Das Vorbereiten von histologischen Präparaten für die Lichtmikroskopie
Die Histologie ist die Wissenschaft von Zellen und Geweben mit Hilfe eines Lichtmikroskops. Die Vorbereitung von histologischen Präparaten variiert je…
Histologie bezieht sich auf das Untersuchen der mikroskopischen Anatomie von Geweben und Zellen.
Gute histologische Präparatvorbereitung für die Lichtmikroskopie ist wichtig um qualitativ hochwertige Ergebnisse von Gewebepräparaten zu erhalten.
Es gibt drei Schritte, die fast alle histologischen Verfahren gemein haben. Zuerst wird das Gewebe zur Erhaltung und um die Zersetzung aufzuhalten fixiert. Danach wird das Gewebe in ein Material gelegt, das Gewebeeinbettmedium heißt und ähnliche mechanische Eigenschaften wie das Präparat selbst hat. Nach der Einbettung wird das Gewebe mit einem Mikrotom in dünne Scheiben geschnitten. Dieses Video beschreibt diese Schritte und einige andere Konzepte im Detail.
Die Fixierung von Geweben ist ein wichtiger Schritt, der die natürliche Struktur von Zellen und Gewebekomponenten bewahrt. Nach dem Zelltod setzen zelluläre Organellen natürliche Enzyme frei, die intrazelluläre und extrazelluläre Proteine zersetzen, die die Struktur der Zelle und des umliegenden Gewebes normalerweise erhalten. Die Fixierung verhindert diese Zersetzung durch die Hemmung dieser Enzyme und durch das Unkenntlich machen der Bindungsstellen dieser Enzyme.
Die zwei Hauptmechanismen der Fixierung sind die Quervernetzung und die Koagulation. Die Quervernetzung führt zum Enstehen einer kovalenten Bindung im Protein selbst und zwischen verschiedenen Proteinen.
Dies führt zur Versteifung des Gewebes und der daraus resultierenden Resistenz gegenüber der Zersetzung. Koagulation wird durch die Entwässerung der Proteine durch organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Ethanol, hervorgerufen. Diese Methode zerstört die tertiäre oder sekundäre Proteinstruktur, so dass hydrophobische Regionen an die Oberfläche gelangen. Die koagulative Fixierung kann dabei Helfen das das Einbettmedium, zum Beispiel Paraffinwachs, das Gewebe schneller durchdringt.
Eines der am häufigsten benutzten Fixierungsmittel ist Formalin, also Formaldehyd aufgelöst in Wasser. Während der Fixierung bindet sich das Formaldehyd an primäre Amine, zum Beispiel an solche die man an den Seitenketten der Aminosäuren Lysin und Glutamin findet. Dadurch bildet sich eine stabile Quervernetzung, die auch methylen-Brücke genannt wird. Dieser Prozess ist langsam und kann 1-2 Tage dauern.
Vor der Fixierung sollten ein paar Dinge bedacht werden. Zuerst muss die Diffusion der Probe beachtet werden. Fixierungsmittel diffusieren durch die Probe mit einer Geschwindigkeit, die mit dem Diffusionskoeffizienten des Fixierungsmittels multipliziert mit der Quadratwurzel der Zeit in Zusammenhang steht. Ein Fixierungsmittel das 1 h für 1mm braucht, braucht 25 Stunden für 5 mm. Wenn das Formalin in der Mitte des Gewebes angekommen ist, muss noch die Quervernetzung stattfinden. Deshalb sollten nur Proben mit maximal 4 mm Dicke verwendet werden, so dass die Fixierung in einer vernünftigen Zeitspanne stattfindet.
Zweitens sollten das Volumen und der pH-Wert des Fixierungsmittels beachtet werden. Das Volumenverhältnis von Fixierungsmittel zu Probe sollte mindestens 40:1 betragen, damit sich die Reagenz nicht verflüchtigt. Einige Fixierungsmittel funktionieren am besten in einem sauren pH-Bereich. Formalin hingegen wird am besten mit PBS verwendet, um einen neutralen pH-Wert beizubehalten. Dadurch wird keine überschüssige Säure produziert, die zu Artefakten im Gewebe führen kann.
