Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die interzelluläre Kommunikation über Gap-Junction-Kanäle und HEMI-Kanäle durch Quantifizierung der Ausbreitung der interzellulären Kalziumwelle zu untersuchen, die durch mechanische Stimulation in Monolagen primärer Hornhautendothelzellen hervorgerufen wird. Dies wird erreicht, indem zunächst die primären Hornhautendothelzellen aus frischen Rinderäugeln isoliert werden. Als zweiter Schritt werden zwei bis drei Tage nach der Aussaat in Kammerobjektträgern die konfluenten Zellmonolagen mit dem fluoreszierenden kalziumsensitiven Farbstoff flu O 4:00 AM beladen. Anschließend wird eine kontrollierte und lokal begrenzte mechanische Stimulation auf eine einzelne Zelle der Monolage ausgeübt, um eine interzelluläre Kalziumwelle auszulösen, die am konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht wird.

Die Ergebnisse zeigen die Ausbreitung der interzellulären Kalziumwellenausbreitung. Letztendlich wird die Hemmung von Gap-Junction-Kanälen und HEMI-Kanälen verwendet, um die Eigenschaften und die Regulation verschiedener Connexin- und Panexin-Isoformen, die Gap-Junction-Kanäle und HEMI-Kanäle bilden, aufzuklären. Der Hauptvorteil der durch mechanische Stimulation induzierten interzellulären Kalziumwellenausbreitung liegt darin, dass sie eine einfache und zuverlässige Methode bietet, um den Beitrag und die Eigenschaften von verbindenden und axonalen Kanälen auf nicht-invasive Weise zu untersuchen.

Außerdem stützt sich die Methode auf die in den untersuchten zellulären Systemen vorhandenen physiologischen Signalmoleküle und Signalwege. Schließlich ist sie leicht auf eine Vielzahl von Zellsystemen anwendbar, einschließlich primärer Zellen und Zellmodelle, die bestimmte Connexin- oder PanIN-Isoformen ektopisch exprimieren. Diese Methode kann Einblicke in die Funktion und dynamische Regulation von auf Connexin- und PanIN-basierten Gap-Junction-Kanälen und HEMI-Kanälen gewähren, und zwar durch die Verwendung von siRNA-vermittelter Herunterregulation endogener Connexine oder PanINs in bestimmten Isoformen sowie durch den Einsatz selektiver Inhibitoren von Gap-Junction-Kanälen und HEMI-Kanälen.

Dieses System ist keineswegs auf beide Hornhautendothelzellen beschränkt. Es ist praktisch für jeden Zelltyp und auch komplexere Gewebe anpassbar. Bei diesem Verfahren wird ein frisch enukleiertes Auge von einer Kuh verwendet, die nicht älter als 18 Monate war und nicht länger als fünf Minuten postmortal ist.

Das wurde in Earle's Balanced Salt Solution und 1%iger Jodlösung bei vier Grad Celsius ins Labor transportiert. Überführen Sie zuerst das Auge in eine 100 Millimeter mal 20 Millimeter große Petrischale. Spülen Sie anschließend das Auge mit EBSS, das 1% Jod enthält, ab.

Anschließend ab diesem Punkt mit einer Lösung, die 70 % Ethanol enthält, sterilisieren. In einer sterilen Haube arbeiten. Die Hornhaut vorsichtig aus dem Auge herausschneiden und in eine 35 Millimeter mal 10 Millimeter große Petrischale mit EBSS geben, wobei die epitheliale Zellschicht nach oben zeigt.

Entfernen Sie vorsichtig alle noch am Kornea anhängenden Reste des Irisgewebes. Falls erforderlich, überführen Sie die Kornea in eine andere Schale mit EBSS, wobei die endotheliale Zellschicht nach oben zeigt, und spülen Sie sie anschließend zweimal mit EBSS ab. Danach legen Sie die Kornea mit der endothelialen Schicht nach oben in eine Sanduhrform und bedecken sie mit Wachstumsmedium.

