Name: Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Erfahren Sie, wie mechanische Stimulation Calciumwellen in bovinen Endothelzellen auslöst. Diese Methode untersucht interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions und Hemikanäle mittels konfokaler Mikroskopie.

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Forschungsarbeiten im Labor durchgeführt wurde durch Zuschüsse aus dem Forschungsgemeinschaft - Flandern (FWO; Zuschuss Zahlen G.0545.08 und G.0298.11), der Interuniversity Attraction Poles Program (Belgian Science Policy; Grantnummer P6/28 und P7/13) und wird in einer FWO-gestützte Forschung eingebettet. CDH ist ein Post-Doc-Stipendiat der Forschungsgemeinschaft - Flandern (FWO). Die Autoren sind sehr dankbar für alle gegenwärtigen und ehemaligen Mitgliedern des Laboratory of Molecular and Cellular Signaling (KU Leuven), Dr. Srinivas SP (Indiana University School of Optometrie, USA), das Labor von Dr. Leybaert (Universität Gent) und der Dr. Vinken (VUB), die hilfreichen Diskussionen vorgesehen, optimierte Verfahren oder wurden in der Entwicklung von Werkzeugen für die Studie von Connexin hemichannels beteiligt.

1. Isolierung von Endothelzellen Bevor Sie beginnen: Isolieren Sie die Zellen aus den frischen Augen, von einem lokalen Schlachthof, so bald wie möglich nach enucleating das Auge erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Auge von einer Kuh von maximal 18 Monate alt, nur fünf Minuten post mortem und konserviert in Balanced Salt Solution Earle wurde entkernt - 1% Jod-Lösung bei 4 ° C für den Transport zum Labor. <ol><li> Nehmen Sie das Auge aus der Balanced Salt Solution Earle - 1% Jod-Lösung und legen Sie sie in eine Petrischale (100 x 20 mm). </li><li> Sterilisieren das Auge mit einer Lösung, die 70% Ethanol und spülen Sie mit Balanced Salt Solution Earle mit 1% Jod. </li><li> Von diesem Schritt an, in einem sterilen Abzug arbeiten. Sorgfältig sezieren die Hornhaut aus dem Auge und legen Sie sie in einer Petrischale (35 x 10 mm) mit Earle-Balanced Salt Solution mit dem Epithelzellschicht nach oben. Entfernen Sie vorsichtig das restliche Irisgewebe still der Hornhaut angebracht, wenn nötig. </li><li> Übertragen Sie die Hornhaut Balanced Salt anderen Earle-Lösung enthält Petrischale mit dem Endothelzellschicht nach oben und spülen Sie zweimal mit Balanced Salt Solution Earle. </li><li> Übertragen Sie die Hornhaut mit dem Endothel nach oben in eine Sanduhr, die einen schalenförmigen Gericht ist, und bedecken Sie es mit Nährmedium. Das Nährmedium besteht aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 25 mM Glukose, 10% fötales Rinderserum, 6,6% L-Glutamin, 2,5 ug / ml Amphotericin B und 1% Antibiotika-Antimykotika-Mischung, die 10.000 Einheiten / ml Penicillin, 10.000 pg / ml Streptomycin und 25 ug / ml Amphotericin B. </li><li> Entfernen Sie das Medium mit einem Saugpipette. </li><li> Bewerben 300 ul einer Trypsin-Lösung (0,5 g / L) auf die endotheliale Schicht der Hornhaut (all die Schritte, die Trypsin enthalten sind fertig mit der gleichen Konzentration). </li><li> Legen Sie die Sanduhr, die die Hornhaut in einem abgedeckten Petrischale und steckte es in die incubator für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Vorsichtig kratzen die Endothelzellen von der Hornhaut mit einem feuerpolierten hakenförmigen Pasteurpipette aus Glas in einer sterilen Haube. </li><li> Saugen Sie die Lösung, die die Endothelzellen und fügen Sie ihn in Kulturflaschen (25 cm 2) mit 4 ml Kulturmedium. </li><li> Bewerben 300 ul Wachstumsmedium auf die Hornhaut und wiederholen Sie den Schaben und fügen Sie die Lösung, die die Endothelzellen der Kulturflasche. </li><li> Wiederholen Sie diesen letzten Schritt (1.11) noch einmal. </li><li> Legen Sie den Kulturflaschen mit den Endothelzellen in das Nährmedium im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach zwei Tagen, 6 ml Kulturmedium. </li><li> Aktualisieren Sie die Wachstumsmedium jeden zweiten Tag. </li></ol> 2. Cell Culture <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium und die Zellen zweimal mit Balanced Salt Solution Earle, wenn Konfluenz erreicht ist (max. About 10 Tage nach Isolation). </li><li> 1,5 ml Trypsin-Lösung zu den Zellen, um sie zu lösen und der Kolben wird