1.11: Das Vorbereiten von histologischen Präparaten für die Lichtmikroskopie

Histologie ist ein Begriff, der sich auf die Untersuchung der mikroskopischen Anatomie von Geweben und Zellen bezieht. Die richtige histologische Probenvorbereitung für die Lichtmikroskopie ist unerlässlich, um qualitativ hochwertige Ergebnisse aus Gewebeproben zu erhalten.

Es gibt 3 Hauptschritte, die fast allen histologischen Eingriffen gemeinsam sind. Zunächst wird die Probe fixiert, um das Gewebe zu konservieren und den Gewebeabbau zu verlangsamen. Als nächstes wird die Probe in ein Material oder Einbettungsmedium getaucht, das ähnliche mechanische Eigenschaften wie sie selbst hat. Nach dem Einbetten wird die Probe mit einem präzisen Schneidwerkzeug, dem sogenannten Mikrotom, in dünne Scheiben geschnitten. In diesem Video werden diese allgemeinen Schritte und einige der damit verbundenen Konzepte beschrieben.

Die Gewebefixierung ist ein kritischer Schritt, der Zell- und Gewebebestandteile erhält und ihre Struktur beibehält. Nach dem Zelltod werden natürlich vorkommende Enzyme aus zellulären Organellen freigesetzt und beginnen, die Proteine in der gesamten Zelle und extrazellulären Matrix abzubauen, wodurch die Struktur der Zelle zerstört wird. Die Fixierung verhindert einen solchen Abbau, indem sie die Fähigkeit dieser Enzyme, Protein zu verdauen, direkt hemmt und die Spaltstellen des Enzyms unkenntlich macht.

Die beiden Hauptmechanismen der Fixierung sind die Vernetzung und die Koagulation. Beim Cross-Linking kommt es zur Bildung kovalenter Bindungen sowohl innerhalb als auch zwischen Proteinen, wodurch sich das Gewebe versteift und somit dem Abbau widersteht. Die Koagulation wird durch die Dehydrierung von Proteinen durch die Verwendung von Alkoholen oder Aceton verursacht, die die Tertiärstruktur des Proteins verformen, so dass hydrophobe oder wasserscheue Regionen die Proteinoberfläche bewegen. Die koagulative Fixierung kann dazu beitragen, dass einbettende Medien wie Paraffinwachs in das Gewebe eindringen.

Eines der am häufigsten verwendeten Fixiermittel ist Formalin, ein Formaldehyd, das in Wasser gelöst ist. Während der Fixierung bindet Formaldehyd an primäre Amine, wie sie sich an den Seitenketten der Aminosäuren Lysin und Glutamin befinden, und bildet eine stabile Vernetzung, die als Methelenbrücke bezeichnet wird. Dieser Prozess ist von Natur aus langsam und kann bis zu 1-2 Tage dauern.

Vor der Fixierung sollten einige Überlegungen angestellt werden. Betrachten Sie zunächst die Diffusivität der Probe. Fixiermittel diffundieren über eine Strecke durch das Gewebe mit einer Geschwindigkeit, die mit dem Diffusionskoeffizienten für das Fixiermittel multipliziert mit der Quadratwurzel der Zeit zusammenhängt. Ein Fixiermittel, das 1 Stunde braucht, um 1 mm in die Probe einzudringen, benötigt 25 Stunden, um 5 mm zu durchdringen. Sobald das Formalin das Zentrum des Gewebes erreicht hat, muss die Vernetzungsreaktion stattfinden. Daher sollte die Probengröße auf eine Dicke von 4 mm begrenzt werden, um eine gründliche Fixierung in angemessener Zeit zu gewährleisten.

Zweitens, berücksichtigen Sie das Volumen und den pH-Wert des Fixiermittels. Das Verhältnis von Fixiermittel zu Probenvolumen sollte mindestens 40:1 betragen, damit das Reagenz im Laufe der Zeit nicht leicht erschöpft wird. Während einige Fixiermittel so konzipiert sind, dass sie bei einem sauren pH-Wert wirken, wirkt Formalin am besten, wenn es mit Phosphat gepuffert wird, um einen neutralen pH-Wert aufrechtzuerhalten, so dass keine überschüssige Säure produziert wird, die Artefakte im Gewebe verursacht.

Der nächste Schritt in der histologischen Präparation ist das Einbetten, bei dem die Proben in Medien gestützt werden, die eine ähnliche mechanische Steifigkeit wie die Probe selbst aufweisen. Die Wahl des richtigen Einbettmediums ist entscheidend, denn wenn es zu steif oder zu schwach ist, kann es beim Trennen zu Defekten kommen. Das mit Abstand gebräuchlichste Medium zum Einbetten ist Paraffinwachs.

