Name: Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einer kostengünstigen Fliegenbar Alkohol-induzierte Verhaltensänderungen bei Drosophila messen. Diese Methode erfasst zirkadiane Rhythmen und eignet sich ideal für die Ausbildung von Studierenden.

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Die Finanzierung dieser Forschung wurde von einem Programm in Neuroscience Award von der Florida State University College of Medicine und die Unterstützung von der Abteilung für Biowissenschaften an der FSU zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Finanzierung wurde durch einen Grant-in-Aid aus der Spirituosenherstellerforschungsfonds zur Verfügung gestellt.

1. Versammlung der Paddelstange Begründung und Übersicht: Das System ist so konzipiert, gesteuert Prozentsätze der Alkoholdampf, um Fliegen zu verwalten. Hinweis: Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht über die Paddelstange Set-up, wie unten in drei Stufen (Montage des Luftstroms, Set-up des Alkohol-und Wasserflaschen, und die Montage der Beobachtung Fläschchen) beschrieben. Kurz gesagt, ist ein stetiger Luftstrom in zwei Fraktionen, die durch Alkohol und Wasser sprudelte werden jeweils gemischt und auf 4 Beobachtungs Fläschchen verabreicht aufgeteilt. <ol><li> Versammlung der Airflow <ol><li> Schließen Sie ein kurzes Stück von flexiblen Silikonschlauch, entweder Gebäude Luft oder ein Aquarium Belüfter, um eine konsistente Luftstrom und Split mit einem y-Stecker zu erzeugen. Verbinden den ersten Zweig mit dem Luftstromregler, der die Gesamtmenge der Luft durch das System (typischerweise 1.000 ml / min für 4 Beobachtungs Vials) steuert. </li><li> Legen Sie eine Schnellkupplung in der zweiten Röhreso dass der Luftstrom am Anfang des Versuchs, ohne die Luftströmung kalibriert unterbrochen werden. Fügen Sie einen Y-Stecker und verbinden jeden Verzweigungsrohr mit dem Volumenstromregler. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an Volumenstromregler und verbinden zwei Meter Luftstrom. </li></ol></li><li> Set-up der Alkohol-und Wasserflaschen <ol><li> In flexiblen Schlauch an den Ausgang der Luftmengenmesser und führen Sie einen dünnen Glasrohr (Abschnitte von 1 ml Glaspipetten) mit einer 90 °-Bogen in das Ende eines jeden Rohrlänge. Dies wird als der Einlassluftstrom in den Wasser-und Alkohol-Flaschen dienen. </li><li> Platzieren Gummistopfen mit 2 Löchern durch sie in die Flaschen mit Alkohol und Wasser. Halten beider Flaschen bei einer konstanten Temperatur 2 ° C höher als die Umgebungslufttemperatur unter Verwendung eines Wasserbades. In unseren Experimenten wird die Umgebungsraum bei 25 ° C gehalten wird, während das Wasserbad auf 27 ° C. </li><li> Stecken Sie das gerade Glaspipette für die einir durch den Gummistopfen Einlass und erstrecken sich in die Flüssigkeit bis ungefähr 1 cm von der Unterseite der Flasche. </li><li> Legen Sie eine Kniestückabschnitt Glaspipette in die verbleibende Öffnung in dem Gummi-Stopper, bis das Ende des Glas bündig mit der Unterseite des Stopfens in der Flasche. Fügen Sie diesen Luftaustritt in einem anderen Rohrlänge. </li><li> Vereinige die Luftströme mit einem y-Stecker und eine andere Länge der Silikonschlauch um den Luftstrom durch eine leere Mischflasche oder Flasche mit gebogenen Glaspipette Schnitte durch eine zwei-Loch Gummistopfen eingesetzt lenken. Verwenden Sie eine andere Länge der Silikonschlauch für den Austritt