Das Vorbereiten von histologischen Präparaten für die Lichtmikroskopie

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

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General Laboratory Techniques

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Histological Sample Preparation for Light Microscopy

1.10: Introduction to the Spectrophotometer

1.12: Introduction to Fluorescence Microscopy

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09:27 min

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October 09, 2012

Overview

Die Histologie ist die Wissenschaft von Zellen und Geweben mit Hilfe eines Lichtmikroskops. Die Vorbereitung von histologischen Präparaten variiert je nach Größe und Härte des Gewebe und je nach den zu erwartenden Nachbearbeitungsschritten, die zum Beispiel Einfärbungstechniken oder andere Anwendugen beinhalten können. Wie wir in diesem Video beschreiben, beginnt die Präparatvorbereitung normalerweise mit der Fixierung, um die Degradierung des Gewebes durch natürlich auftretende Enzyme, die von der Zelle freigesetzt werden, zu verhindern. Nach der Fixierung wird das Gewebe in Einbettmedium plaziert, das das Gewebe hinreichend strukturell unterstützt. Meistens ist das Einbettmedium Praffinwachs, aber andere Materialien wie zum Beispiel ein auf Glycerin beruhendes Gefriermedium oder Agar, können benutzt werden, um die Präparate für das Schneiden vorzubereiten. Das Schneiden passiert in einem Mikrotom oder einem anderen Schneidegerät, das dem Benutzer erlaubt den Gewebeblock in dünne Scheiben von ein paar Mikrometern bis ein paar Millimetern Dicke zu schneiden. Wenn das Präparat geschnitten ist, werden die Schnitte auf einem Objektträger befestigt und eingefärbt, um spezielle Eigenschaften des Präparats darzustellen, bevor diese mit dem Mikroskop aufgenommen werden.

Procedure

Histologie bezieht sich auf das Untersuchen der mikroskopischen Anatomie von Geweben und Zellen.

Gute histologische Präparatvorbereitung für die Lichtmikroskopie ist wichtig um qualitativ hochwertige Ergebnisse von Gewebepräparaten zu erhalten.

Es gibt drei Schritte, die fast alle histologischen Verfahren gemein haben. Zuerst wird das Gewebe zur Erhaltung und um die Zersetzung aufzuhalten fixiert. Danach wird das Gewebe in ein Material gelegt, das Gewebeeinbettmedium heißt und ähnliche mechanische Eigenschaften wie das Präparat selbst hat. Nach der Einbettung wird das Gewebe mit einem Mikrotom in dünne Scheiben geschnitten. Dieses Video beschreibt diese Schritte und einige andere Konzepte im Detail.

Die Fixierung von Geweben ist ein wichtiger Schritt, der die natürliche Struktur von Zellen und Gewebekomponenten bewahrt. Nach dem Zelltod setzen zelluläre Organellen natürliche Enzyme frei, die intrazelluläre und extrazelluläre Proteine zersetzen, die die Struktur der Zelle und des umliegenden Gewebes normalerweise erhalten. Die Fixierung verhindert diese Zersetzung durch die Hemmung dieser Enzyme und durch das Unkenntlich machen der Bindungsstellen dieser Enzyme.

Die zwei Hauptmechanismen der Fixierung sind die Quervernetzung und die Koagulation. Die Quervernetzung führt zum Enstehen einer kovalenten Bindung im Protein selbst und zwischen verschiedenen Proteinen.

Dies führt zur Versteifung des Gewebes und der daraus resultierenden Resistenz gegenüber der Zersetzung. Koagulation wird durch die Entwässerung der Proteine durch organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Ethanol, hervorgerufen. Diese Methode zerstört die tertiäre oder sekundäre Proteinstruktur, so dass hydrophobische Regionen an die Oberfläche gelangen. Die koagulative Fixierung kann dabei Helfen das das Einbettmedium, zum Beispiel Paraffinwachs, das Gewebe schneller durchdringt.

