Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Herstellung von funktionellen Tissue-Engineering-Biokompositen für die Transplantation. Dies wird durch die Anwendung präziser uniaxialer oder bioaxialer mechanischer Dehnung erreicht, um Zellen in dreidimensionalen Biomaterial-Kompositen biophysikalische Reize zuzuführen. In einem zweiten Schritt wird der Bioreaktor mit einer Wägezelle ausgestattet, die eine Kraftrückmeldung und eine mechanische Prüfung der Biokomposite während der Belastung ermöglicht.

Als nächstes werden Biokomposite über einen Zeitraum von Wochen kultiviert, um makroskalige Veränderungen des biochemischen Gehalts und der Festigkeit des Konstrukts zu induzieren, es werden Ergebnisse erzielt, die die Wirkung verschiedener Arten der Belastung auf der Grundlage der signifikanten Unterschiede im Glykosaminoglykan- und Kollagengehalt, im Gerüst, in der Dicke und im Gleichgewichtsmodul zeigen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Auswirkungen der biaxialen Belastung auf künstlich hergestelltes Knorpelgewebe geben kann, kann sie auch auf andere niedrig tragende Gewebe wie Knochen und Sehnen angewendet werden, was zeigt, dass das Verfahren von Amy May und Rob Stefani aus unserem Labor durchgeführt wird. Um diesen Vorgang zu starten, richten Sie einen bioaxialen Bioreaktor ein, wie hier gezeigt.

Der Boden des Bioreaktors besteht aus einer Aluminiumplatte mit den Maßen 25 Zentimeter mal 30 Zentimeter mal 12,5 Millimeter. Die variablen Positionierungsmöglichkeiten ermöglichen eine flexible Montage von Gewebekulturplatten unterschiedlicher Formen und Größen. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Tische auf der Basis montiert sind, so dass der horizontale Tisch eine dynamische Scherung bietet, indem er nur entlang der x-Achse oszilliert.

Und der vertikale Tisch sorgt für dynamische Kompression, indem er nur entlang der Z-Achse oszilliert. Der nächste Schritt ist die Herstellung einer kundenspezifischen Polysulfon-Ladeplatte. Das Polysulfonmaterial ist aufgrund seiner Biokompatibilität, seiner einfachen Bearbeitung und seiner einfachen Sterilisation ideal.

Koppeln Sie die Platte, die biaxial bewegliche Plattform über einen präzisionsgefertigten rechtwinkligen Winkel. Die kinematischen Anschläge, die an der Grundplatte befestigt sind, verfügen über Feinjustierschrauben, um eine präzise Ausrichtung der Kulturplatten zu ermöglichen, die mit der Hand nicht erreichbar ist. Befestigen Sie als Nächstes den Schrittmotor-Aktuator an jeder Plattform, der eine Positionsrückmeldung für die Software erhält.

Die hier gezeigten Schrittmotoraktuatoren haben eine bidirektionale Wiederholgenauigkeit von 0,1 Mikrometern und eine Auflösung von 20 Nanometern, was einer Genauigkeit von weniger als drei Mikrometern entspricht. Über 50 Millimeter Verfahrweg steuern die Bewegungen der Tische mit der fortschrittlichen Positionierungstechnologie-Software von Thor Lab. Die Software steuert den Schrittmotor, um die Lastparameter der Frequenz und Amplitude sowohl der Scher- als auch der Kompression unabhängig voneinander und gleichzeitig einzustellen. Positionieren Sie als Nächstes eine fünf Pfund schwere Miniatur-Wägezelle zwischen dem Ladeplatin und der beweglichen Plattform, um das Kraftfeedback zu geben, das für die Erkennung des Kontakts zwischen dem Platin und den Konstrukten sowie für die Bewertung der Belastungsreaktionen erforderlich ist.

Stellen Sie sicher, dass die Wägezelle eine hohe Genauigkeit von 0,15 % bis 0,25 % des Skalenendwerts aufweist und dass die Anzeigeeinheit für die Wägezelle über einen RS 2 32-Anschluss verfügt, um die Datenerfassung auf einem Computer zu ermöglichen. Um die Proben in den Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu immobilisieren, bereiten Sie mit einem Gelgießsystem mit 1,5-Millimeter-Abstandshaltern eine Form für ein 1,5 Millimeter dickes Arous-Gel vor. Nach dem Zusammenbau eine Lösung von 4%aros zwischen die beiden Glasplatten gießen und die Mischung abkühlen lassen.

Entfernen Sie dann die Deckplatte und stanzen Sie eine Scheibe mit einem Durchmesser von 16 Millimetern aus der Agroplatte. Stanzen Sie für jede Vertiefungsprobe in jede Scheibe ein Loch, in das die Probe eingelegt werden soll. Legen Sie die fertigen Discs in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte.