in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 3 bis 4 min. </li><li> In 12 ml Wachstumsmedium. Pipettieren die mittel dreimal in und aus, um die Zellen verteilen und zählen Sie die Zellen. </li><li> Seed die Zellen mit einem variablen Anteil in Abhängigkeit von der Zelldichte und steckte sie in den Inkubator. Bereiten Sie zwei gut chambered Dias (mit einer Fläche von 4,2 cm 2) mit einer Zellzahl von 165.000 Zellen (Zelldichte 39.286 pro cm 2). Bereiten 80 cm 2 Kulturflaschen für eine neue Stelle bei einer Dichte von 6,250 pro cm 2, und fügen Sie frisches Kulturmedium bis zu einem Gesamtvolumen von 25 ml. </li><li> Aktualisieren Sie die Medium alle zwei Tage. </li><li> Konfluenz der Zellschicht wird nach 3 bis 4 Tagen erreicht. Verwenden Zellen für Experimente. </li><li> Bei Konfluenz der Zellschicht in den Kolben erreicht wird, die Schritte 2.1 bis 2.6. Zellkulturen bis zu Passage 2 kann f verwendet werdenoder Experimente. </li></ol> 3. Mechanische Stimulation zur Induktion Calcium Welle <ol><li> Legen Sie die Zellen in der Kammer-Objektträger mit 10 uM Fluo-4 AM in Phosphat-gepufferter Salzlösung für 30 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Fluo-4 AM Lösung, waschen Sie die Zellen fünfmal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, brüten die Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung und lassen die Zellen für mindestens 5 min bei Raumtemperatur vor der Messung. </li><li> Excite bei 488 nm mit Argon-Laser und Nutzung Strahlteiler HFT 488, sammeln die Fluoreszenzemission bei 530 nm mit einem Langpass Emission Filter LP 505, setzen Sie die Lochkamera mindestens. Verwenden Sie eine Öl-Immersion 40X-Objektiv (Air, 1.2 NA). In Experimenten mit ARL-67156, verwenden Sie einen 10X-Objektiv (Air, 0,3 NA). </li><li> Suche nach einem Bereich, in dem die Zellen konfluent auf dem konfokalen Mikroskop. </li><li> Position der Pipette, so dass es bei 45 ° in Bezug auf die Kammern Rutsche und Berühren der Zellmembran.Provozieren eine kurze (≈ 1 sec) mechanische Stimulation zu einer einzigen Zelle. Die mechanische Stimulation besteht aus einer akuten und der Kurz-bleibende Verformung der Zelle berühren, weniger als 1% der Zellmembran mit einer Glas-Mikropipette (Spitzendurchmesser &lt;1 um), die mit einem piezoelektrischen Kristall Nanopositionierer, über einen Verstärker, der betrieben angebracht an einem Mikro-Manipulator. Die Glasmikropipetten sind mit einer Mikroelektrode Abzieher gemacht. Stellen Sie sicher, dass die Nanopositionierer durch eine Spannung zwischen 0,2 und 1,5 V ist bei der mechanischen Stimulation betrieben. Eine höhere Spannung als 1,5 V kann in der Zelle führen. Für jede Zelle Art und Zustand, muss die optimale Spannung für mechanische Stimulation ohne Zellschäden sorgfältig durch Anwendung einer Reihe von Spannungen ab Low (0,2 V) bis hoch (1,5 V) Spannung bestimmt werden. Die Spannung ist ein Maß für die Kraft der Stimulation da diese Spannung die mechanischen Spannungen und Dehnungen, die auf der Zellmembran angewendet werden. DieKraft der mechanischen Stimulation kann durch Multiplizieren der mechanischen Beanspruchung mit der Fläche berechnet werden. Da sowohl der Bereich (&lt;3,14 um 2) und die mechanische Beanspruchung sehr gering sind, ist die Kraft der mechanischen Stimulation gering. (Beachten Sie, dass, wenn eine Zelle beschädigt ist, die Fluoreszenz tritt aus der Zelle und der Zelle dunkel wird.) </li><li> Messen räumlichen Veränderungen in [Ca 2 +] i nach mechanischer Stimulation mit dem konfokalen Mikroskop. </li><li> Sammeln und Speichern von Bildern. </li><li> Zeichnen einer polygonalen Region von Interesse, um die gesamte Oberfläche der ansprechenden Zellen (aktive Fläche, AA) mit der Software des konfokalen Mikroskops zu definieren. </li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Manuskript, beschreiben wir eine einfache Methode, um intrazelluläre Ca 2 +-Wellenausbreitung in Monoschichten von primären bovinen Endothelzellen zu messen, indem sie eine lokalisierte und kontrollierte mechanische Stimulation mit einer Mikropipette. Mechanisch stimulierten Zellen mit einer lokalen Erhöhung der intrazellulären IP 3 und Ca 2 + reagieren, die beide wesentliche intrazelluläre Signalmoleküle, die eine intrazelluläre Ca 2 +-Wellenausbreitung 11,67 anzutr...

