Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, funktionelle, gewebetechnisch hergestellte Biokomposite für die Transplantation herzustellen. Dies wird erreicht, indem präziese uniaxiale oder biaxiale mechanische Dehnung angewendet wird, um Zellen in dreidimensionalen Biomaterialkompositen biophysikalische Stimuli zukommen zu lassen. In einem zweiten Schritt wird der Bioreaktor mit einer Kraftmessdose ausgestattet, die während der Belastung eine Kraft-Rückkopplung sowie mechanische Prüfung der Biokomposite ermöglicht.

Im Anschluss werden bio-komposite Materialien über einen Zeitraum von mehreren Wochen kultiviert, um makroskopische Veränderungen im biochemischen Gehalt und in der Festigkeit der Konstrukte hervorzurufen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Auswirkungen verschiedener Belastungsarten, basierend auf signifikanten Unterschieden im Gehalt an Glykosaminoglykanen und Kollagen, im Gerüst, in der Dicke und im Gleichgewichtsmodul. Obwohl diese Methode Einblicke in die Effekte biaxialer Belastung auf gewebetechnisch hergestelltes Knorpelgewebe ermöglicht, kann sie auch auf andere gering belastete Gewebe wie Knochen und Sehnen angewendet werden. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Amy May und Rob Stefani aus unserem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, richten Sie einen bi-axialen Bioreaktor wie hier gezeigt ein.

Die Basis des Bioreaktors besteht aus einer Aluminiumplatte mit den Maßen 25 Zentimeter mal 30 Zentimeter mal 12,5 Millimeter. Die variablen Positionierungsmöglichkeiten ermöglichen eine flexible Montage von Zellkulturplatten unterschiedlicher Form und Größe. Stellen Sie anschließend sicher, dass die Stufen so auf der Basis montiert sind, dass die horizontale Stufe dynamische Scherkräfte erzeugt, indem sie sich ausschließlich entlang der x-Achse hin- und herbewegt.

Und die vertikale Probe bietet eine dynamische Kompression, indem sie ausschließlich entlang der Z-Achse oszilliert. Der nächste Schritt besteht darin, eine kundenspezifische Belastungsplatte aus Polysulfon herzustellen. Das Polysulfon-Material ist ideal aufgrund seiner Biokompatibilität, der einfachen Bearbeitbarkeit und der leichten Sterilisierbarkeit.

Verbinden Sie die Platte mit der zweiachsigen beweglichen Plattform über eine präzise gefertigte Winkelhalterung. Die an der Grundplatte befestigten kinematischen Anschläge verfügen über Feineinstellschrauben, die eine exakte Ausrichtung der Kulturplatten ermöglichen, die von Hand nicht erreichbar wäre. Befestigen Sie anschließend den Schrittmotoraktuator an jeder Plattform, der Positions-Rückmeldesignale für die Software liefert.

Die hier gezeigten Schrittmotor-Aktuatoren weisen eine bidirektionale Wiederholgenauigkeit von 0,1 Mikrometer und eine Auflösung von 20 Nanometern auf, was einer Genauigkeit von weniger als drei Mikrometern über eine Hublänge von 50 Millimetern entspricht. Die Bewegungen der Stufen werden mithilfe der fortschrittlichen Positioniertechnologie-Software von Thor Labs gesteuert. Die Software steuert den Schrittmotor, um die Lastparameter Frequenz und Amplitude sowohl für Scher- als auch für Kompressionsbelastungen unabhängig und gleichzeitig anzupassen. Als Nächstes platzieren Sie eine miniaturisierte Lastzelle mit einer Kapazität von fünf Pfund zwischen der Ladeplatinen und der beweglichen Plattform, um die für die Erkennung des Kontakts zwischen der Platinen und den Konstrukten erforderliche Kraft-Rückkopplung bereitzustellen sowie die Belastungsantworten zu bewerten.

Stellen Sie sicher, dass die Kraftmessdose eine hohe Genauigkeit von 0,15 % bis 0,25 % der Endskala aufweist und dass die Anzeigeeinheit der Kraftmessdose einen RS-232-Port besitzt, um eine Datensammlung am Computer zu ermöglichen. Um die Proben in den Vertiefungen einer 24-Loch-Platte zu immobilisieren, bereiten Sie eine Form für ein 1,5 Millimeter dickes Agarose-Gel unter Verwendung eines Guss-Systems mit 1,5 Millimeter Abstandshaltern vor. Gießen Sie nach dem Zusammenbau eine 4 %ige Agarose-Lösung zwischen die beiden Glasplatten und lassen Sie das Gemisch abkühlen.

Entfernen Sie dann die obere Platte und stanzen Sie eine Scheibe mit einem Durchmesser von 16 Millimeter aus der Agarplatte. Stanzen Sie für jede Vertiefung in jeder Scheibe ein Loch aus, in das die Probe eingelegt wird. Legen Sie die fertigen Scheiben in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte.

