Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, alkoholinduzierte Verhaltensweisen bei Drosophila mithilfe einer kostengünstigen und einfach zusammenzubauenden Versuchsanordnung zu messen, die sich besonders gut für die Forschung im Rahmen von Bachelorarbeiten oder für Forschende, die neu in der Chronobiologie sind, eignet. Dies wird erreicht, indem zunächst die Fliegenleiste zusammengestellt wird, wodurch gleichzeitige Vergleiche mehrerer Fliechengruppen ermöglicht werden.

Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, Drosophila unter definierten Hell-Dunkel-Wechseln zu züchten und altersgerechte Fliegen für das Experiment zu sammeln. Anschließend werden die Fliegen definierten Konzentrationen von Alkoholdampf ausgesetzt und die Daten erfasst. Letztlich kann die Messung des Verlusts des Aufschreibreflexes oder der Sedierung Unterschiede in der Alkoholempfindlichkeit zwischen den Gruppen aufzeigen, entweder basierend auf der Tageszeit oder der Genetik.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Beobachtungsschritte aufgrund der Schwierigkeiten bei der Verhaltensbeobachtung und des schwachen roten Lichts schwer zu erlernen sind und es zudem herausfordernd ist zu bestimmen, welche Flüge ihren Schreibreflex verloren haben und welche nicht. Bauen Sie zuerst die Fliegenstange zusammen. Beginnen Sie mit dem Zusammenbau des Luftstroms.

Verbinden Sie ein kurzes Stück flexible Silikonschlauchleitung entweder mit einer Gebäude-Luftzufuhr oder einem Aquarium-Lufter, um eine Luftzufuhr bereitzustellen. Teilen Sie die Luftzufuhr mit einem Y-Verbinder auf. Schließen Sie den ersten Zweig an einen Regler an.

Es steuert die Gesamtmenge an Luft, die durch das System strömt. Schließen Sie den zweiten Abzweig an einen Schnellanschluss an. Dadurch kann der Luftstrom nach Bedarf unterbrochen werden, ohne die kalibrierte Luftzufuhr zu beeinflussen.

Fügen Sie einen Y-Anschluss hinzu und verbinden Sie jeden abzweigenden Schlauch mit einem Luftstromregler. Anschließend verbinden Sie jeden Regler mit einem Luftdurchflussmesser. Schneiden Sie nun einteilige Glaspipetten mit einem Volumen von einem Milliliter und formen Sie eine rechte Winkelbiegung in jeden Abschnitt.

Diese dienen als starre Bogenrohre in der Versuchsanordnung. Führen Sie die gerade Glaspipette für den Luftzulauf durch ein Loch ein und verlängern Sie sie bis auf einen Zentimeter über dem Boden in die Flüssigkeit hinein. Führen Sie einen Glas-Bogen durch das andere Loch ein, bis er gerade in die Flasche hineinragt.

Verwenden Sie diese Anschlüsse, um den Luftstrom aus jeder Flasche an einem Y-Verbinder zusammenzuführen. Verbinden Sie die Luftdurchflussmesser mithilfe von flexiblen Schläuchen mit dem geraden Abschnitt einer Pipette. Diese dienen als Luftzufuhr für die beiden Lösungsflaschen.

Wasser oder Alkohol, beide Lösungsflaschen in ein Wasserbad stellen, das zwei Grad höher als die Umgebungslufttemperatur eingestellt ist. Verschließen Sie die Flaschen mit Gummistöpseln, die zwei Löcher mit Silikonschläuchen enthalten. Das andere Ende des Y-Stücks an eine Flasche mit einem zweilöchrigen Gummistöpsel anschließen.

Der Luftstrom aus diesem Mischkolben leitet verdampften Alkohol und Wasser zu den Beobachtungsgefäßen. Teilen Sie den Abluftstrom aus dem Mischkolben zwei- oder dreimal auf, um vier oder acht kleinere Luftströme zu erhalten – einen für jedes Beobachtungsgefäß.

Verwenden Sie weiterhin Silikon-Schläuche. Die Beobachtungsgefäße sind leere Fliegengefäße, die mit einem zweilochigen Gummistopfen verschlossen sind, der einen Einlass und einen Auslass für den Alkoholdampf besitzt. Glasschläuche passen in die Löcher des Stopfens.

Bedecken Sie die Enden des Glasrohrs mit einem Netzmaterial. Befestigen Sie das Netz mit einem kleinen Stück flexiblen Kunststoffrohrs. Führen Sie dieses Rohr durch das erste Loch, bis es etwa bis zur halben Länge des Fläschchens reicht.

Falls erforderlich, Teflonband verwenden, um einen festen Sitz zu erzielen. Das zweite Glasrohr mit dem Netzwerk so einsetzen, dass es bündig mit der Innenseite des Gummistopfens abschließt. Die entsprechenden Fraktionen der beiden durch Alkohol oder Wasser geleiteten Luftströme mischen.

Überwachen Sie den Luftdruck kontinuierlich und nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen vor, um die gewünschte Mischung aus Alkohol- und Wasserdampf im Mischgefäß aufrechtzuerhalten. Für diese Art von Experiment muss stets sichergestellt werden, dass der Raum ausreichend belüftet ist. Um Variationen zwischen den Wiederholungen zu minimieren, ist größte Sorgfalt bei den Haltungsbedingungen der Fliegen erforderlich.