Der nächste Schritt in der Präparatvorbereitung ist das Einbetten in einem Medium mit ähnlicher mechnischer Festigkeit wie das Gewebe selbst. Das Aussuchen des richtigen Einbettmediums ist wichtig, denn ein zu hartes oder zu weiches Medium kann zu Defekten während der Anfertigung der Schnitte führen. Das am häufigsten verwendeten Einbettmedium ist Paraffinwachs.
Vor der Paraffineinbettung müssen die Proben erst mit Ethanol und Xylenen dehydriert werden, wodurch das Wasser im Gewebe verdrängt wird. Danach wird warmer Paraffinwachs hinzugegeben. Nachdem der Wachs das Gewebe durchdrungen hat, wird es vorsichtig mit zuszätzlichem Wachs in einer Form übergossen. Danach wird das eingebettete Gewebe in eine Gewebekassette zum Schneiden gelegt.
Schneiden ist der Prozess bei dem die Gewebestücke in dünne Scheiben aus dem Gewebeblock geschnitten werden. Die Schnitte sind normalerweise etwa 4-10 µm dick und werden für die Lichtmikroskopie benutzt.
Beim Schneiden wird zuerst die Metall, Glas oder Diamantklinge im Mikrotom gesichert. Der Gewebeblock wird dann in eine Halterung gelegt. Danach wird der Gewebeblock auf die Schnittfläche gestellt und durch die Klinge geführt um eine Scheibe der gewünschten Dicke zu erhalten. Die Präparate werden dann in einem Band angesammelt und können auf Objektträgern plaziert werden.
Bei paraffineingebetteten Präparaten werden die Schnitte zuerst in ein warmwasser Bad gelegt und dann aus dem Wasser auf den Objektträger übertragen und getrocknet.
Biologische Gewebe sind nicht besonders kontrastreich. Das heisst das nach der Histologie die Schnitte noch mit Farbstoffen oder Antikörpern eingefärbt werden müssen. Die häufigste Färbung ist hematoxylin und eosin, oder HE. Da es so häufig verwendet wird, gibt es automatisierte Maschinen, die reproduzierbar verschiedene Schnitte einfärben. Hematoxylin färbt den Zellkern blau, und Eosin färbt das Zytoplasma pink, wodurch die Morphologie des Gewebes sichtbar wird.
Ein Nachteil der Fixierung ist das die Quervernetzung der Proteine es für Antikörper schwieriger macht ihre jeweilige Bindungsstelle zu finden. Deshalb kann außer der Fixierung das Gewebe auch durch schnelles Einfrieren erhalten werden, und dann mit einer Technik die Kryoschneiden genannt wird, weiterverarbeitet werden.
Gewebeproben werden in das OCT Gefriermedium (was für opimal cutting temperature steht) eingebettet und schnell gefroren. Wie andere Einbettmedia auch, sollte das OCT der Festigkeit des Präparats entsprechen.
Ein Kryomikrotom oder ein Kryostat wird verwendet um gefrorene Scheiben zu schneiden. Dieses Instrument behält eine konstante interne Temperatur von -20C bei, um die Klinge und die Gewebeprobe kalt zu halten. Im Gegensatz zu Paraffinpräparaten können die gefrorenen Scheiben gleich auf einen positiv geladenen Objektträger gelegt werden.
Eine andere Art wie man Fixierung vermeiden kann ist die Agareinbettung, in welcher die Präparate in frisch vorbereitete, flüssige Agarose eingedeckt werden. Wenn die Agarose erkaltet und das Gewebe richtig plaziert ist, kann die überschüssige Agarose abgeschnitten werden.
Vibratome sind die andere Alternative zu Mikrotomen, und haben eine Klinge die vibriert und durch agaroseeingebettete Proben geführt werden kann. Vibratome werden verwendet um 50-1000 µm dicke Schnitte von Präparaten eingebettet in Agarose zu schneiden.
Vor dem Färben wird das Präparat normalerweise von Agarose befreit und auf einen Objektträger überführt, der mit einer fetthaltigen Substanz bedeckt ist, damit das Deckglas nicht das Präparat zerdrückt. Diese Präparate werden am besten mit einem Konfokalmikroskop angeschaut, um hochauflösende Bilder zu erhalten.
Das war die Einführung in das Vorbereiten von histologischen Präparaten für die Lichtmikroskopie von JoVE. Nun solltet ihr verstehen wie man die Präparate herstellt und wie man von einem Gewebestück zu einer färbbaren Scheibe gelangt. Danke für eure Aufmerksamkeit.