Drücken Sie dann Gewebekonstrukte mit einer Dicke von 2,25 Millimetern und einem Durchmesser von fünf Millimetern in jeden der Gelhalter. Die Probe sollte aus der Oberseite jedes Aeros-Halters herausragen. Fügen Sie anschließend 1,5 Milliliter Kulturmedium in jedes Loch hinzu und setzen Sie den Deckel wieder auf.

Stellen Sie die Platte anschließend wieder in den Inkubator, bis die Probenbeladung erfolgen soll. Um die mechanische Beladung der Gewebekonstrukte zu beginnen, befestigen Sie die Aluminiumplatte am Kraftmessdorn und montieren Sie jederzeit eine sterile Platinspitze am vertikalen Stativ. Der Inkubator sollte unter Bedingungen geringer Luftfeuchtigkeit betrieben werden, um ein Versagen des Instruments zu verhindern.

Schalten Sie als Nächstes den Schrittmotor-Controller und den PC ein. Öffnen Sie das Benutzerprogramm für die fortgeschrittene Positioniertechnologie und wechseln Sie auf beiden Bildschirmen zur grafischen Steuerung. Drücken Sie die Schaltfläche „Home-Zero“, um beide Schrittmotoren in die Nullposition zu fahren, die als die oberste und am weitesten rechts liegende Position definiert ist.

Bereiten Sie die Proben zum Beladen vor, indem Sie etwas Medium aus jedem Brunnen entfernen, um ein Überlaufen während des mechanischen Beladens zu verhindern. Stellen Sie anschließend die 24-Loch-Platte in den Bioreaktor und richten Sie die Platte sorgfältig mit Hilfe von vier verstellbaren kinematischen Positionierelementen an dem Platin aus; achten Sie darauf, die Platte korrekt auszurichten. Richten Sie sie bündig mit der Vorderseite des Bioreaktorsockels im grafischen Steuerungsfenster aus.

Manuell feinjustieren. Passen Sie die Ausrichtung an, indem Sie auf das Positionsfeld klicken, um es horizontal zu verschieben. Wenn die Platte mit den Vertiefungen der Platte ausgerichtet ist, senken Sie die Platte ab, bis sie erstmals mit den Proben in Kontakt kommt.

Sobald die Ausgangsposition erreicht ist, wechseln Sie zum Reiter „Move Sequencer“ und laden Sie die gewünschte Bewegungssequenz, indem Sie auf „Load“ klicken, oder erstellen Sie Ihr eigenes Programm, wie im Textprotokoll beschrieben, das diesem Video beiliegt. Drücken Sie anschließend auf „Run“, um das Programm zu starten. Die Software steuert die Motoren an, um das gewünschte Konditionierungsregime auf die Proben anzuwenden.

Wenn das Programm beendet ist, heben Sie die Platte manuell an, sodass sie die Oberseite der Zellkulturplatte freigibt. Entfernen Sie dann die 24-Rad-Platte aus dem Bioreaktor und erneuern Sie das Medium. Entfernen Sie schließlich vorsichtig das Platin vom Kraftsensor und schalten Sie die Geräte aus.

Die Verwendung des in diesem Video beschriebenen biaxialen Bioreaktors hatte einen signifikanten Einfluss auf die Menge an Glykosaminoglykanen und Kollagen, die von Zellen in gewebetechnisch hergestellten Konstrukten sezerniert wurden. Die Konditionierung erfolgte fünf Tage pro Woche für drei Stunden pro Tag mit einer Kompressionsdehnung von 10 % und einer Scherdehnung von 5 % bei einem Hertz. Nach 30 Tagen Kultur war die Menge an Glykosaminoglykanen und Kollagen, die von Chondrozyten unter biaxialer Belastung sezerniert wurde, signifikant höher als bei Kontrollproben. Eine einaxiale Belastung erhöhte lediglich die Menge an Glykosaminoglykanen signifikant.

Zusätzlich erzeugte eine biaxiale Belastung dickere Konstrukte, zeigte jedoch keinen Einfluss auf die Elastizität der Konstrukte. Mit diesem Dosierungsprotokoll wurden nach 30 Tagen Konditionierung und Kultivierung Querschnitte der Gewebekonstrukte mit typischen Markern des Knorpels gefärbt, einschließlich Safranin O und Typ-II-Kollagen. Die drei verschiedenen Gruppen umfassten keine Konditionierung, einachsige Belastung und biaxiale Belastung.

Während alle Gruppen eine positive Färbung für Alcian-Blau und Safranin O zeigen, weisen die mit Bixi belasteten Proben im Vergleich zu den unbe- und einachsig belasteten Proben erhöhte Mengen an Kollagen Typ II auf. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie einachsige oder zweiachsige Belastungen auf sich entwickelnde, gewebetechnisch hergestellte Konstrukte angewendet werden können.