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General Laboratory Techniques

Temperaturregulation im Labor: Proben mit Kälte konservieren

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Regulating Temperature in the Lab: Preserving Samples Using Cold

1.13: Introduction to Light Microscopy

1.15: Regulating Temperature in the Lab: Applying Heat

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08:07 min

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April 30, 2023

Overview

Das Erhalten von Laborproben, Präparaten und Reagenzien unter Benutzung von extrem kalten Temperaturen wird routinemäßig in biologischen Laboren angewandt. Dieses Video zeigt einige der Methoden um Proben kalt zu halten und wird die korrekte Kühlmethode für die jeweiligen spezifischen experimentellen Anforderungen erläutern. Kühlmittel wie zum Beispiel Eis oder Trockeneis werden normalerweise benutzt um Proben während eines Experimentes kalt zu halten. Dieses Video behandelt außerdem die physikalischen Eigenschaften der häufig genutzten Kühlmittel und Sicherheitsvorkehrungen die man vor der Arbeit treffen sollte. Beim Kalthalten von Proben zwischen Experimenten werden Kühlgeräte wie zum Beispiel Gefrierschränke und Kühlschränke benutzt um Proben längerfristig zu konservieren. Dieses Video behandelt auch welche Proben und Reagenzien in den typischerweise vorhandenen Kühlgeräten gelagert werden können. Zum Schluss führen wir das Konzept der Kryokonservierung ein bei dem Zellen, Gewebe und Biomoleküle auf Temperaturen unter 0˚C gekühlt werden um die Degradierungsreaktionen in den Proben anzuhalten. Wir stellen verschiedene Methoden der Kryokonservierung vor, welche die Bildung von schädlichen Eiskristallen minimieren oder eliminieren.

Procedure

Das Erhalten von Proben, Präparaten und Reagenzien ist in allen Forschungslaboren weltweit erforderlich. Ein effizienter Weg um die Probe langfristig zu erhalten ist sie bei kühlen Temperaturen zu lagern.

Egal ob man mit einer Probe auf der Laborbank arbeitet, oder ob sie nach Ende des Experiments aufbewahrt werden soll, können verschiedene Methoden zur Kühlung verwendet werden. In diesem Video beschreiben wir die verschiedenen Kühlungsmittel und Instrumente, die man normalerweise in einem Labor findet. Wir beschreiben außerdem welche Proben bei welchen Temperaturen gelagert werden müssen.

Die Wahl des richtigen Kühlungsmittels ist abhängig von dem Experiment das gemacht wird.

Normales Eis ist die logische Wahl um Proben kurzfristig zu erhalten. Wie ihr sicherlich wisst ist Eis gefrorenes Wasser, das einen Schmelzpunkt von 0°C bei normalem atmosphärischem Luftdruck hat, wie ihr hier in diesem Phasendiagramm seht. Was ihr vielleicht nicht wisst ist das es manchmal als « nasses Eis » bezeichnet wird, da es flüssig wird wenn es auf Raumtemperatur erwärmt wird.

„Nasses Eis“ ist ideal um Proben und Reagenzien kalt zu halten während man mit ihnen arbeitet und sie transportiert.

„Nasses Eis“ ist Wasser im festen Aggregatszustand. „Trockeneis“ hingegen ist der feste Aggregatszustand von Kohlenstoffdioxid, das einen Schmelzpunk von -78.5°C hat. Trockeneis schmilzt nicht unter atmosphärischen Luftdruck, sondern wird unmittelbar zu Kohlenstoffdioxid Gas; ein Prozess der auch Sublimation genannt wird. Sublimation ist also der Aggregatszustandswechsel von fest direkt zu gasförmig, und findet unterhalb des Tripelpunktes in dem Phasendiagramm statt.

Trockeneis sollte man benutzen wenn man mit biologischen Proben wie zum Beispiel gefrorenen Bakterien Säugerzellen und Gewebe arbeitet, die normalerweise bei Temperaturen weit unter 0°C aufbewahrt werden.

Trockeneis ist außerdem vorteilhaft, da es keine Überstände hinterlässt wenn es den Aggregatszustand ändert. Deshalb ist es ideal um ein Gefrierbad herzustellen, bei dem man eine Flüssigkeit über Trockeneis gießt.

Flüssiger Stickstoff ist kondensiertes Stickstoffgas und wird oft als LN2 notiert. Bei atmosphärischem Luftdruck kocht flüssiger Stickstoff, oder geht von dem flüssigen in den gasförmig Zustand bei -196°C über, wie man hier in diesem Phasendiagramm sehen kann.

Wenn man biologische Proben bei Temperaturen unterhalb dessen was normale Gefrierschränke erreichen können lagern muss, wird meistens flüssiger Stickstoff benutzt.

Flüssiger Stickstoff wird in einem Dewar-Gefäß oder einer Vakuumflasche gelagert, die mit einem locker passendem Deckel und einem Ablassventil ausgestattet ist um Druckaufbau im System zu vermeiden.

