liter gedüngt. Um die genetische Einheitlichkeit unserer Pilze zu gewährleisten, sollten die Isolate aus einzelnen kanadischen Kulturen gezüchtet werden. Wenn die Quelle des Pilzes ein Insekt mit Mykose ist, bringen wir die Probe zur Laminar-Flow-Haube und verwenden eine Impfschlaufe, um eine kleine Probe des DYS-sporulierenden Pilzes auf PDA-Medien zu übertragen.

Nachträgliche Übertragungen auf neue Medienplatten können erforderlich sein, um Verunreinigungen zu entfernen, sobald ein Zielpilz wächst und sich in einer sauberen Kultur vermehrt. Die kleine Probe von Edia, die in einem Milliliter einer 0,1%igen Wasserlösung aus Triton X 100 und Vortex tritton Exus suspendiert ist, ist ein Tensid, das die Oberflächenspannung des Wassers reduziert und die Dispergierung von Kedia ermöglicht. Ein 100-Mikroliter-Aliquot dieser Suspension wird auf eine 100-Millimeter-Petriplatte verteilt, die eine dünne Schicht von 2,5 % edlem Hektar enthält, was die Visualisierung von Kedia auf ihrem Stereoskop ermöglicht.

Die Platte wird 24 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, danach wird ein einzelnes keimendes Stiftmedium mit PDA in die Medienplatte überführt und drei bis vier Wochen lang wachsen gelassen, bis es die gesamte Medienplatte bedeckt und spritzt. Diese Methode ermöglicht eine Reinkultur des Pilzes für nachfolgende Experimente. Für diese Demonstration verwenden wir eine Reinkultur von Bavaria Bassiana, einem Stamm GH HA, der aus dem kommerziellen Produkt Microt gewonnen wird.

Das Inokulum wird unter sterilen Bedingungen hergestellt. In einer Laminar-Flow-Haube kratzen wir mit einem sterilen Spatel etwa ein Gramm des Pilzwachstums von der Oberfläche des Mediums ab und suspendieren es in 10 Millilitern sterilem 0,1%igem Triton X. Die Suspension wird eine Minute lang vortexen und durch ein steriles Käsetuch filtriert, um die Canadia vom Hy-Vee zu trennen. Dieser Schritt führt zu einer festsitzenden Suspension, die für Impfungen auf eine Endkonzentration von 10 bis acht Kedia pro Milliliter eingestellt werden muss.

Zunächst wird die Konzentration der Aktie in einer seriellen Verdünnung geschätzt, die das Zählen von Kedia erleichtert. In einem Hema-Zytometer werden 100 Mikroliter des Stoffes in 900 Mikrolitern 0,1 %Triton X verdünnt und vortex, was zu einer Verdünnung von eins zu 10 führt. Das Verfahren wird drei weitere Male seriell wiederholt, um eine Verdünnung von eins zu 10.000 zu erhalten.

Kedia ist in der ersten Verdünnung in extrem hohen Mengen und in geringen Zahlen, die in der letzten Verdünnung leicht gezählt werden können, vorhanden. Jede der beiden Kammern des Hema-Zytometers wird mit 10 Mikrolitern einer Verdünnung von eins zu 10.000 beladen und unter ein Mikroskop gelegt, um Kedia zu zählen. Die Regelfläche des Hema Cytometers besteht aus neun großen Quadraten, die jeweils 100 Nanoliter bzw. 0,0001 Milliliter fassen.

Um die ED-Konzentration in der Probe zu schätzen, zählen und mitteln wir die ED in den vier großen Eckquadraten jeder Kammer und dividieren diesen Durchschnitt durch 0,0001. Multipliziert man diese Konzentration mit unserem Verdünnungsfaktor 10.000, erhält man nun die Konzentration des Lagerbestands, um das endgültige Volumen zu berechnen, an das ein Stamm angepasst werden muss. Um das Inokulum von 10 38 Edia pro Milliliter zu erhalten, wenden wir die Formel an.

Das Endvolumen entspricht dem Bestandsvolumen multipliziert mit der Bestandskonzentration gegenüber der Endkonzentration. In unserer Demonstration muss der Bestand auf ein Endvolumen von 195,5 Millilitern eingestellt werden, um die gewünschte Konzentration zu erhalten. Vor der Verwendung des Inokulums ist es wichtig, einen Keimtest durchzuführen, um die Lebensfähigkeit des Kanals zu beurteilen.