Histologie bezieht sich auf das Untersuchen der mikroskopischen Anatomie von Geweben und Zellen.
Gute histologische Präparatvorbereitung für die Lichtmikroskopie ist wichtig um qualitativ hochwertige Ergebnisse von Gewebepräparaten zu erhalten.
Es gibt drei Schritte, die fast alle histologischen Verfahren gemein haben. Zuerst wird das Gewebe zur Erhaltung und um die Zersetzung aufzuhalten fixiert. Danach wird das Gewebe in ein Material gelegt, das Gewebeeinbettmedium heißt und ähnliche mechanische Eigenschaften wie das Präparat selbst hat. Nach der Einbettung wird das Gewebe mit einem Mikrotom in dünne Scheiben geschnitten. Dieses Video beschreibt diese Schritte und einige andere Konzepte im Detail.
Die Fixierung von Geweben ist ein wichtiger Schritt, der die natürliche Struktur von Zellen und Gewebekomponenten bewahrt. Nach dem Zelltod setzen zelluläre Organellen natürliche Enzyme frei, die intrazelluläre und extrazelluläre Proteine zersetzen, die die Struktur der Zelle und des umliegenden Gewebes normalerweise erhalten. Die Fixierung verhindert diese Zersetzung durch die Hemmung dieser Enzyme und durch das Unkenntlich machen der Bindungsstellen dieser Enzyme.
Die zwei Hauptmechanismen der Fixierung sind die Quervernetzung und die Koagulation. Die Quervernetzung führt zum Enstehen einer kovalenten Bindung im Protein selbst und zwischen verschiedenen Proteinen.
Dies führt zur Versteifung des Gewebes und der daraus resultierenden Resistenz gegenüber der Zersetzung. Koagulation wird durch die Entwässerung der Proteine durch organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Ethanol, hervorgerufen. Diese Methode zerstört die tertiäre oder sekundäre Proteinstruktur, so dass hydrophobische Regionen an die Oberfläche gelangen. Die koagulative Fixierung kann dabei Helfen das das Einbettmedium, zum Beispiel Paraffinwachs, das Gewebe schneller durchdringt.
Eines der am häufigsten benutzten Fixierungsmittel ist Formalin, also Formaldehyd aufgelöst in Wasser. Während der Fixierung bindet sich das Formaldehyd an primäre Amine, zum Beispiel an solche die man an den Seitenketten der Aminosäuren Lysin und Glutamin findet. Dadurch bildet sich eine stabile Quervernetzung, die auch methylen-Brücke genannt wird. Dieser Prozess ist langsam und kann 1-2 Tage dauern.
Vor der Fixierung sollten ein paar Dinge bedacht werden. Zuerst muss die Diffusion der Probe beachtet werden. Fixierungsmittel diffusieren durch die Probe mit einer Geschwindigkeit, die mit dem Diffusionskoeffizienten des Fixierungsmittels multipliziert mit der Quadratwurzel der Zeit in Zusammenhang steht. Ein Fixierungsmittel das 1 h für 1mm braucht, braucht 25 Stunden für 5 mm. Wenn das Formalin in der Mitte des Gewebes angekommen ist, muss noch die Quervernetzung stattfinden. Deshalb sollten nur Proben mit maximal 4 mm Dicke verwendet werden, so dass die Fixierung in einer vernünftigen Zeitspanne stattfindet.
Zweitens sollten das Volumen und der pH-Wert des Fixierungsmittels beachtet werden. Das Volumenverhältnis von Fixierungsmittel zu Probe sollte mindestens 40:1 betragen, damit sich die Reagenz nicht verflüchtigt. Einige Fixierungsmittel funktionieren am besten in einem sauren pH-Bereich. Formalin hingegen wird am besten mit PBS verwendet, um einen neutralen pH-Wert beizubehalten. Dadurch wird keine überschüssige Säure produziert, die zu Artefakten im Gewebe führen kann.
Der nächste Schritt in der Präparatvorbereitung ist das Einbetten in einem Medium mit ähnlicher mechnischer Festigkeit wie das Gewebe selbst. Das Aussuchen des richtigen Einbettmediums ist wichtig, denn ein zu hartes oder zu weiches Medium kann zu Defekten während der Anfertigung der Schnitte führen. Das am häufigsten verwendeten Einbettmedium ist Paraffinwachs.