Auch wenn Trockeneis und flüssiger Stockstoff nicht giftig sind, sind sie trotzdem gefährliche Materialien und sollten deshalb nicht benutzt werden, bevor man von Labormitgliedern mit mehr Erfahrung eingewiesen worden ist.

Wegen der extrem niedrigen Temperaturen von flüssigem Stickstoff und Trockeneis kann eine gefährliche Gewebeschädigung stattfinden wenn diese Stoffe mit der Haut in Berührung kommen. Deshalb sollte man immer Laborschutzkleidung tragen, wie Gefrierhandschuhe and Laborkittel. Außerdem sollte man auch spezielle Werkzeuge benutzen um Hautkontakt zu vermeiden.

Außerdem sollten nie luftdichte Behältnisse verwendet werden um Trockeneis oder flüssigen Stickstoff zu lagern, da diese Kühlmittel in den gasförmigen Zustand übergehen. Unter luftdichten Bedingungen kann es zu Druckaufbau kommen, was zu einer Explosion führen.

Und nun zu den Instrumenten die Proben kalt halten… Laborkühlschränke und Gefrierschränke regulieren Temperaturen genauer als zu Hause, um eine gleichmäßige Temperatur in der ganzen Einheit zu gewährleisten.

Sie sind normalerweise mit Temperaturüberwachungssystemen ausgestattet, bei denen ein Alarm angeht wenn die Temperatur sich schnell ändert.

Man sollte niemals Essen und Trinken in Laborkühlschränken und Gefrierschränken aufbewahren, da diese sonst mit toxischen Chemikalien oder Bakterien kontaminiert werden könnten. Das heißt ihr müsst euch einen anderen Ort suchen um euer Mittagessen aufzubewahren.

Kühlschränke werden auf 4°C gehalten und werden normalerweise für die kurzfristige Aufbewahrung von Proben genutzt, speziell dann wenn Gefrieren die Intaktheit der Probe beeinträchtigen kann.

Viele Reagenzien und Lösungen werden bei 4°C aufgehoben um ihre Haltbarkeit zu verlängern, einschließlich von Zellkulturmedium und Zellkulturplatten die vor dem Gebrauch einfach aufgewärmt werden.

Kalträume sind ideal um größeres Gerät aufzubewahren, das bei niedrigen Temperaturen bedient werden soll, wie zum Beispiel flüssige Chromatographie Einheiten.

Laborgefrierschränke erreichen Temperaturen von -20°C bis hin zu -196°C für kryogene Gefrierschränke.

Für das Aufbewahren von Nukleinsäuren und Reagenzien, wie zum Beispiel Restriktionsenzyme ist -20°C die richtige Wahl. Nach dem Entnehmen der Probe aus dem Gefrierschrank sollten diese auf Eis aufbewahrt werden.

-80°C Gefrierschränke und kryogene Gefrierschränke werden für das langfristige Aufbewahren von gefrorenen Geweben und Zellen benutzt, nachdem diese in flüssigem Stickstoff kryokonserviert worden. Trockeneis wird normalerweise benutzt um Proben aus einem -80˚C Gefrierschrank zu transportieren.

Kryokonservierung ist ein Wort das sich auf die langfristige Aufbewahrung von Geweben oder sogar lebenden Zellen bezieht. Bei Temperaturen unter 0˚C, wird jegliche biologische Aktivität, einschließlich Degradierungsreaktionen in der Probe, effizient angehalten.

Beim Einfrieren von lebenden Zellen und Geweben bilden sich Eiskristalle die zur Entwässerung und damit Schaden führen können. Außerdem kann es zu einer Ansammlung von gefährlichen Konzentrationen von gelösten Molekülen kommen.

Schockgefrieren ist der Prozess, bei dem biologische Proben sehr schnell in flüssigen Stickstoff oder einer Mischung von Trockeneis und Ethanol gehalten werden, so dass sich keine Eiskristalle bilden, welche die Zellen beschädigen könnten. Frostschutzmittel können auch als Zusatz benutzt werden um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern.

Als Alternative zu Schockgefrieren können Maschinen benutzt werden, die langsam den Gefrierprozess kontrollieren, der notwendig ist damit zum Beispiel Schafembryonen wie hier zu sehen ist, kryokonserviert werden können.

Kürzlich wurde die Vitrifizierung als Methode eingeführt, um Zellen und Gewebe ohne schädliche Eiskristalle zu kryokonservieren. Dieser Prozess wandelt Flüssigkeiten in der Probe in einen nichtkristallinen, glasigen Festigkeitszustand um, durch schnelles Kühlen mit speziellen Frostschutzmitteln.

Das war die Einführung in das Kühlen von Proben und Reagenzien von JoVE. In diesem Video haben wir verschiedene Arten von Kühlmitteln behandelt und Beispiele wenn man welche Kühlmethode anwendet gegeben. Wir haben auch verschiedene Wege gezeigt, wie man biologische Proben kryokonserviert. Danke für eure Aufmerksamkeit.