Eines der am häufigsten benutzten Fixierungsmittel ist Formalin, also Formaldehyd aufgelöst in Wasser. Während der Fixierung bindet sich das Formaldehyd an primäre Amine, zum Beispiel an solche die man an den Seitenketten der Aminosäuren Lysin und Glutamin findet. Dadurch bildet sich eine stabile Quervernetzung, die auch methylen-Brücke genannt wird. Dieser Prozess ist langsam und kann 1-2 Tage dauern.

Vor der Fixierung sollten ein paar Dinge bedacht werden. Zuerst muss die Diffusion der Probe beachtet werden. Fixierungsmittel diffusieren durch die Probe mit einer Geschwindigkeit, die mit dem Diffusionskoeffizienten des Fixierungsmittels multipliziert mit der Quadratwurzel der Zeit in Zusammenhang steht. Ein Fixierungsmittel das 1 h für 1mm braucht, braucht 25 Stunden für 5 mm. Wenn das Formalin in der Mitte des Gewebes angekommen ist, muss noch die Quervernetzung stattfinden. Deshalb sollten nur Proben mit maximal 4 mm Dicke verwendet werden, so dass die Fixierung in einer vernünftigen Zeitspanne stattfindet.

Zweitens sollten das Volumen und der pH-Wert des Fixierungsmittels beachtet werden. Das Volumenverhältnis von Fixierungsmittel zu Probe sollte mindestens 40:1 betragen, damit sich die Reagenz nicht verflüchtigt. Einige Fixierungsmittel funktionieren am besten in einem sauren pH-Bereich. Formalin hingegen wird am besten mit PBS verwendet, um einen neutralen pH-Wert beizubehalten. Dadurch wird keine überschüssige Säure produziert, die zu Artefakten im Gewebe führen kann.

Der nächste Schritt in der Präparatvorbereitung ist das Einbetten in einem Medium mit ähnlicher mechnischer Festigkeit wie das Gewebe selbst. Das Aussuchen des richtigen Einbettmediums ist wichtig, denn ein zu hartes oder zu weiches Medium kann zu Defekten während der Anfertigung der Schnitte führen. Das am häufigsten verwendeten Einbettmedium ist Paraffinwachs.

Vor der Paraffineinbettung müssen die Proben erst mit Ethanol und Xylenen dehydriert werden, wodurch das Wasser im Gewebe verdrängt wird. Danach wird warmer Paraffinwachs hinzugegeben. Nachdem der Wachs das Gewebe durchdrungen hat, wird es vorsichtig mit zuszätzlichem Wachs in einer Form übergossen. Danach wird das eingebettete Gewebe in eine Gewebekassette zum Schneiden gelegt.

Schneiden ist der Prozess bei dem die Gewebestücke in dünne Scheiben aus dem Gewebeblock geschnitten werden. Die Schnitte sind normalerweise etwa 4-10 µm dick und werden für die Lichtmikroskopie benutzt.

Beim Schneiden wird zuerst die Metall, Glas oder Diamantklinge im Mikrotom gesichert. Der Gewebeblock wird dann in eine Halterung gelegt. Danach wird der Gewebeblock auf die Schnittfläche gestellt und durch die Klinge geführt um eine Scheibe der gewünschten Dicke zu erhalten. Die Präparate werden dann in einem Band angesammelt und können auf Objektträgern plaziert werden.

Bei paraffineingebetteten Präparaten werden die Schnitte zuerst in ein warmwasser Bad gelegt und dann aus dem Wasser auf den Objektträger übertragen und getrocknet.

Biologische Gewebe sind nicht besonders kontrastreich. Das heisst das nach der Histologie die Schnitte noch mit Farbstoffen oder Antikörpern eingefärbt werden müssen. Die häufigste Färbung ist hematoxylin und eosin, oder HE. Da es so häufig verwendet wird, gibt es automatisierte Maschinen, die reproduzierbar verschiedene Schnitte einfärben. Hematoxylin färbt den Zellkern blau, und Eosin färbt das Zytoplasma pink, wodurch die Morphologie des Gewebes sichtbar wird.