Mischluftstrom. </li></ol></li><li> Versammlung der Beobachtung Vial <ol><li> Teilen die Austrittsluftstrom, der aus dem Mischkolben 2-3x bis 4 oder 8 kleinere Luftströme zu erhalten, so dass mehrere Beobachtungs Fläschchen können in jedem Experiment verwendet werden. Schließen Sie den flexiblen Silikonschlauch auf die Beobachtung Fläschchen. </li><li> Richten Sie die Beobauf Phiolen mit leeren Flaschen mit einem Gummistopfen mit zwei Löchern, durch die Glasrohre liefern einen Einlass und einen Auslass für den Alkoholdampf abgedichtet. </li><li> Decken Sie die Ende des ersten Glasrohr mit Netz und halten das Netz an Ort und Stelle mit einem kleinen Stück aus flexiblem Kunststoffrohr. Legen diese Röhre durch das erste Loch erstreckt, bis sie ungefähr die Hälfte der Länge des Röhrchens. Falls erforderlich, verwenden Sie Teflonband um eine bequeme Passform zu erhalten. </li><li> Legen Sie die zweite Glasröhre auch mit dem Ende durch Verrechnung abgedeckt, bis sie bündig mit der Innenkante des Gummistopfens ist. </li><li> Die Durchstechflaschen horizontal auf einem weißen Stück Papier, um den Kontrast mit den Fliegen unter schlechten Lichtverhältnissen rot maximieren. </li><li> Mix entsprechenden Fraktionen des Luftstroms durch sprudelte Alkohol und der Luftstrom durch das Wasser geleitet. Überwachung der Luftdruck kontinuierlich und Anpassungen vornehmen, wie notwendig, um die gewünschte Durchmischung der Luftströme zu erhalten. Hinweis: Die Dauerlaufvon mehreren Fly Bar-Tests parallel oder auch nur einen einzigen Test in einem kleinen Raum kann zu einer deutlichen Anhäufung von Alkoholdampf führen. Um kontinuierliche Freisetzung von Alkoholdampf, die möglicherweise die Forscher in einem geschlossenen Raum beeinflussen zu vermeiden, muss ein geeignetes System, um an Ort und Stelle, die während des Experiments erzeugt Alkoholdampf ausreichend entfernt genommen werden. Um Alkoholdämpfe zu entfernen, schließen Sie ein 12.6-Zoll-Rohrstück auf den zweiten Glasrohr aus jedem Fläschchen vorsteht, bündeln sie und leiten zu einer trichterVakuumSystem. Forscher sollten auch dafür sorgen, dass die experimentelle Testraum ausreichend belüftet wird. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Versuchstiere Begründung und Übersicht: Die richtige Kultur und Gehäuse der Fliegen wird Variabilität in den Daten zu reduzieren. Dies wird durch die Standardisierung und die Minimierung der Belastung durch den Fliegen erlebt erreicht. Aus diesem Grund ist keine Anästhesie (CO 2 oder Alternativen) verwendet During der folgenden Schritte des Protokolls. Außerdem sollte Fliegen Alter über Experimente und Zeitpunkte abgestimmt, um die Variabilität zu minimieren, wie dies bei anderen Verhaltensanalysen einschließlich Lern-und Gedächtnisexperimente 17 sein. Verschiedene Licht: Dunkelheit kann verwendet werden, um die Funktion der circadianen Uhr in der Verhaltensreaktion auf Ethanol zu sondieren. Um festzustellen, ob ein Tagesrhythmus existiert, können Experimente unter einer definierten LD Zyklus durchgeführt werden, um die Leistung zu bestimmten Zeiten Zeitgeber (ZT) zu messen. ZT 0 steht für Dämmerung und wird als die Zeit der Lichter auf unter LD-Zyklen definiert, während ZT 12 ist die Zeit Lichter werden mit einem 12:12 h LD Zyklus eingeschaltet. Unter konstanten Bedingungen, die zirkadianen Zeit (CT) misst die Zeit für das Tier in der Abwesenheit von Umweltsignale, dh Freilaufzeit und wird auf die vorherige LD Mitnahmezyklus