Zum Spülen entfernen Sie das Medium mit einer Saugpipette. Geben Sie 300 Mikroliter einer 0,5 Gramm pro Liter Tripsin-Lösung auf die endotheliale Schicht der Hornhaut. Stellen Sie die Sanduhr mit der Hornhaut in eine abgedeckte Petrischale und überführen Sie sie für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator.

Nachdem die Sanduhr entnommen wurde, wurden die Endothelzellen vorsichtig mit einer flammenglasierten, hakenförmigen Glas-Pasteurpipette von der Hornhaut abgeschabt. Die Lösung, die die Endothelzellen enthält, abpipettieren und zu einem 25 Quadratzentimeter großen Kulturkolben hinzufügen, der vier Milliliter Kulturmedium enthält. Anschließend 300 Mikroliter Wachstumsmedium auf die Hornhaut auftragen.

Wiederholen Sie das Abkratzen und geben Sie die Lösung mit den endothelialen Zellen dem Kulturfläschchen hinzu. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, dann stellen Sie die Kulturfläschchen mit den kornealen endothelialen Zellen im Wachstumsmedium in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Zwei Tage später fügen Sie sechs Milliliter Kulturmedium hinzu und erneuern das Wachstumsmedium alle zwei Tage.

Die Zellen sollten innerhalb von sieben bis zehn Tagen nach der Isolierung bis zur Passage konfluent sein. Zunächst das Kulturmedium abpipettieren und die Zellen anschließend zweimal mit EBSS spülen. Danach zwei Milliliter Trypsin-Lösung zu den Zellen geben und das Kolben in den Inkubator für drei bis vier Minuten stellen.

Fügen Sie dann 12 Milliliter Wachstumsmedium hinzu und pipettieren Sie das Medium dreimal auf und ab, um die Zellen zu verteilen. Anschließend zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hemozytometers oder eines automatischen Zellzählgeräts. Geben Sie 165.000 Zellen in zweifache Kulturslides.

Bereiten Sie anschließend 75 cm² große Kulturkolben für einen neuen Passagierschritt mit einer Dichte von 6.250 Zellen pro cm² vor, geben Sie frisches Kulturmedium bis zu einem Gesamtvolumen von 25 mL hinzu und stellen Sie die Kolben sowie die Kammerobjektträger in den Inkubator. Das Medium wird alle zwei Tage erneuert, und die Konfluenz der Zellschicht sollte innerhalb von drei bis vier Tagen erreicht sein. Beladen Sie zunächst die Zellen auf dem Kammerobjektträger mit 10 µM Fluoh-4:00 AM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung für 30 Minuten bei 37 °C unter leichtem Schütteln, während die Zellen in Fluoh-4:00 AM inkubieren. Koppeln Sie eine Glas-Mikropipette mit einem Nadeldurchmesser von weniger als einem Mikrometer an einen Piezo-Elektrokrystall-Nanopositionierer und verbinden Sie diese mit einem Verstärker, der an einem Mikromanipulator befestigt ist.

Stellen Sie die Spannung des Nano-Positionierers auf einen Wert zwischen 0,2 und 1,5 Volt ein. Entfernen Sie die 4:00 AM-Lösung. Waschen Sie die Zellen anschließend fünfmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und inkubieren Sie die Zellen danach mindestens fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBS, bevor Sie die Messung durchführen.

Angeregt mit 488 Nanometern durch einen Argonlaser und unter Verwendung des Strahlteilers HFT 48. Sammeln Sie die Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern mit einem Langpass-Emissionsfilter, LP 505, wobei die Blende hier auf das Minimum eingestellt ist; dabei wird ein Öl-Immersion-Objektiv mit 40-facher Vergrößerung verwendet. Platzieren Sie die Kammerkammer auf dem Objekttisch eines konfokalen Mikroskops und suchen Sie einen Bereich mit konfluenten Zellen.