Ein Nachteil der Fixierung ist das die Quervernetzung der Proteine es für Antikörper schwieriger macht ihre jeweilige Bindungsstelle zu finden. Deshalb kann außer der Fixierung das Gewebe auch durch schnelles Einfrieren erhalten werden, und dann mit einer Technik die Kryoschneiden genannt wird, weiterverarbeitet werden.

Gewebeproben werden in das OCT Gefriermedium (was für opimal cutting temperature steht) eingebettet und schnell gefroren. Wie andere Einbettmedia auch, sollte das OCT der Festigkeit des Präparats entsprechen.

Ein Kryomikrotom oder ein Kryostat wird verwendet um gefrorene Scheiben zu schneiden. Dieses Instrument behält eine konstante interne Temperatur von -20C bei, um die Klinge und die Gewebeprobe kalt zu halten. Im Gegensatz zu Paraffinpräparaten können die gefrorenen Scheiben gleich auf einen positiv geladenen Objektträger gelegt werden.

Eine andere Art wie man Fixierung vermeiden kann ist die Agareinbettung, in welcher die Präparate in frisch vorbereitete, flüssige Agarose eingedeckt werden. Wenn die Agarose erkaltet und das Gewebe richtig plaziert ist, kann die überschüssige Agarose abgeschnitten werden.

Vibratome sind die andere Alternative zu Mikrotomen, und haben eine Klinge die vibriert und durch agaroseeingebettete Proben geführt werden kann. Vibratome werden verwendet um 50-1000 µm dicke Schnitte von Präparaten eingebettet in Agarose zu schneiden.

Vor dem Färben wird das Präparat normalerweise von Agarose befreit und auf einen Objektträger überführt, der mit einer fetthaltigen Substanz bedeckt ist, damit das Deckglas nicht das Präparat zerdrückt. Diese Präparate werden am besten mit einem Konfokalmikroskop angeschaut, um hochauflösende Bilder zu erhalten.

Das war die Einführung in das Vorbereiten von histologischen Präparaten für die Lichtmikroskopie von JoVE. Nun solltet ihr verstehen wie man die Präparate herstellt und wie man von einem Gewebestück zu einer färbbaren Scheibe gelangt. Danke für eure Aufmerksamkeit.

Transcript

Histology is a term that refers to the study of the microscopic anatomy of tissues and cells. Proper histological sample preparation for light microscopy is essential for obtaining quality results from tissue samples.

There are 3 main steps common to nearly all histological procedures. First, the sample is fixed, in order to preserve the tissue and slow down tissue degradation. Next, the sample is immersed in a material, or embedding media, that has similar mechanical properties to itself. Once embedded, the sample is sectioned, or cut, into thin slices using a precise cutting tool known as a microtome. This video describes these general steps and some of the concepts that relate to them.

Tissue fixation is a critical step that preserves cell and tissue components and maintains their structure. Following cell death, naturally occurring enzymes are released from cellular organelles and begin to degrade the proteins throughout the cell and extracellular matrix, thereby destroying the structure of the cell. Fixation prevents such degradation by directly inhibiting the ability of these enzymes digest protein and by making the enzyme cleavage sites unrecognizable.

The two main mechanisms of fixation are cross-linking and coagulation. Cross-linking involves covalent bond formation both within proteins and between them, which causes tissue to stiffen and therefore resist degradation. Coagulation is caused by the dehydration of proteins through the use of alcohols or acetone, which deform protein tertiary structure, so that hydrophobic, or water fearing, regions move the protein surface. Coagulative fixation can help embedding media, like paraffin wax, penetrate tissue.

One of the most commonly-used fixatives is Formalin, which is formaldehyde dissolved in a water. During fixation, formaldehyde attaches to primary amines, such as those found on the side chains of the amino acids lysine and glutamine to form a stable crosslink called a methelene bridge. This process is inherently slow and can take up to 1-2 days.