zusammen. In Wildtyp Drosophila, CT spiegelt die früheren ZT für die ersten paar Tages in konstanten Bedingungen wie der Freilaufzeit und circadianen Rhythmen sind ~ 24 Stunden. Zur Messung der circadiane Modulation und Beseitigung akuter Licht Auswirkungen auf Verhalten, sind die Fliegen zum Licht mitgerissen: Dunkel-Zyklen und dann konstant Dunkelheit (DD) vor den Experimenten übertragen. Circadian Experimente werden am zweiten Tag der DD durchgeführt, um die Leistung zu bestimmten Zeiten des zirkadianen (CT) zu messen. In Drosophila führen Dauerlicht (LL) Bedingungen der circadianen Dysfunktion mit angefeuchteten oder abgeschafft molekularen Schwingungen der Kernzirkadianen Gene und die Störung der Verhaltenszirkadianen Rhythmen wie Herzrhythmusstörungen und der Bewegungsaktivität 18-21 arrhythmische Kurzzeitgedächtnis 17 belegt. Das Protokoll ist für zirkadianen Studien optimiert und kann für andere Experimente vereinfacht werden. Kleine rote Lichter in 12 Zoll aus Rohren verwendet; zirkadianen Alle Experimente werden mit dim rotes Licht (Umgebungsoverhead-rotes Licht &lt;1 Lux auf Tischplatte durchgeführt~ 1 lux Licht). <ol><li> Rück die Fliegen bei 25 ° C unter 0.12 Stunden Licht: dunkelMitnahmeBedingungen (LD). </li><li> Sammeln frisch geschlüpften Fliegen am Ende des Tages-Lichtperiode am Tag 1 und speichern Sie sie für 24 Stunden unter LD Bedingungen halten Fläschchen mit einer kleinen Menge von High-Agar-Konzentration Lebensmitteln darauf Klebrigkeit zu minimieren. Hinweis: Um sicherzustellen, gesund, normal entwickelt Fliegen erhoben werden, nur Fliegen in den ersten Tagen nach dem Schlüpfen beginnt gesammelt in einer Kulturflasche. </li><li> Sammeln Chargen von ca. 30 (25-35) fliegt unter Verwendung eines Gebläses am Tag 2 gegen Ende der Lichtperiode, und Transfer zum Frischhalte Fläschchen. </li><li> Verwenden Sie eine starke Lichtquelle, um Fliegen zum anderen Ende des Fläschchens zu lenken. Innerhalb dieses Bereichs ist die genaue Anzahl der Fliegen in jeder Ampulle nicht kritisch, Verhaltensbeobachtungen sind in Prozentgesamtanzahl von Fliegen am Ende jedes Experiments gezählt berichtet. </li><li> Pflegen Fliegen unter DD Bedingungen bei 25 ° C for zwei Tage. </li><li> Am Tag des Experiments, legen alle Fliegen in verschiedenen Bedingungen oder anderen als der experimentelle Verhalten Raum in den Raum für mindestens 1 Stunde vor dem Experiment Inkubatoren gebracht. Akklimatisierung reduziert Variabilität durch Änderungen der Temperatur oder Luftfeuchtigkeit. </li><li> Beobachtungen machen zu sechs Zeitpunkten am Tag (CT 1, 5, 9, 13, 17 und 21), um für die circadiane Modulation des Verhaltens zu prüfen. </li><li> Vergleichen Sie mehrere Zeitpunkte in einem einzigen Satz von Verhaltensexperimenten, um die Robustheit des experimentellen Design zu erhöhen und die Variabilität zu minimieren auf einen einzigen Versuch. So kann beispielsweise Beobachtungen von CT 1 und CT-13 gleichzeitig erhalten werden, wenn zwei Inkubatoren mit gegen Hell-Dunkel-Zeitpläne werden zur Mitnahme verwendet. Hinweis: Das obige Verfahren beschreibt die Herstellung von Versuchstieren für Assays in zirkadianen Bedingung konstanter Dunkelheit durchgeführt. Verschiedene Licht: Dunkelheit kann die Funktion der Uhr zu sondierender Verhaltensreaktionen auf Alkohol. Um festzustellen, ob ein Tagesrhythmus besteht die Experimente unter einem LD-Zyklus zu bestimmten Zeiten Zeitgeber (ZT) durchgeführt, um