Bewegen Sie als Nächstes den Mikromanipulator, um die Glas-Mikropipette so zu positionieren, dass sie in einem Winkel von 45 Grad die Zellmembran berührt. Bedienen Sie den Mikromanipulator, um die Glas-Mikropipette kurzfristig mit weniger als 1 % der Einzelzellmembran in Kontakt zu bringen und die Zelle für eine Sekunde mechanisch zu stimulieren. Anschließend messen Sie räumliche Änderungen der Kalziumionenkonzentration nach der mechanischen Stimulation, indem Sie mit einem konfokalen Mikroskop Bilder aufnehmen und speichern.

Zeichnen Sie abschließend mithilfe der Software des konfokalen Mikroskops einen polygonalen Bereich von Interesse, um die gesamte Oberfläche der reaktiven Zellen zu definieren. Mechanisch induzierte Kalziumtransienten werden unter Kontrollbedingungen in bovinen Hornhautendothelzellen an verschiedenen Zeitpunkten anhand repräsentativer pseudofarbiger Fluoreszenzbilder dargestellt, wobei die Fluoreszenzintensitäten vor der Stimulation im ersten Bild gezeigt sind. Der weiße Pfeil im zweiten Bild markiert die mechanisch stimulierte Zelle.

Die Kalziumwelle breitet sich auf sechs benachbarte Zellschichten aus, wobei eine Gesamtfläche von Zellen erreicht wird, die eine aktive Fläche von 62.870 Quadratmikrometern ergibt. Der Liniengraph zeigt den zeitlichen Verlauf des normalisierten Fluoreszenzwerts oder NF in der mechanisch stimulierten Zelle, gekennzeichnet als ms, sowie den Durchschnittswert des NF in den benachbarten Zellschichten eins bis fünf, die im Graphen als MB eins bis MB fünf beschriftet sind. Diese Bilder zeigen signifikante Veränderungen in der Ausbreitung interzellulärer Kalziumwellen nach Behandlung mit exogenen Nukleotiden im linken Graphen und nach Behandlung mit Ecto-Nukleotidase-Inhibitoren im rechten Graphen. Im Detail zeigt der linke Graph eine signifikante Abnahme der aktiven Fläche nach Behandlung von bovinen Hornhautendothelzellen mit den exogenen Aras Aase sechs und Aase sieben, die ATP und ADP hydrolysieren und dadurch den pericrinen interzellulären Kommunikationsweg hemmen.

Das Sternchen kennzeichnet einen P-Wert von weniger als 0,001 bei Vorhandensein im Vergleich zur Abwesenheit von Ace. Das Diagramm auf der rechten Seite zeigt einen signifikanten Anstieg der aktiven Fläche nach der Behandlung von BCEC mit einem selektiven ecto-Nukleotid-Inhibitor, A RL 6 7 1 56, wodurch der pericrine interzelluläre Kommunikationsweg verstärkt wird. Das Sternchen kennzeichnet einen P-Wert von weniger als 0,001 bei Vorhandensein im Vergleich zur Abwesenheit von a RL, sobald dies beherrscht ist.

Diese Technik kann bei ordnungsgemäßer Durchführung für ein Experiment unter einer Bedingung in fünf bis zehn Minuten durchgeführt werden. Die Durchführung einer ganzen Versuchsreihe, anhand derer verschiedene Bedingungen verglichen werden können, erfordert einen Tag, um statistische Schlussfolgerungen zu ziehen. Unabhängige Experimente müssen an verschiedenen Tagen und mit verschiedenen Chargen isolierter Zellen durchgeführt werden.

Die Messung und Quantifizierung der Ausbreitung intrazellulärer Kalziumwellen ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung der zellbiologischen Regulation verschiedener Connexin-Isoformen als Gap-Junction-Kanäle und Hemi-Kanäle. Ich möchte außerdem betonen, dass diese Methode nicht isoliert betrachtet werden sollte, sondern durch andere molekulare und funktionelle Ansätze ergänzt werden muss, die von der Dye-Transfer- bis zur ATP-Freisetzungsmessung und Elektrophysiologie reichen.