Interzellulären Kommunikation und Signalisierung für die Koordinierung der physiologischen Prozesse in Reaktion auf extrazelluläre Agonisten an das Gewebe und ganzen Organniveau 1,2 erforderlich. Der direkte Weg der interzellulären Kommunikation wird durch das Auftreten von Gap Junctions erstellt. Gap Junctions sind Plaques von Gap Junction Kanälen, die proteinhaltige Kanäle durch den Kopf-an-Kopf-Docking von zwei Connexin (Cx) hemichannels benachbarter Zellen 3,4 (Abbildung 1) ausgebildet sind. Gap Junctions den Durchtritt von kleinen Signal-Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1,5 kDa, darunter Ca 2 + oder IP 3 5, verursacht und Modulieren Ca 2 +-Freisetzung aus intrazellulären Speichern der von den benachbarten Zellen 6 (Abb. 2). Gap Junction Kanäle sind eng durch intra-und intermolekulare Protein-Interaktionen und zelluläre Signalwege reguliert Prozesse wie Redox-Modifikation undPhosphorylierung 7. GJS erleichtern die koordinierte Antwort von verbundenen Zellen, wodurch sie als eine chemische und elektrische Synzytium. Zum Beispiel ist die Verbreitung von Herztätigkeitspotential für die atrialen und ventrikulären Myozyten durch Cx-basierte GJ Kanäle 85 vermittelt. CXS nicht nur eine Rolle als Gap Junction Kanälen, sondern bilden auch ungepaarten hemichannels, wodurch sie als Kanäle in den Membranen ähnlich wie regelmäßige Ionenkanäle 8-10 (Abbildung 1). Hemichannels beteiligen parakrine Signalisierung zwischen benachbarten Zellen durch die Steuerung der Austausch von Ionen und Signalmoleküle zwischen dem intra-und extrazellulären Umgebung. In vielen Zelltypen (zB Epithelzellen, Osteoblasten, Astrocyten, Endothelzellen, etc.) und Organe (wie Gehirn-, Leber-, Retina, Cochlea und dem Gefäßsystem), intrazelluläre Ca 2 +-Wellen für die Koordinierung der vielzelligen Antworten grundlegende <sup&gt; 11. Erhöhungen der intrazellulären Ca 2 +-Spiegel in einer bestimmten Zelle nicht auf diese Zelle beschränkt, sondern Propagation in die umliegenden Nachbarzellen, wodurch eine intrazelluläre Ca 2 +-Welle 12,13. Diese intrazellulären Ca 2 +-Wellen sind für den normalen physiologischen Regulation von Zell-Schichten als Synzytium und deren Fehlregulation hat mit pathophysiologischen Prozessen 11 in Verbindung gebracht wichtig. Im Hornhautendothel und Epithel, studierte verschiedene Gruppen 14-24, 25-33 einschließlich unserer eigenen, die Mechanismen und die Rolle der interzellulären Kommunikation. In nicht-erregbaren Zellen, wie Endothelzellen, treten zwei unterschiedliche Modi der interzellulären Kommunikation 28,29, nämlich interzellulären Gap Junction-Kommunikation und parakrine interzelluläre Kommunikation. Interzellulären Gap Junction-Kommunikation beinhaltet einen direkten Austausch von Signalmolekülen über Gap Junctions 7. Gap junclen interzelluläre Kommunikation ist entscheidend für die Aufrechterhaltung Gewebshomöostase, Controlling Zellproliferation, und zur Errichtung einer synchronisierten Reaktion auf extrazelluläre Stress 10,34,35. In einer Reihe von Krankheiten, ist Gap Junction Kopplung aufgrund defekter CXS reduziert und hierdurch beeinträchtigt interzellulären Gap Junction-Kommunikation 36. Dies unterstreicht die Bedeutung und den Einfluss der interzellulären Gap Junction-Kommunikation in mehrzelligen Organismen. Im Gegensatz zu interzellulären Gap Junction-Kommunikation ist parakrine interzelluläre Kommunikation nicht abhängig von Zell-Zell-Apposition, da es die Freisetzung von diffusible extrazelluläre Botenstoffe (Abbildung 2) beinhaltet. Verschiedene Arten von Signalmolekülen in den extrazellulären Raum durch Signalisierung Zellen freigesetzt wird. Das Molekül wird dann an die Zielzelle, wo es von einem spezifischen Rezeptor Protein nachgewiesen transportiert. Anschließend wird der Rezeptor-Komplex Signal induziert eine zelluläre Antwort, dieBei Entfernung des Signals, Inaktivierung oder Desensibilisierung beendet. Veröffentlicht lipophilen extrazellulären Signalisierung Boten in die Membran eindringen und wirken auf intrazelluläre Rezeptoren. Im Gegensatz dazu hydrophilen Boten nicht über die Plasmamembran der Zelle reagiert, sondern wirken als Liganden, der an der Oberfläche exprimiert Rezeptorproteine, die dann das Relais das Signal an die intrazelluläre Umgebung bindet. Drei große Familien von Zelloberflächen-Rezeptor-Proteine ​​in diesem Prozess zu beteiligen: Ionenkanal-vernetzt, enzyme-linked und G-Protein-gekoppelt. Das freigesetzte Botenstoff kann auf Rezeptoren der gleichen Zelle (autokrine) handeln, auf Zielzellen in unmittelbarer Nähe (parakrine) oder auf entfernten Zielzellen, die das Kreislaufsystem (endokrine) erfordern. In vielen Zelltypen, einschließlich Endothel 28,29 ATP ist eine der wichtigsten hydrophilen, parakrine Faktoren, die die Ausbreitung der interzellulären Ca 2 +-Wellen 37-40 anzutreiben. During mechanische Verformung, Hypoxie, Entzündung oder Stimulation durch verschiedene Mittel, kann ATP von gesunden Zellen in Reaktion auf 41-44 Schubspannung, Stretch oder osmotische Schwellung 44,45 freigegeben werden. Verschiedene ATP-Freisetzung Mechanismen postuliert worden, darunter vesikulären Exozytose 44 und einer Vielzahl von Transport-Mechanismen, wie ATP-binding cassette (ABC) Transporter, plasmalemmalen spannungsabhängigen Anionen-Kanäle 46, P2X7-Rezeptor-Kanäle 47,48, sowie Connexin hemichannels 49-52 und Pannexin hemichannels 43,49,53. Extrazelluläre ATP kann schnell hydrolysiert, ADP, AMP und Adenosin 54,55 durch ectonucleotidases, die in der extrazellulären Umgebung sind. Die extrazellulär freigesetzt ATP und sein Metabolit ADP 56 wird durch Diffusion verbreiten. Die anschließende Wechselwirkung mit dieser Nukleotide Adenosin-Rezeptoren in den benachbarten Zellen in der p verwickeltropagation der interzellulären Ca 2 +-Wellen 28,37,51. Zwei Klassen von Adenosin-Rezeptoren sind: Adenosin ist die wichtigste natürliche Ligand für P1-Purinozeptoren, während sowohl purin (ATP, ADP) und pyrimidin (UTP, UDP) Nucleotide am P2-Purinozeptoren 57 handeln. Interzelluläre Kommunikation kann durch verschiedene Methoden, wie Scrape Loading, Farbstoffübertragung lokalen Uncaging von Agonisten wie IP 3 und Ca 2 +, mechanische Stimulation etc. untersucht werden. Hier beschreiben wir die Studie von Ca 2 +-Wellenausbreitung durch mechanische Stimulation von einer einzigen Zelle ausgelöst. Der Vorteil des Studiums Ca 2 +-Wellenausbreitung durch mechanische Stimulation ist, dass es ein einfaches Werkzeug ermöglicht, um die Ausbreitung des Ca 2 +-Welle im Laufe der Zeit zu quantifizieren und ermöglicht quantitativen Vergleich verschiedener Vorbehandlungen der Zellen. In dem Endothel, diese interzelluläre Ca 2 +-Wellen erlauben coabgestimmte Antwort der Monoschicht, wird als eine mögliche Abwehrmechanismus des nicht regenerativen Hornhautendothel hilft das Endothel der extrazellulären Spannungen während einer intraokularen Operation zu widerstehen, oder unter Einwirkung von Entzündungsmediatoren während Immunabwehr oder Uveitis 58,59.