die Leistung zu messen. Zusätzlich kann das Protokoll mit Fliegen unter konstanten Lichtbedingungen für Experimente Testzirkadianen Funktionsstörung erhöht werden. Für alternative Protokolle, die Fliegen im Lichtverhältnissen untergebracht testen, sollten Verhaltenstests noch unter dunklen Bedingungen durchgeführt werden. Fliegen sollte in den dunklen 1 h vor dem Experiment überführt werden, um Verhaltensvariabilität aufgrund der akuten Wirkungen von Licht auf das Verhalten zu minimieren. </li></ol> 3. Verhaltensbeobachtungen Begründung und Übersicht: Der folgende Alkoholverwaltung Protokoll wird für Beobachtungen unter schwachem Rotlicht Zustand optimiert. Die beiden Verhaltensmaßnahmen LORR und Sedierung repräsentieren zwei verschiedene Punkte des Fliegen Rausch. LORR stellt einen späten Punkt der Trunkenheit Einbeziehung der Verlust of Motor-und Haltungskontrolle, während Sedierung Maßnahmen eine sehr späte Endpunkt der Rausch. Genotyp oder zirkadiane Modulation kann diese beiden Maßnahmen unterschiedlich auswirken; damit man sich wünschen kann, um sowohl zu untersuchen. Kurz gesagt, werden entfernt in der Fläschchen geladen wird, werden die Anzahl der Fliegen Anzeige LORR oder Sedierung alle 5 min während der Alkoholdampf-Exposition, und die Gesamtzahl der entfernt am Ende des Experiments gezählt hat. <ol><li> Vor Beginn des Experiments, führen Sie die Luft durch das System (Luft durch Wasser-und Alkoholflaschen sprudelte) für mindestens 10 min und nutzen diese Zeit, um die Luftströme zu kalibrieren. </li><li> Trennen Sie den Schnellspanner um den Luftstrom zu stoppen. Laden Sie die Fliegen in den Fläschchen, und schließen Sie den Luftstrom und starten Sie die Timer. Hinweis: Wenn nicht mehr reagiert Fliegen oder tote Fliegen in den Halte Fläschchen verließ, könnte dies ein Hinweis auf Stress-Bedingungen sein. Im Allgemeinen können diese Bedingungen durch das Gehäuse weniger Fliegen in den Halte Fläschchen oder Verringerung der Nahrungs Klebrigkeit mit einem leichten gelindert werdenlich höher Agar-Konzentration während der Zubereitung von Speisen. Für eine optimale Verhaltens-Analysen und minimaler Variabilität zwischen den Experimenten sollten gesunde Fliegen vor den Experimenten sein. </li><li> Für die genaue Zeitmessung, verwenden Sie einen Timer, den Überblick über die Gesamtzeit der Exposition Alkohol halten und eine zweite Zählung-Timer zurück, um die 5-Minuten-Intervallen zu markieren. </li><li> Legen Sie ein weißes Blatt Papier unter den Fläschchen, um den Kontrast besonders unter schlechten Lichtverhältnissen zu erhöhen rot und fliegen Sichtbarkeit. </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig den Luftstrom während eines Experiments zu konstanten Niveau zu halten. Im allgemeinen Luftströme einmal stabilisiert, stabil bleiben sie während der Dauer des Experiments. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Fliegen, die ihre Aufrichtungsreflexes einmal alle 5 Minuten für eine 1 Stunde Zeit verloren zu haben. Als die Alkoholempfindlichkeit variiert zwischen Genotypen und genetischen Hintergründen, kann es wünschenswert sein, häufiger Abschätzungen durchzuführen oder um den Versuch für eine längere Zeitdauer durchzuführen. </li><li> Heben Sie die Fläschchen slightly von der Oberfläche, und lenken das Licht von einem Rotlicht-Taschenlampe in Richtung der Papier hinter dem Fläschchen. Halten Sie die Hand-rot-Taschenlampen in einem Abstand von mindestens 12 cm zu den experimentellen Fläschchen Lichtverhältnisse nicht mehr als 1 Lux für alle Experimente unter schwachem Rotlicht Bedingungen aufrecht zu erhalten. </li><li> Messen Sie mit einem Lichtspiegel Lichtmesser, um Standards für alle Experimente zu etablieren. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Fliegen, die ihre Aufrichtungsreflexes, indem eine Firma Hahn in das Fläschchen verloren haben und zählen, wie viele Fliegen nicht, sich innerhalb von ca. 4 Sekunden rechts. Fliegen, die LORR anzeigen kann immer noch ihre Beine und Flügel zu bewegen, aber kann sich nicht aufrecht zu drehen. </li><li> Am Ende der Sitzung, zählen Sie die Anzahl der Fliegen in jeder Flasche. Hinweis: Gelegentlich kann eine Fliege zwischen dem Anschlag und der Seite, wenn das Laden in den Versuchsflaschen fliegt gefangen werden. Wie dies in der Dunkelheit durchgeführt, kann es nicht ohne weiteres bemerkt, so ist es notwendig, die Gesamt taub zu zählenER entfernt am Ende des Experiments Prozente korrekt zu berechnen. </li></ol> Darüber hinaus kann dieses Verfahren auch zur Sedierung von Fliegen, die eine andere Verhaltens Endpunkt darstellt messen. Während Fliegen sediert haben ihr Recht verloren Reflex, Sedierung erfordert eine größere Alkohol-Exposition. Verhaltens kann Sedierung durch das völlige Fehlen von Motorscheinaktivität mit Fliegen verbleibenden regungslos in dem Fläschchen folgenden aa Firma Hahn in das Fläschchen charakterisiert werden. Für Sedierung, zählen die Anzahl der Fliegen, die kein Bein unbewegt mit winken nach Lieferung der Firma Hahn der Flasche bleiben. Zusätzlich kann die Ampulle aufgerollt werden und her, um zu bestimmen, ob einzelne Fliegen noch ihre erregenden Reflex erhalten. 4. Datenanalyse <ol><li> Bestimmung der prozentualen LORR zu jedem Zeitpunkt auf der Basis der Gesamtzahl der in jedem Fläschchen entfernt beurteilt. </li><li> Schätz Unterschiede zwischen circadianen Zeitpunkten oder Stämme von Berechng 50% LORR für jede Probe, die in den linearen Teil der sigmoiden Kurve fällt (siehe Fig. 2). </li><li> Alternative Statistiken: <ol><li> Wenn Vergleiche zwischen Genotypen sind geplant, ist es wünschenswert, den gesamten Zeitverlauf analysiert mit wiederholten Messungen ANOVAand um den Bereich der Zeitpunkte, dass die Unterschiede signifikant mit Post-hoc-Tests (Fig. 3) zu bestimmen. Für diese Tests, bevorzugen wir einen Wert von 0,001 zu verwenden. Diese Unterschiede können an den einzelnen Belichtungszeiten sowie bewertet werden als Unterschiede zwischen den Genotypen in der Steigung der Kurve. </li><li> Unterschiede in der Empfindlichkeit kann für bestimmte Zeiten von Alkohol Belichtung für eine bestimmte Reaktion wie Sedierung aus dem linearen Teil der Kurve (Fig. 4) bestimmt werden. </li><li> Unterschiede zwischen Stämmen oder zirkadiane Zeitpunkte können mit Standard-F-Statistiken und Post-hoc-Tests geschätzt werden. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Kosten für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus für die Gesellschaft ist enorm, sowohl in Bezug auf die menschliche und wirtschaftliche Kosten 29 30,31. Drosophila als Modell bietet eine schnelle und vielseitiges System, um schnell prüfen, die Verhaltensreaktionen von einer großen Zahl von Individuen und als solche wurde ausführlich sowohl für Alkohol 5,7,32-34 und circadianen Forschung 35-37 verwendet. Hier haben wir beschrieben, ein einfaches Pro...