Für diesen Test geben wir 100 Mikroliter der 1 zu 10.000 Verdünnung auf eine 100 Millimeter Petriplatte mit 2,5 % Edelei oder -medium. Die Probe wird mit einem sterilen Glasstab in die Oberfläche des Mediums eingebracht und im Dunkeln bei 25 Grad Celsius für 24 Stunden inkubiert. Die Lebensfähigkeit wird unter dem Mikroskop bewertet, indem der Prozentsatz von Kedia mit wachsendem Keimschlauch

Bei drei Zufallsstichproben von 100 kanadischen Sorten kann die kanadische Suspension nur dann für Impfungen verwendet werden, wenn die durchschnittliche Keimung über 90 % liegt. In dieser Demonstration finden wir eine durchschnittliche Keimung von 97 %. Wir werden zwei Inokulationsmethoden demonstrieren, Blattsprays und Bodentränke, die beide angewendet werden, wenn die Pflanzen ihr erstes echtes Blattstadium erreichen. Etwa 14 Tage nach der Pflanzung wird die Blattsprühmethode mit einem manuellen Zerstäuber durchgeführt, der die Suspension auf die obere Oberfläche der Blätter leitet, bis sie gesättigt sind. Die Oberseite jedes Topfes ist mit Aluminiumfolie abgedeckt, um einen konalen Abfluss in den Boden zu verhindern. Nach dem Sprühen wird jede Pflanze 24 Stunden lang mit einer Plastiktüte abgedeckt, um eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten und das Eindringen von Pilzen zu erleichtern.

Die Methode der Bodenbewässerung wird bei Bodenwasserkapazität durchgeführt. Etwa 24 Stunden nach dem Gießen der Pflanzen bis zur Bodensättigung werden 10 Milliliter einer zialen Suspension auf die Oberfläche des Bodens aufgetragen. An der Basis der kontrollierten Pflanze erhalten Sie ein steriles 0,1%Tritton X, das auf die gleiche Weise wie bei den entsprechenden Behandlungen angewendet wird.

Die Pflanzen werden in die Wachstumskammern zurückgebracht und in einem randomisierten vollständigen Blockdesign mit drei Replikaten pro Behandlung angeordnet. Wir bewerteten die Einrichtung zwei Wochen nach der Impfung Block für Block. Die Pflanzen werden sorgfältig geerntet und von jeder Pflanze einzeln unter fließendem Leitungswasser gewaschen.

Wir beproben zwei Blättchen, zwei Wurzel- und zwei Stängelblättchen werden nach dem Zufallsprinzip aus dem ersten echten Blatt der Pflanze ausgewählt und auf quadratische Stängel gekürzt. Etwa drei Zentimeter lange Proben werden aus der Mitte der Pflanze und aus der Nähe der Bodenoberfläche entnommen. Pfahlwurzelproben ähnlicher Länge werden aus der Mitte der Wurzel und aus einem Zentimeter hinter der Wurzelspitze gewonnen.

Jede Probe wird einzeln in einer sterilen Haube zwei Minuten lang in 0,5 % Natriumhypochlorit oberflächensterilisiert, gefolgt von 70 % Ethanol für zwei Minuten und dreimal mit sterilem destilliertem Wasser gespült, bevor sie getrocknet wird. In sterilem Handtuchpapier wird die sterilisierte Probe dann vorsichtig präpariert, um ihren äußeren Rand zu entfernen, an dem Endophyten durch den Kontakt mit Desinfektionsmitteln eliminiert worden sein könnten. Die Schnittprobe wird dann in kleinere Abschnitte geschnitten, die bei den Blättern durchschnittlich sechs mal sechs Millimeter groß und bei Stängeln und Wurzeln sechs Millimeter lang sind.

Die Schnitte werden auf 60-Millimeter-Petriplatten plattiert, die PDA enthalten, das mit den Antibiotika Tetracyclin wie Streptomycin und Penicillin zu je zwei Milligramm pro Liter ergänzt wird. Zum Schluss werden die Platten mit Paraffin versiegelt und im Dunkeln bei 25 Grad Celsius inkubiert. Das Spülwasser wird nach der Verarbeitung jedes Blocks gewechselt, aber bevor eine 100-Mikroliter-Probe auf eine 100-Millimeter-Petriplatte, PDA-Medien plattiert und 10 Tage lang bei 25 Grad Celsius inkubiert wird, um festzustellen, ob die Serialisierung erfolgreich war.