Vor der Paraffineinbettung müssen die Proben erst mit Ethanol und Xylenen dehydriert werden, wodurch das Wasser im Gewebe verdrängt wird. Danach wird warmer Paraffinwachs hinzugegeben. Nachdem der Wachs das Gewebe durchdrungen hat, wird es vorsichtig mit zuszätzlichem Wachs in einer Form übergossen. Danach wird das eingebettete Gewebe in eine Gewebekassette zum Schneiden gelegt.
Schneiden ist der Prozess bei dem die Gewebestücke in dünne Scheiben aus dem Gewebeblock geschnitten werden. Die Schnitte sind normalerweise etwa 4-10 µm dick und werden für die Lichtmikroskopie benutzt.
Beim Schneiden wird zuerst die Metall, Glas oder Diamantklinge im Mikrotom gesichert. Der Gewebeblock wird dann in eine Halterung gelegt. Danach wird der Gewebeblock auf die Schnittfläche gestellt und durch die Klinge geführt um eine Scheibe der gewünschten Dicke zu erhalten. Die Präparate werden dann in einem Band angesammelt und können auf Objektträgern plaziert werden.
Bei paraffineingebetteten Präparaten werden die Schnitte zuerst in ein warmwasser Bad gelegt und dann aus dem Wasser auf den Objektträger übertragen und getrocknet.
Biologische Gewebe sind nicht besonders kontrastreich. Das heisst das nach der Histologie die Schnitte noch mit Farbstoffen oder Antikörpern eingefärbt werden müssen. Die häufigste Färbung ist hematoxylin und eosin, oder HE. Da es so häufig verwendet wird, gibt es automatisierte Maschinen, die reproduzierbar verschiedene Schnitte einfärben. Hematoxylin färbt den Zellkern blau, und Eosin färbt das Zytoplasma pink, wodurch die Morphologie des Gewebes sichtbar wird.
Ein Nachteil der Fixierung ist das die Quervernetzung der Proteine es für Antikörper schwieriger macht ihre jeweilige Bindungsstelle zu finden. Deshalb kann außer der Fixierung das Gewebe auch durch schnelles Einfrieren erhalten werden, und dann mit einer Technik die Kryoschneiden genannt wird, weiterverarbeitet werden.
Gewebeproben werden in das OCT Gefriermedium (was für opimal cutting temperature steht) eingebettet und schnell gefroren. Wie andere Einbettmedia auch, sollte das OCT der Festigkeit des Präparats entsprechen.
Ein Kryomikrotom oder ein Kryostat wird verwendet um gefrorene Scheiben zu schneiden. Dieses Instrument behält eine konstante interne Temperatur von -20C bei, um die Klinge und die Gewebeprobe kalt zu halten. Im Gegensatz zu Paraffinpräparaten können die gefrorenen Scheiben gleich auf einen positiv geladenen Objektträger gelegt werden.
Eine andere Art wie man Fixierung vermeiden kann ist die Agareinbettung, in welcher die Präparate in frisch vorbereitete, flüssige Agarose eingedeckt werden. Wenn die Agarose erkaltet und das Gewebe richtig plaziert ist, kann die überschüssige Agarose abgeschnitten werden.
Vibratome sind die andere Alternative zu Mikrotomen, und haben eine Klinge die vibriert und durch agaroseeingebettete Proben geführt werden kann. Vibratome werden verwendet um 50-1000 µm dicke Schnitte von Präparaten eingebettet in Agarose zu schneiden.
Vor dem Färben wird das Präparat normalerweise von Agarose befreit und auf einen Objektträger überführt, der mit einer fetthaltigen Substanz bedeckt ist, damit das Deckglas nicht das Präparat zerdrückt. Diese Präparate werden am besten mit einem Konfokalmikroskop angeschaut, um hochauflösende Bilder zu erhalten.
Das war die Einführung in das Vorbereiten von histologischen Präparaten für die Lichtmikroskopie von JoVE. Nun solltet ihr verstehen wie man die Präparate herstellt und wie man von einem Gewebestück zu einer färbbaren Scheibe gelangt. Danke für eure Aufmerksamkeit.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.