Drosophila melanogaster zeigen zweiphasige Verhaltensreaktionen auf Alkohol ein, die analog zu menschlichen Reaktionen auf dieses Medikament 2,3 sind. Bei der ersten Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen von Alkohol, fliegt eine erhöhte Bewegungsaktivität, durch einen Mangel an Bewegungskoordination, den Verlust der Haltungskontrolle und Stellreflexe (Verlust des Stellreflexes: LORR) ersetzt, und Sedierung (vollständige Fehlen der motorischen Aktivität in Reaktion auf mechanische Stimulation) die Exposition gegenüber Alkohol fort 4-9. Die endogenen circadianen Uhr ist ein starker Modulator von Alkohol Empfindlichkeit und Toxizität in Mäusen 10,11, 12 Ratten beobachtet, und Menschen 13. Jüngste Fortschritte in der Drosophila-Forschung haben gezeigt, die innere Uhr moduliert akuten Alkoholempfindlichkeit, aber nicht ein Alkoholtoleranz. Die leistungsfähigen genetischen Ansätzen in Drosophila-Mutanten verfügbar durch Studien und transgenen Manipulationen der Raumund zeitliche Genexpression ein System, das eine schnelle Fortschritte bei der Identifizierung der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen für komplexe Verhalten ermöglicht. Die Verwendung von Drosophila als Untersuchungswerkzeug hat inhaltliche Fortschritte im Verständnis der Neurobiologie Alkohol, die schnell zu den Säugetieren 14-16 übersetzt werden kann, erlaubt. Um das Verständnis der molekularen Mechanismen, durch die der circadianen Uhr moduliert Alkohol Empfindlichkeit zu erleichtern und Verhaltensreaktionen über zirkadianen Zeitpunkten, eine Alkoholverwaltung Protokoll für den Einsatz bei schlechten Lichtverhältnissen rot gleichmäßig zu messen ist nicht erforderlich. Für Drosophila kann Alkohol durch Nahrungsergänzung für die chronische Exposition oder zuverlässig durch die Verwaltung Alkohol in Form von Dampf für die akute Exposition verabreicht werden. Hier ein Alkoholverwaltung Protokoll für die Beurteilung der Modulation der zirkadianen Loss-of-Stellreflex (LORR) 1 als auch beschreiben wirSedierung. 12-Stunden-LD-Zyklen bei konstanter Temperatur und dann auf eine gesteuerte Lichtregelung für 2-5 Tage, je nach Versuchs Frage übertragen: Fliegen sind mit 12 Stunden mitgenommen. Fliegen sind zu Ethanol Dampf in einem Gerät wie der Paddelstange bekannte ausgesetzt. In dieser Vorrichtung werden gesteuerte Mengen von Luft durch Wasser und Alkohol blasen; die Dämpfe werden dann gemischt und in eine Ampulle Gehäuse die Fliegen gerichtet. Alle 5 min die Fliegen für die Nummer, die angezeigt werden Stellreflexe oder haben sich nicht sediert erzielt. LORR Prozentsätze für jeden Zeitpunkt berechnet werden und unter zirkadianen Zeitpunkten oder zwischen Stämmen verglichen entfernt. Die Einfachheit und Zuverlässigkeit der Lieferung Alkohol mit der Paddelstange Alkohol Lieferung kombiniert mit Verhaltensanalyse-Optionen bietet einen bedeutenden Vorteil für circadiane Experimente unter dunklen Bedingungen durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>Alkohol 190 proof</td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belüfter</td><td>Lokale Zoohandlung</td><td></td><td>Wir verwenden Whisper 60</td></tr><tr><td>Silikonschlauch 1/8"</td><td>VWR</td><td>408060-0030</td><td></td></tr><tr><td>120&deg; Y-Verbinder</td><td>VWR</td><td>82017-256</td><td></td></tr><tr><td>Schnellkupplungen</td><td>VWR</td><td>46600-048</td><td></td></tr><tr><td>Rohrschellen aus Kunststoff</td><td>Bell-art products</td><td>132250000</td><td>Entweder dies oder das nächste</td></tr><tr><td>Miniatur-Luftregler</td><td>McMaster-Carr</td><td>8727K11</td><td>Entweder dieses oder das vorherige</td></tr><tr><td>Miniatur-Luftregler-Montagehalterung</td><td>McMaster-Carr</td><td>9891K66</td><td></td></tr><tr><td>Gilmont Größe 12 Durchflussmesser</td><td>VWR</td><td>29895-242</td><td></td></tr><tr><td>Werkzeugclips</td><td>McMaster-Carr</td><td>1722A43</td><td>Zum Halten von Durchflussmessern</td></tr><tr><td>Fläschchen</td><td>VWR</td><td>89092-722</td><td></td></tr><tr><td>Gummistopfen mit zwei Löchern</td><td>VWR</td><td>59585-186</td><td>Passt in Fläschchen</td></tr><tr><td>5 mm Pyrex-Glasröhrchen</td><td>Trikinetics</td><td>PGT5x65</td><td>Passt am besten in den vorherigen Stopfen</td></tr><tr><td>Teflonband</td><td>Baumarkt</td><td></td><td>Um bei Bedarf einen festen Sitz in Verschlüssen zu erreichen</td></tr><tr><td>Gummistopfen mit zwei Löchern</td><td>VWR</td><td>59582-122</td><td>Passend für unsere Flaschen</td></tr><tr><td>Einweg-Glaspipetten</td><td>VWR</td><td>53283-768</td><td>Ablängen und Biegen durch Erhitzen</td></tr><tr><td>Sehr feines Nylonnetz</td><td>VWR</td><td>Verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>15 Watt Glühbirnen</td><td>Baumarkt</td><td></td><td>Deckenleuchte rot</td></tr><tr><td>Fotografische rote Safe-Light-Filter</td><td></td><td></td><td>Rotes Overhead-Licht</td></tr><tr><td>Mini-Taschenlampen mit roten Filtern</td><td>Mag-Light</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