<table><tbody><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molekulare Sonden (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molekulare Sonden (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (Glutamax)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molekulare Sonden (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-Antimykotisches Gemisch</td><td>Invitrogen-Gibco-Molekulare Sonden (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen-Gibco-Molekulare Sonden (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's</td><td>PBS Invitrogen-Gibco-Molekulare Sonden (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen-Gibco-Molekulare Sonden (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-Dibromomethylen-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland)</td><td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VI</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland)</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland)</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td><td>Kundenspezifische Peptidsynthese</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td><td>Kundenspezifische Peptidsynthese</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td><td>Kundenspezifische Peptidsynthese</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td><td>Getemperte siRNA wurde gekauft bei Eurogentec (Luik, Belgien)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (Sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td><td>Annealed siRNA wurde bei Eurogentec (Luik, Belgien) gekauft.siRNA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>scramble: verschlüsselte Sequenz von siCx43-1 (Sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAdTdT) </td><td>Annealed siRNA wurde bei Eurogentec (Luik, Belgien) gekauftTAT-L2</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Thermo Electron (Ulm, Deutschland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron (Ulm, Deutschland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zweikammer-Objektträger</td><td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Dänemark)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Deutschland)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Piez&#8211; Elektrischer Kristall-Nanopositionierer (Piezo Flexure NanoPositioner)</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT-Verstärker</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>E463 HVPZT-Verstärker</td><td></td></tr><tr><td>Glasröhren (Glasersatz 3,5 Nanoliter)</td><td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211; lectrode Abzieher </td><td>Zeitz Instrumente (München, Deutschland)</td><td>WZ DMZ-Universal Abzieher</td><td></td></tr></tbody></table>

mechanische stimulation induzierte calcium wellenausbreitung in zellmonoschichten: das beispiel bovine endothelzellen

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Interzelluläre Kommunikation ist für die Koordinierung der physiologischen Prozesse zwischen Zellen in einer Vielzahl von Organen und Geweben, einschließlich des Gehirns, der Leber, der Retina, Cochlea und Gefäßsystem. In experimentellen Einstellungen interzelluläre Ca 2 +-Wellen kann durch Anlegen einer mechanischen Reiz auf eine einzelne Zelle hervorgerufen werden. Dies führt zur Freisetzung der intrazellulären Signalmoleküle IP 3 und Ca 2 +, die die Ausbreitung des Ca 2 +-Welle einzuleiten konzentrisch von der mechanisch stimuliert Zelle an den benachbarten Zellen. Die wichtigsten molekularen Signalwege, die intrazelluläre Ca 2 +-Wellenausbreitung Kontrolle durch Gap Junction Kanälen durch die direkte Übertragung von IP 3 und hemichannels durch die Freisetzung von ATP zur Verfügung gestellt. Identifizierung und Charakterisierung der Eigenschaften und der Regulierung der unterschiedlichen Connexin und Pannexin Isoformen als Gap Junction Kanälen und hemichannels werden vom quantificatio erlaubtn für die Ausbreitung der interzellulären Ca 2 +-Welle, siRNA, und die Verwendung von Inhibitoren von Gap-junction-Kanäle und hemichannels. Hier beschreiben wir eine Methode, um intrazelluläre Ca 2 +-Welle in Monoschichten von primären Endothelzellen mit Fluo4-AM in Reaktion auf eine kontrollierte und lokalisierte mechanische Reiz durch eine akute, kurz andauernde Verformung der Zelle provoziert geladen messen als Folge Berühren der Zellmembran mit einem Mikromanipulator gesteuert Glas-Mikropipette mit einem Durchmesser der Spitze von weniger als 1 um. Wir beschreiben auch die Isolierung von primären bovinen Endothelzellen und seine Verwendung als Modellsystem, um die Cx43-hemichannel Aktivität wie das angetriebene Kraft für interzelluläre Ca 2 +-Wellen durch die Freisetzung von ATP zu beurteilen. Schließlich diskutieren wir den Einsatz, Vorteile, Grenzen und Alternativen dieser Methode im Rahmen der Gap Junction Kanals und hemichannel Forschung.

