Cokultur Analyse der extrazellulären Protein Wechselwirkungen, die Insulinsekretion durch Betazellen des Pankreas

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu untersuchen, wie transzelluläre Wechselwirkungen, an denen die extrazellulären Domänen spezifischer Transmembranproteine beteiligt sind, die Funktion der Betazellen und insbesondere die Insulinsekretion beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Säugetierzelllinie durchtrennt wird, wobei im zweiten Schritt ein Plasmid vorhanden ist, das das interessierende Protein enthält. Eine Betazelllinie wird mit den Säugetierzellen co-kultiviert.

Im letzten Schritt wird die Co-Kultur in Medien mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen inkubiert, um die Beurteilung der glukosestimulierten Insulinsekretion zu ermöglichen. Letztendlich werden Insulin-Radio-Immunoassays oder Eliza-Immunoassays verwendet, um die Insulinspiegel zu bestimmen, die von den kultivierten Betazellen in die Medien ausgeschieden werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. Genüberexpression und Knockdown, besteht darin, dass sie eine Störung der mRNA- und Proteinexpression vermeidet, die möglicherweise die Gesundheit und/oder Funktion der Betazellen in einer Weise beeinträchtigt, die die Analyse der spezifischen Interaktion des Proteins verwirren kann.

Beginnen Sie mit dem Übertragen der HEC 2 93-Zellen auf eine 24-Well-Platte mit 0,5 Millilitern HEC 2 93-Medium pro Well, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über den Boden der Platte verteilt sind. Schütteln Sie die Platte jeweils entlang einer Achse mit einer Geschwindigkeit, die synchron zu der im Well gebildeten Welle ist. Wenn die HEC 2 93-Zellen eine Co-Flüssigkeit von 100 % erreichen, transfizieren die Kulturen mit 0,8 Mikrogramm des Plasmids, das für das interessierende Protein kodiert, in zwei Mikrolitern Lipo 2000.

Gemäß dem Lipo-Protokoll wird hier das Gesamtschema der zu demonstrierenden Co-Kultur unter Verwendung eines nicht-enzymatischen Zellentferners dargestellt. Beginnen Sie diesen Schritt mit der Entnahme von INS-1-Zellen mit einer Konfluenz von etwa 70 bis 80 % vom Boden eines T 75-Kulturkolbens. Nachdem Sie die Zellen drei Minuten lang bei 150 g bei Raumtemperatur heruntergeschleudert haben, verwenden Sie eine P 1000-Pipette, um das Pellet in einem Milliliter halb INS eineinhalb zu resuspendieren.

Das Medium verwendet dann eine 10-Milliliter-Pipette, um weitere 24 Milliliter Mischmedium hinzuzufügen und die Zellen wiederzubeleben, und aspiriert das Medium aus den Vertiefungen der 24-Well-Platte, die die HEC 2, 9, 3-Zellen enthält. Geben Sie dann mit einer P 1000-Pipette vorsichtig 500 Mikroliter der INS-Einzelzellsuspension auf die Hex-Zellschicht entlang der Seiten der Vertiefung. Verwenden Sie nach jeweils sechs Vertiefungen eine 10-Milliliter-Pipette, um die INS-One-Zellen wieder zu suspendieren.

Nochmals, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen nun je nach Versuchsprotokoll 24 bis 48 Stunden lang. Nachdem die Zellen für den gewünschten Versuchszeitraum inkubiert wurden, eine Vertiefung nach der anderen, aspirieren Sie das Co-Kulturmedium mit einer Hand und ersetzen Sie das Medium sofort durch 250 Mikroliter 2,5 Millimolare Glukose in Krebsringer-Bicarbonatpuffer mit der anderen.

Nachdem Sie die Co-Kulturen eine Stunde lang vorinkubiert haben, tauschen Sie den KRB-Puffer mit niedrigem Glukosegehalt gegen 250 Mikroliter entweder 2,5 Millimolare oder 20 Millimolare Glukose aus. Nach einer weiteren Stunde Inkubation überführen Sie den KRB-Puffer in Mikrofuge-Röhrchen und schleudern den Puffer fünf Minuten lang bei 1500 g und vier Grad Celsius herunter, während sich die Röhrchen in der Zentrifuge befinden. Geben Sie sofort 100 Mikroliter Rippa-Zell-Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren in die Platte und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Wenn die Röhrchen fertig gedreht sind, entfernen Sie 200 Mikroliter des Überstands für die spätere Analyse mit einem Insulin-Radioimmunoassay oder Eliza. Zum Schluss wird das, was jetzt Zelllysat ist, 15 Minuten lang bei 10.000 g heruntergeschleudert und dann 50 Mikroliter des SNAT zur Analyse durch Insulin-Radioimmunoassay oder Eliza entnommen. Hier werden die Ergebnisse gezeigt, die aus der Co-Kultur von INS-1-Betazellen mit HC 2 93-Zellen erhalten wurden, die transfiziert wurden, um eine Neuroliggen-Isoform zu exprimieren, die hier als NLX bezeichnet wird.

Die Expression von NLX erhöhte die basale und stimulierte Insulinsekretion durch co-kultivierte I NS one Zellen. Die extrazelluläre NX-Domäne muss mit einem anderen Protein oder Molekül auf der Oberfläche von I NS eins interagieren, um die INS-Zellen dazu zu bringen, mehr Insulin auszuschütten. Die Ergebnisse anderer Arten von Analysen mit dem Co-Kultur-System sind in den nächsten beiden Grafiken dargestellt.

In dieser ersten Grafik ist der Anstieg des Insulingehalts der kokultivierten INS-1-Zellen um NLY dargestellt. In diesem Experiment wurde RNA aus der Zellschicht entnommen und mit R-T-Q-P-C-R analysiert. Die Co-Kultur mit NLY erhöhte die Insulin- und PDX one mRNA-Spiegel.

Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden wie QPCR oder quantitative Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob extrazelluläre Wechselwirkungen des transfizierten Proteins Veränderungen in der Zellstruktur oder der Genexpression verursachen können.