Transcript

Preservation of laboratory samples, specimens and reagents, is a requirement of research laboratories worldwide. An efficient way to preserve sample integrity and viability over time is by maintaining them at cold temperatures.

Whether you are working with a sample at the bench, or storing a sample at the end of an experiment, different methods of cooling can be used. This video will demonstrate the types of cooling agents and instruments typically found in the lab and will help you understand what types of samples are stored at which temperatures.

The choice of cooling agent is dependent on the nature of experimental procedure being performed.

Conventional ice is the logical choice for preserving samples over the short-term. You probably know that ice is frozen water, which has a melting point of 0 °C at normal atmospheric pressure as you can see in this phase diagram. You might not know that it is sometimes referred to as “wet ice”, because it becomes liquid as it warms at room temperature.

“Wet Ice’ is ideal for keeping samples and reagents cold while working with- or transporting them.

While “wet ice’ is solid H2O, “dry ice’ is the solid form of carbon dioxide, which has a melting point of -78.5 ˚C. Dry ice does not melt into liquid at atmospheric pressure but rather transforms directly into carbon dioxide gas, through a process called sublimation. Sublimation refers to a shift in the phase of matter from solid directly to gas and occurs below the triple point in a phase diagram.

Use dry ice, when you are working with biological specimens such as frozen bacterial or mammalian cells or tissue, which are generally stored at temperatures well below 0˚C.

Dry ice is also advantageous as it leaves no residue upon changing state, which makes it ideal for constructing a freezing bath by pouring liquid over dry ice.

Liquid nitrogen is condensed nitrogen gas and is. commonly written as “LN2”. At atmospheric pressure liquid nitrogen boils, or transitions from liquid to a gas, at -196 °C, which you can see by its phase diagram.

When you need to store biological specimens at temperatures below what most laboratory freezers can obtain, liquid nitrogen is used.

Liquid Nitrogen can be stored in a dewar, or vacuum flask, with a loose fitting lid or a large tank dewar equipped with a relief valve to prevent pressure build-up within the system.

Though non-toxic, dry ice and liquid nitrogen are dangerous materials and should not be handled until you have been trained by an experienced member of the lab.

Due to the extremely low temperatures of liquid nitrogen and dry ice, severe tissue damage can occur upon contact with skin. Always wear proper protection, including cryogenic gloves and a lab coat. Use tools to manipulate samples to avoid contact with skin.

Also, airtight containers should never be used to store either dry ice or liquid nitrogen, since these cooling agents change state into gas. Under airtight conditions, pressure can build leading to an explosion.

And now for the instruments that keep samples cold… Laboratory refrigerators and freezers regulate temperature more tightly than those found in the home to ensure a uniform temperature throughout the unit.

They are generally equipped with temperature monitoring systems and alarms that go off following significant temperature change.

Never store food or drink in lab fridges or freezers, as this could result in contamination with toxic chemicals or bacteria. You’ll have to find another place to store your lunch.

Refrigerators are maintained at 4°C and generally used for temporary storage of samples especially when freezing can affect sample integrity.

Many reagents and solutions are stored at 4°C to extend their shelf life, including tissue culture media and poured cell culture plates, which are warmed before use.

Cold rooms are ideal for storage of larger equipment that should operate at low temperatures, such as liquid chromatography units.

Laboratory grade freezers range in temperature from -20° C to -196 °C for cryogenic freezers.

For storage of nucleic acids and reagents, such as restriction enzyme, -20 °C is the appropriate choice. Upon removal from the freezer, samples and reagents should be kept on ice.

-80°C and cryogenic freezers are suitable for storage of frozen tissue and cells over an extended period of time following cryopreservation in liquid nitrogen. Dry ice is generally used to transport samples taken out of -80 ˚C freezers.

Cryopreservation is a term that refers to the long-term storage of tissues, or even living cells. At sub-zero temperatures all biological activity, including reactions that degrade the sample is effectively stopped.

When freezing living cells and tissue, ice crystals can form, leading to cell dehydration and damage, as well as accumulation of solute molecules to harmful concentrations.

Snap- or flash-freezing is the process by which biological samples are rapidly submerged in liquid nitrogen, or a mixture of dry ice and ethanol, so that large ice crystals cannot form and damage the cells. Cryoprotectants can also be used as an additive to reduce the formation of ice.

As an alternative to flash freezing, machines can be used to slowly control the freezing process, which is needed to cryopreserve the sheep embryos you see here.

Recently, vitrification has been in introduced as a method to cryopreserve cells and tissue without any damage due to ice crystals. This process transforms the liquid in the sample to a non-crystalline, glassy solid through rapid cooling in the presence of certain cryoprotectants.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cooling laboratory specimens and reagents.

In this video we reviewed different types of cooling agents and equipment, and examples of when to use each cooling method. We also introduced several ways to cryopreserve biological specimens. Thanks for watching.