paddelstange: verwaltung alkohol zu flies

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) sind ein etabliertes Modell sowohl für Alkoholforschung und circadianen Biologie. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die innere Uhr moduliert Alkoholempfindlichkeit, aber nicht die Bildung von Toleranz. Hier beschreiben wir unser Protokoll im Detail. Alkohol wird den Fliegen mit dem Paddelstange verabreicht. Bei diesem Aufbau wird gesättigten Alkohol mit Dampf befeuchtete Luft in der Serie Verhältnissen gemischt, und die Fliegen in vier Röhrchen gleichzeitig verabreicht werden. Fliegen sind unter standardisierten Bedingungen, um die Abweichung zwischen den Replikaten minimieren aufgezogen. Drei Tage alte Fliegen der verschiedenen Genotypen oder Behandlungen werden für die Experimente bevorzugt durch Anpassen entfernt von zwei verschiedenen Zeitpunkten (z. B. CT 5 und CT 17) direkte Vergleiche möglich eingesetzt. Während des Versuchs werden entfernt für 1 h in den vorbestimmten Prozentsatz der Alkoholdampf und der Anzahl von Fliegen, die den Verlust des Stellreflexes (LORR) aufweisen ausgesetzt oder Sedation werden alle 5 min gezählt. Die Daten können unter Verwendung von drei verschiedenen statistischen Methoden analysiert werden. Die erste ist die Zeit, bei der 50% der Fliegen ihre Aufrichtungsreflexes verloren bestimmen und eine Analyse der Varianz (ANOVA), um festzustellen, ob wesentliche Unterschiede zwischen den Zeitpunkten vorhanden sein. Die zweite ist die Prozent Fliegen, die LORR zeigen nach einer bestimmten Anzahl von Minuten, gefolgt von einer ANOVA-Analyse zu bestimmen. Die letzte Methode ist, um die gesamte Zeitreihe mit multivariaten Statistiken zu analysieren. Das Protokoll kann auch für Nicht-circadianen Experimente oder Vergleiche zwischen Genotypen verwendet werden.

Die Modulation der zirkadianen Alkohol-Empfindlichkeit mit dem 50% LORR als Markierung. Ein repräsentatives Beispiel zeigt circadiane Modulation in Alkohol Empfindlichkeit während des Tages ist in Abbildung 2 dargestellt. LORR wurde an sechs Zeitpunkten während der 2. Tag der DD in Canton-S gemessen und die 50% LORR wurde für jeden Zeitpunkt bestimmt. Analyse zeigte einen signifikanten Effekt der Tageszeit (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p &lt;0,001, N ...

Drosophila ist als bedeutsamer Modellsystem zum Zerlegen der zellulären und molekularen Grundlagen von Verhaltensreaktionen auf Alkohol entstanden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Sammlung von Alkohol Empfindlichkeit von Daten in einem zirkadianen Kontext, die leicht auf andere Experimente angewendet werden kann und ist für Bachelor-Forschung gut geeignet.

Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, alkoholinduzierte Verhaltensweisen bei Drosophila mithilfe einer kostengünstigen und einfach zusammenzubauenden Versuchsanordnung zu messen, die sich besonders gut für die Forschung im Rahmen von Bachelorarbeiten oder für Forschende, die neu in der Chronobiologie sind, eignet. Dies wird erreicht, indem zunächst die Fliegenleiste zusammengestellt wird, wodurch gleichzeitige Vergleiche mehrerer Fliechengruppen ermöglicht werden.Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, Drosophila unter definierten Hell-Dunkel-Wechseln zu züchten und altersgerechte Fliegen für das Experiment zu sammeln. Anschließend werden die Fliegen definierten Konzentrationen von Alkoholdampf ausgesetzt und die Daten erfasst. Letztlich kann die Messung des Verlusts des Aufschreibreflexes oder der Sedierung Unterschiede in der Alkoholempfindlichkeit zwischen den Gruppen aufzeigen, entweder basierend auf der Tageszeit oder der Genetik.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Beobachtungsschritte aufgrund der Schwierigkeiten bei der Verhaltensbeobachtung und des schwachen roten Lichts schwer zu erlernen sind und es zudem herausfo

the-flybar-administering-alcohol-to-flies

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein einfacher Test, um die sedierende Wirkung von Ethanol auf...

Ein einfacher Weg zu Ethanol Empfindlichkeit in Flies Measure

Dieses Video beschreibt, wie eine Injektion von lebenden erwachsenen Fliegen durchgeführt wird und enthält ein Beispielprotokoll, in dem markierte Partikel und Trypanblau in den Bauch von Fliegen injiziert werden, um die Phagozytose zu testen.