Prior to fixation a few considerations should be made. First, consider the diffusivity of the sample. Fixatives will diffuse a distance through tissues at a rate related to the coefficient of diffusion for the fixative multiplied by the square root of time. A fixative that takes 1 hour to penetrate 1 mm into the sample will take 25 hours to penetrate 5 mm. Once formalin has reached the center of the tissue, the crosslinking reaction sill needs to occur. Thus, sample size should be limited to 4 mm in thickness for thorough fixation in a reasonable amount of time.

Second, consider the volume and pH of the fixative. The fixative to sample volume ratio should be at least 40:1 so that the reagent is not depleted easily over time. While some fixatives are designed to work at an acidic pH, formalin works best when buffered with phosphate to maintain a neutral pH, so that excess acid is not produced, which causes artifacts in tissue.

The next step in histological preparation is embedding, which involves supporting specimens in media that has similar mechanical rigidity to the specimen itself. Choosing the right embedding medium is critical, because if it is too stiff or too weak, defects may occur while sectioning. By far, the most common media used for embedding is paraffin wax.

Prior to paraffin-embedding, samples must be dehydrated by replacing the water in the tissue with ethanol, first, followed by xylenes, and then finally warmed paraffin wax. Once wax has infiltrated the sample, it is carefully positioned and surrounded with additional wax using a mould to form a block. Next, samples are attached to a tissue cassette for sectioning.

Sectioning is the process of cutting thin slices of a sample from an embedding block. The sections are usually on the order of 4-10 µm thick for use with light microscopy.

To cut sections, a metal, glass, or diamond blade is first secured on a microtome. The sample is then placed in a sample holder. Next, the sample is advanced to the cutting surface and drawn across the blade to create a slice of desired thickness. Sections will amass as thin ribbons which can be placed on glass slides.

Following sectioning, samples are placed on slides. For paraffin embedded samples, slices are first placed into a warmed water bath and are then lifted out of the water onto the slide and allowed to dry.

Biological tissue has very little inherent contrast, so after histology, slides are usually stained with dyes or antibodies that highlight morphology or specific proteins. The most common stain performed is hematoxylin and eosin, or H&E. Because it is so common, many automated machines have been made to reproducibly stain numerous sections with H&E. Hematoxylin stains the nuclei of cells blue and eosin stains the cytoplasm pink revealing cellular morphology of tissues.

One drawback to fixation is that the cross-linking of proteins can make it more for labeling antibodies to find their binding sites. Rather than using fixation to preserve samples, rapid freezing of tissue, or snap freezing can be used, which is followed by a sectioning technique called cryosectioning

Tissue samples are embedded and oriented in a special freezing media called OCT, or optimal cutting temperature medium and then rapidly frozen. Like other embedding media, OCT matches the rigidity of the sample.

A cryomicrotome or cryostat, is used to cut frozen sections and this instrument maintains an internal temperature of -20°C to keep the cutting blade and samples cool. In contrast to paraffin-embedded sections, frozen sections can be directly lifted onto a positively charged glass slide immediately after sectioning.

Another way to avoid fixation is via agar embedding, in which samples are covered with freshly prepared liquid agarose. As the agarose cools, it locks the tissue into place and excess agarose can be trimmed away.

Vibrotomes, another alternative to the microtome, have a blade that vibrates and moves across the agarose-embedded sample.Vibrotomes are used to create thick sections on the order of 50-1000 µm from agarose embedded samples.

Samples are typically removed from the agarose before staining , and then placed onto a slide surrounded by a substance such as vacuum grease that keeps the coverslip from squishing the sample. They are best viewed using confocal microscopy in order to obtain high resolution images of each thick section.

You’ve just watched JoVE’s video on histological sample preparation for light microscopy.

You should now understand the steps involved for sample preparation to get you from a piece of tissue to a stainable section. As always, thanks for watching!

Tags

Histological Sample Preparation Light Microscopy Histology Fixing Embedding Media Microtome Sectioning Cell Degradation Enzymes Protein Degradation Cross-linking Coagulation Protein Dehydration