Anschließend drücken Sie 2,25 Millimeter dicke Gewebekonstrukte mit einem Durchmesser von fünf Millimetern in jeden der Gelhalter. Die Probe sollte aus der Oberseite jedes Aeros-Halters herausragen. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter Nährmedium in jede Vertiefung und setzen Sie die Abdeckung wieder auf.

Legen Sie die Platte dann wieder in den Inkubator, bis es Zeit für die Probenbeladung ist. Um mit der mechanischen Beladung von Gewebekonstrukten zu beginnen, befestigen Sie die Aluminiumplatte an der Wägezelle und befestigen Sie jederzeit eine sterile Platinanordnung am vertikalen Tisch. Der Inkubator sollte bei niedriger Luftfeuchtigkeit betrieben werden, um einen Geräteausfall zu vermeiden.

Schalten Sie als Nächstes den Schrittmotor-Controller und den PC ein. Öffnen Sie das Anwenderprogramm Advanced Positioning Technology und gehen Sie auf beiden Bildschirmen auf die Registerkarte Grafische Steuerung. Drücken Sie die Home-Zero-Taste, um beide Schrittmotoren in die Nullposition zu schicken, die als obere und äußerste rechte Position definiert ist.

Bereiten Sie die Proben für die Beladung vor, indem Sie einige Medien aus jeder Vertiefung entfernen, um ein Überlaufen während der mechanischen Beladung zu verhindern. Setzen Sie dann die 24-Well-Platte in den Bioreaktor ein und richten Sie die Platte vorsichtig mit vier einstellbaren kinematischen Locatoren mit dem Platin aus, stellen Sie sicher, dass die Platte ausgerichtet ist. Bündig mit der Vorderseite des Bioreaktorbodens in der grafischen Bedienlasche.

Manuell in Ordnung. Passen Sie die Ausrichtung an, indem Sie auf das Positionsfeld klicken, um es horizontal zu verschieben. Wenn die Platte mit den Vertiefungen der Platte ausgerichtet ist, beginnen Sie, die Platte abzusenken, bis sie zum ersten Mal mit den Proben in Berührung kommt.

Sobald die Startposition erreicht ist, gehen Sie auf die Registerkarte Move-Sequenzer und laden Sie die gewünschte Move-Sequenz, indem Sie auf Load drücken oder erstellen Sie Ihr eigenes Programm, wie im Textprotokoll zu diesem Video beschrieben. Drücken Sie anschließend auf Ausführen, um das Programm zu starten. Die Software weist die Motoren an, das gewünschte Konditionierungsschema auf die Proben anzuwenden.

Wenn das Programm beendet ist, heben Sie die Platte manuell an, so dass sie die Oberseite der Gewebekulturplatte freigibt. Entfernen Sie dann die 24-Radplatte aus dem Bioreaktor und tauschen Sie das Medium aus. Entfernen Sie abschließend vorsichtig das Platin aus der Wägezelle und schalten Sie dann die Instrumente aus.

Die Verwendung des biaxialen Bioreaktors, der in diesem Video beschrieben wird, hatte einen signifikanten Einfluss auf die Menge an Glykosaminoglykanen und Kollagen, die von Zellen in Tissue-Engineering-Konstrukten sezerniert werden. Die Konditionierung fand an fünf Tagen in der Woche für drei Stunden pro Tag mit 10 % Kompressionsdehnung und 5 % Scherdehnung bei einem Hertz statt. Nach 30 Tagen in Kultur war die Menge an Glyko, Amin, Glykanen und Kollagen, die von Chondrozyten sezerniert wurden, signifikant höher als bei Kontrollproben. Eine einachsige Beladung erhöhte die Menge an Glykosemie-Glykanen nur signifikant.

Zusätzlich führte die biaxiale Belastung zu dickeren Konstrukten, zeigte aber keinen Einfluss auf die Elastizität der Konstrukte. Unter Verwendung dieses Dosierungsprotokolls wurden nach 30-tägiger Konditionierung und Kultur Querschnitte der Gewebekonstrukte mit typischen Knorpelmarkern gefärbt, einschließlich blauem Safran und o und Kollagen vom Typ 2. Die drei verschiedenen Gruppen umfassen keine Konditionierung, einachsige Belastung und biaxiale Belastung.

Während alle Gruppen eine positive Färbung für Aliumblau und Safran und O aufweisen, zeigen die bixi-geladenen Proben erhöhte Mengen an Kollagen vom Typ 2 im Vergleich zu den unbelasteten und uniaxial geladenen Proben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einachsige oder zweiachsige Lasten auf die Entwicklung von Tissue-Engineering-Konstrukten aufbringt.