Injektion von adulten Drosophila-Fliegen: Eine Methode der Verabreichung von Verbindungen oder Etiketten

Dieses Video zeigt die Nanoinjektion von Bakteriensuspension in die Körperhöhle der Fliege, was zu einer bakteriellen Vermehrung und Infektion führt. Die Immunantwort der Fliege beseitigt einige Bakterien, während andere der Immunclearion entgehen und im Wirt überleben und eine Infektion verursachen.

Infizieren von Fliegen mit Bakteriensuspension unter Verwendung eines Nanoinjektors

Dieses Video zeigt eine Technik, um Drosophila zu infizieren, indem ein pathogenes Bakterium direkt in ihre Körperhöhle eingeführt wird. Diese Methode umgeht Epithelbarrieren und andere passive Abwehrmechanismen und ermöglicht die Induktion einer systemischen Infektion. Nach der Infektion wird die resultierende Immunantwort durch Überwachung der Fliegensterblichkeit und Durchführung nachgeschalteter Assays bewertet.

Eine septische Nadelstichtechnik, um systemische bakterielle Infektionen bei Fliegen einzuführen

Einfache Assays zur Messung der Ethanolsensitivität und schnellen Toleranz in Drosophila erleichtern die Verwendung dieses Modellorganismus zur Untersuchung dieser wichtigen ethanolbezogenen Verhaltensweisen. Hier wird ein relativ einfacher, skalierbarer Assay zur Messung der Ethanolsensitivität und der schnellen Toleranz bei Fliegen beschrieben.

Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in<em&gt; Drosophila</em

Beschrieben hier ist die Verwendung von mehreren hausgemachten Werkzeugen zu übertragen, kühlen, und töten erwachsene Drosophila, sowie Glaskultur Fläschchen zu reinigen und Eier zu sammeln. Diese Werkzeuge sind einfach zu machen und sind ziemlich effizient im Umgang mit Drosophila.

Einfache hausgemachte Werkzeuge, um Fruchtfliegen zu behandeln —Drosophila melanogaster

Aktuelle Methoden zur Messung der Alkoholempfindlichkeit in Drosophila wurden entwickelt, um Gruppen von Fliegen zu testen. Wir präsentieren einen einfachen, kostengünstigen, hochdurchsatzhohen Test zur Beurteilung der Alkoholsedationsempfindlichkeit bei einer großen Anzahl von Einzelfliegen. Das Verfahren erfordert keine speziellen Werkzeuge und kann in jedem Labor mit gängigen Materialien durchgeführt werden.

Hochdurchsatzmethode zur Messung der Alkoholsedationszeit einzelner Drosophila melanogaster

Der Flypub-Assay misst das Verhalten, das die Fruchtfliege Drosophila melanogaster unter dem Einfluss von Ethanol zeigt. Der Assay kann leicht von Experimentatoren auf allen Ebenen gemeistert und auf verschiedene verdampfte Reize angewendet werden, was Substanzmissbrauch und Suchtstudien erleichtert.

Flypub zur Untersuchung von Ethanol induzierte Verhaltenshemmung und Sensibilisierung

Die Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) wird häufig in der biologischen und toxikologischen Forschung eingesetzt. Um den Nutzen von Fliegen zu erweitern, haben wir ein Instrument entwickelt, das serielle Anästhesie-Array, das mehrere Fliegenproben gleichzeitig flüchtigen Allgemeinanästhetika (VGAs) aussetzt, wodurch es möglich ist, die Kollateraleffekte (toxisch und schützend) von VGAs zu untersuchen.

Das serielle Anästhesie-Array für die Hochdurchsatzuntersuchung flüchtiger Wirkstoffe mit Drosophila melanogaster

In dieser Arbeit wird die Laborerhaltung (einschließlich Paarung und Fütterung) der unteren zweiflüglerischen Fliege Bradysia (Sciara) coprophila beschrieben.

Laborerhaltung der Unterdipteranen Fliege Bradysia (Sciara) coprophila: Ein neuer/alter aufstrebender Modellorganismus

Erfahren Sie, wie Sie mit einer kostengünstigen Fliegenbar Alkohol-induzierte Verhaltensänderungen bei Drosophila messen. Diese Methode erfasst zirkadiane Rhythmen und eignet sich ideal für die Ausbildung von Studierenden.

Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies

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