Wenn bei diesem Steuerelement ein Wachstum festgestellt wird, wird der Block verworfen und nicht für die Analyse berücksichtigt. Die Platten werden 20 Tage lang alle zwei bis drei Tage inspiziert, um das Pilzwachstum zu beobachten und zu dokumentieren. Besiedelte Pflanzenteile werden herausgeschnitten und einzeln auf neue Medienplatten übertragen, um eine Kontamination benachbarter Abschnitte zu vermeiden.

Das Wachstum von B bassiana wird auf der Grundlage eines charakteristischen weißen, dichten Myzels aufgezeichnet, das am Rand creme- bis blassgelb wird. Im Zweifelsfall wird die Probe in einen Wassertropfen auf ein Mikroskoplicht gelegt und am selben Tag, an dem die Besiedlung ausgewertet wird, auf die für die Art charakteristische globale Scania und Zickzackform Kedia-Kraft untersucht. Wir schätzen auch die Auswirkungen unserer Behandlungen auf das Pflanzenwachstum ab.

Wir messen zuerst die Pflanzenhöhe von der Basis der Pflanze bis zur Spitze des Wachstumspunktes. Dann entwurzeln und waschen wir die Pflanzen vorsichtig in Leitungswasser und lassen sie drei Tage lang bei 45 Grad Celsius trocknen, um ihr Trockengewicht zu messen. Für diese Demonstration haben wir das gesamte Experiment zweimal durchgeführt, um repräsentative Ergebnisse zu erhalten.

Beide Inokulationsmethoden führten bei über 80% der behandelten Pflanzen zur Physikalisierung durch Bana. Das Ausmaß der Besiedlung hängt jedoch vom bewerteten Pflanzenteil und der verwendeten Inokulationsmethode ab. Leads reagierten am besten.

Sprühimpfungen sprachen dagegen nur auf Drench-Impfungen an. Schließlich reagierten die Stängel auf beide Inokulationsmethoden ähnlich. Bana wurde in keinem der kontrollierten Pflanzenabschnitte unabhängig von den Behandlungsendophyten nachgewiesen, mit Ausnahme von Bana, die aus 15% der untersuchten Pflanzenabschnitte gruppiert wurden, aber sie wurden aus den Medienplatten herausseziert, bevor sie in benachbarte Abschnitte eindringen und unsere Ergebnisse beeinflussen konnten.

Behandlungs- und Kontrollpflanzen waren zwei Wochen nach der Impfung sichtbar nicht zu unterscheiden, und es wurden keine signifikanten Unterschiede in ihrem Trockengewicht und ihrer Höhe festgestellt. Viele Faktoren können ein bestimmtes Ergebnis eines Experiments beeinflussen, um den Endo-Erreger als Endeffekt zu etablieren. Wie dieses Video zeigt, ist die Inokulationsmethode einer der biologischen Faktoren, mit denen experimentiert werden kann, einschließlich der ausgewählten Pflanzenart oder Sorte und der Wahl der OMA-Erregerart oder des Isolats. Zu den Faktoren, die manipuliert werden sollten, gehören die Konzentration des Inokulums, das Alter der Pflanze während der Inokulation und die Wachstumsbedingungen der Pflanze.

Das ultimative Ziel dieser Experimente sollte es sein, eine effiziente Behandlung zu entwickeln, die eine dauerhafte systemische Resistenz gegen INE oder Krankheiten bietet. Wenn Sie bereit sind, auf Endof-Kampf-vermittelte Resistenz zu testen, empfehlen wir Ihnen, sich ein Video zur Charakterisierung pflanzlicher Resistenzmechanismen anzusehen, das ebenfalls im Journal of Visuald Experiments veröffentlicht wurde. Bitte beachten Sie, dass Endophyten in Pflanzen sehr häufig vorkommen und wahrscheinlich Ihre Fähigkeit beeinflussen, dauerhaft ein Zielpilz zu etablieren und zu erkennen, das als Endo-Kampf

Wir hoffen, dass wir diese Demonstration nützlich finden. Viel Glück bei Ihren Experimenten.