Vor dem Einbetten von Paraffin müssen die Proben dehydriert werden, indem das Wasser im Gewebe zuerst durch Ethanol, gefolgt von Xylolen und schließlich durch erwärmtes Paraffinwachs ersetzt wird. Sobald das Wachs in die Probe eingedrungen ist, wird sie vorsichtig positioniert und mit zusätzlichem Wachs umgeben, wobei eine Form verwendet wird, um einen Block zu bilden. Anschließend werden die Proben zur Sektion an eine Gewebekassette gebunden.

Beim Schneiden werden dünne Scheiben einer Probe aus einem Einbettungsblock geschnitten. Die Schnitte sind in der Regel in der Größenordnung von 4-10 μm dick und eignen sich für die Verwendung mit der Lichtmikroskopie.

Zum Schneiden von Abschnitten wird zunächst eine Metall-, Glas- oder Diamanttrennscheibe auf einem Mikrotom befestigt. Anschließend wird die Probe in einen Probenhalter gelegt. Als nächstes wird die Probe auf die Schnittfläche vorgeschoben und über die Klinge gezogen, um eine Scheibe mit der gewünschten Dicke zu erzeugen. Die Abschnitte häufen sich als dünne Bänder an, die auf Glasobjektträger gelegt werden können.

Nach dem Schneiden werden die Proben auf Objektträger gelegt. Bei in Paraffin eingebetteten Proben werden die Scheiben zunächst in ein erwärmtes Wasserbad gelegt und dann aus dem Wasser auf den Objektträger gehoben und trocknen gelassen.

Biologisches Gewebe weist nur einen sehr geringen inhärenten Kontrast auf, so dass Objektträger nach der Histologie in der Regel mit Farbstoffen oder Antikörpern gefärbt werden, die die Morphologie oder bestimmte Proteine hervorheben. Die am häufigsten durchgeführten Färbungen sind Hämatoxylin und Eosin oder H&E. Da es so üblich ist, wurden viele automatisierte Maschinen hergestellt, um zahlreiche Schnitte reproduzierbar mit H&E zu färben. Hämatoxylin färbt die Zellkerne blau und Eosin färbt das Zytoplasma rosa, wodurch die zelluläre Morphologie des Gewebes enthüllt wird.

Ein Nachteil der Fixierung besteht darin, dass die Vernetzung von Proteinen es für markierende Antikörper schwieriger machen kann, ihre Bindungsstellen zu finden. Anstatt eine Fixierung zur Konservierung von Proben zu verwenden, kann das schnelle Einfrieren von Gewebe oder das Schnellgefrieren verwendet werden, gefolgt von einer Schnitttechnik, die als Kryosektion

bezeichnet wird. Gewebeproben werden in ein spezielles Gefriermedium namens OCT oder Medium mit optimaler Schneidtemperatur eingebettet und ausgerichtet und dann schnell eingefroren. Wie andere Einbettungsmedien passt sich auch OCT an die Steifigkeit der Probe an.

Ein Kryomikrotom oder Kryostat wird zum Schneiden von Tiefkühlschnitten verwendet und dieses Instrument hält eine Innentemperatur von -20? C, um die Schneidklinge und die Proben kühl zu halten. Im Gegensatz zu paraffineingebetteten Schnitten können Tiefkühlschnitte unmittelbar nach dem Schneiden direkt auf einen positiv geladenen Objektträger gehoben werden.

Eine weitere Möglichkeit, eine Fixierung zu vermeiden, ist die Agar-Einbettung, bei der die Proben mit frisch zubereiteter flüssiger Agarose bedeckt werden. Wenn die Agarose abkühlt, fixiert sie das Gewebe und überschüssige Agarose kann abgeschnitten werden.

Vibrotome, eine weitere Alternative zum Mikrotom, haben eine Klinge, die vibriert und sich über die in Agarose eingebettete Probe bewegt. Vibrotome werden verwendet, um dicke Schnitte in der Größenordnung von 50-1000 μm aus in Agarose eingebetteten Proben zu erzeugen.

Proben werden typischerweise vor dem Färben aus der Agarose entnommen und dann auf einen Objektträger gelegt, der von einer Substanz wie Vakuumfett umgeben ist, die verhindert, dass das Deckglas die Probe zerquetscht. Sie lassen sich am besten mit konfokaler Mikroskopie betrachten, um hochauflösende Bilder von jedem dicken Schnitt zu erhalten.

Sie haben gerade das Video von JoVE über die histologische Probenvorbereitung für die Lichtmikroskopie gesehen.

Sie sollten nun die Schritte verstehen, die für die Probenvorbereitung erforderlich sind, um von einem Stück Gewebe zu einem färbbaren Schnitt zu gelangen. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!