Fliegen müssen unter geringer Bevölkerungsdichte gezüchtet werden und stark synchronisiert sein, damit Fliegen desselben Alters und derselben Kohorte miteinander verglichen werden können. Annäherung an die Dämmerung der Fliegen. Sammeln Sie frisch geschlüpfte Tiere und lagern Sie sie 24 Stunden lang in Aufbewahrungsröhrchen mit einer kleinen Menge Nahrung mit hoher Agarkonzentration unter gleichen Bedingungen.

Am nächsten Tag die gesammelten Fliegen mithilfe eines Aspirators in Kohorten von jeweils etwa 30 Fliegen aufteilen und die Kohorten in frische Röhrchen überführen, um die circadiane Modulation des Verhaltens zu testen. Bereiten Sie ausreichend viele Kohorten vor, um jede Bedingung zu sechs gleichmäßig verteilten Zeitpunkten am Testtag auf zirkadiane Verhaltensmodulation zu untersuchen. Halten Sie die Fliegen außerdem zwei Tage vor dem Test unter konstanter Dunkelheit bei 25 Grad Celsius.

Unabhängig vom experimentellen Design sollten die Fliegen mindestens eine Stunde vor dem Verhaltensassay in den Versuchsraum überführt werden, der nur mit schwachem rotem Licht beleuchtet ist. Führen Sie die Experimente unter schwachem rotem Licht durch, um sicherzustellen, dass photoanreizende Effekte die Ergebnisse nicht beeinflussen. Vor dem Experiment sollte mindestens 10 Minuten lang Luft durch das System geleitet und der Luftfluss kalibriert werden.

Unter die Beobachtungsgefäße. Legen Sie ein Stück weißes Papier unter, um die Sichtbarkeit der Fliegen durch erhöhten Kontrast zu verbessern. Sobald sich der Luftstrom stabilisiert hat, trennen Sie die Schnellkupplung und füllen jeweils eine Kohorte von 30 Fliegen in jedes Beobachtungsgefäß.

Testen Sie bei jedem Durchlauf der Fliegenstange jede experimentelle Bedingung. Dies erhöht die Robustheit des Experiments und minimiert den Einfluss täglicher Schwankungen. Sobald alle Beobachtungsgefäße beladen sind, schließen Sie die Luftzufuhr erneut an und starten Sie die Timer.

Verwenden Sie einen Timer, um die Gesamtdauer der Alkoholexposition zu verfolgen, und den anderen, um im Verlauf des Versuchs Fünf-Minuten-Intervalle herunterzuzählen. Überwachen Sie die Luftströmungen und nehmen Sie erforderliche Anpassungen vor, um sie konstant zu halten. Im Allgemeinen stabilisieren sich die Luftströmungen alle fünf Minuten mithilfe einer roten Lichtlampe.

Zählen Sie die Anzahl der Fliegen, die ihren Schreibreflex verloren haben. Halten Sie die Lampe mindestens 30 cm von den Gefäßen entfernt. Geben Sie einen kräftigen Stoß auf das Gefäß und zählen Sie, wie viele Fliegen innerhalb von etwa vier Sekunden nicht wieder in die Schreibposition kommen.

Diese Fliegen können ihre Beine und Flügel möglicherweise immer noch bewegen, sind jedoch nicht in der Lage, sich wieder aufzurichten. Wenn die Fliege keine Gliedmaßen bewegt, ist sie vollständig sediert. Dies kann als separates Kriterium gegenüber dem Fehlen eines Schreibreflexes gewertet werden.

Die Sitzung dauert etwa eine Stunde; am Ende zählen Sie die Gesamtanzahl der Fliegen in jeder Probe mithilfe des beschriebenen Protokolls. Eine circadiane Modulation der Alkoholsensitivität wurde gemessen. Das Fehlen des Schreibreflexes wurde zu sechs Zeitpunkten während des zweiten Dunkeltages bei Canton S gemessen; die Tageszeit hatte einen signifikanten Einfluss auf die Dauer.

Die Hälfte der Fliegen konnte sich nicht schreiben. Der Prozentsatz der Kantonfliegen, die nach 40 Minuten mit 30 % Alkoholdampf sediert waren, wurde am subjektiven Tag CT fünf und in der Nacht CT 17 gemessen.

Es wurde festgestellt, dass signifikant weniger Fliegen während des subjektiven Tages als in der Nacht sediert wurden. Mithilfe einer Zeitreihe wurden Unterschiede im Schreibreflex und in der Sedierung aufgezeigt, wenn Canton-s-Fliegen mit Fliegen verglichen wurden, die die white-1-1-1-8-Mutation tragen. Im Canton-S-Hintergrund zeigten die white-1-1-1-8-Fliegen einen besseren Schreibreflex als Reaktion auf Ethanol-Dampf im Vergleich zu Canton S. Unterschiede zwischen den white-1-1-1-8-Mutanten und Wildtyp-Fliegen ergaben sich ebenfalls in der Sedierungsrate.

Der Unterschied ist höchstwahrscheinlich auf die veränderten Spiegel biogener Feinde aufgrund der white 1 1 1 8-Mutation zurückzuführen. Daher ist es notwendig, Verhaltensreaktionen, die auf die in vielen transgenen Linien vorhandene white 1 1 1 8-Mutation zurückgehen, zu kontrollieren. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Alkohol an Fliegen mithilfe des Fly Barns verabreicht wird.

Es ist entscheidend, dass die Fliegen systematisch gesammelt werden und dass die Beobachtungen im schwachen roten Licht so standardisiert wie möglich erfolgen.