Alle Versuche werden unter Einhaltung aller einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt und das Protokoll die demonstriert wird, unter der Leitung und Genehmigung der Tierpflege und Nutzung Ausschuss der KU Leuven durchgeführt. In Rinder-Endothelzellen (BCEC) werden funktionelle Gap Junctions ausgedrückt und beide interzellulären Gap Junction-Kommunikation und parakrine interzelluläre Kommunikation wesentlich zur interzellulären Kommunikation in einer interaktive...

Intercellular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Wellen werden von Gap Junction Kanälen und hemichannels angetrieben. Hier beschreiben wir eine Methode, um interzelluläre Ca messen<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Wellen in Zellmonoschichten in Reaktion auf eine lokale Single-Cell-mechanischen Reiz und ihre Anwendung auf die Eigenschaften und Regulation von Gap Junction Kanälen und hemichannels untersuchen.

Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die interzelluläre Kommunikation über Gap-Junction-Kanäle und HEMI-Kanäle durch Quantifizierung der Ausbreitung der interzellulären Kalziumwelle zu untersuchen, die durch mechanische Stimulation in Monolagen primärer Hornhautendothelzellen hervorgerufen wird. Dies wird erreicht, indem zunächst die primären Hornhautendothelzellen aus frischen Rinderäugeln isoliert werden. Als zweiter Schritt werden zwei bis drei Tage nach der Aussaat in Kammerobjektträgern die konfluenten Zellmonolagen mit dem fluoreszierenden kalziumsensitiven Farbstoff flu O 4:00 AM beladen. Anschließend wird eine kontrollierte und lokal begrenzte mechanische Stimulation auf eine einzelne Zelle der Monolage ausgeübt, um eine interzelluläre Kalziumwelle auszulösen, die am konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht wird.Die Ergebnisse zeigen die Ausbreitung der interzellulären Kalziumwellenausbreitung. Letztendlich wird die Hemmung von Gap-Junction-Kanälen und HEMI-Kanälen verwendet, um die Eigenschaften und die Regulation verschiedener Connexin- und Panexin-Isoformen, die Gap-Junction-Kanäle und HEMI-Kanäle bilden, aufzuklären. Der Hauptvorteil der durch mechanische Stimulation induzierten interzellulären Kalziumwellenausbreitung liegt darin, dass sie eine einfache und zuverlässige Methode bietet, um den Beitrag und die Eigenschaften von verbindenden und axonalen Kanälen auf nicht-invasive Weise zu untersuchen.Außerdem stützt sich die Methode auf die in den untersuchten zellulären Systemen vorhandenen physiologischen Signalmoleküle und Signalwege. Schließlich ist sie leicht auf eine Vielzahl von Zellsystemen anwendbar, einschließlich primärer Zellen und Zellmodelle, die bestimmte Connexin- oder PanIN-Isoformen ektopisch exprimieren. Diese Methode kann Einblicke in die Funktion und dynamische Regulation von auf Connexin- und PanIN-basierten Gap-Junction-Kanälen und HEMI-Kanälen gewähren, und zwar durch die Verwendung von siRNA-vermittelter Herunterregulation endogener Connexine oder PanINs in bestimmten Isoformen sowie durch den Einsatz selektiver Inhibitoren von Gap-Junction-Kanälen und HEMI-Kanälen.Dieses System ist keineswegs auf beide Hornhautendothelzellen beschr&auml;nkt. Es ist praktisch f&uuml;r jeden Zelltyp und auch komplexere Gewebe anpassbar. Bei diesem Verfahren wird ein frisch enukleiertes Auge von einer Kuh verwendet, die nicht &auml;lter als 18 Monate war und nicht l&auml;nger als f&uuml;nf Minuten postmortal ist.Das wurde in Earle's Balanced Salt Solution und 1%iger Jodlösung bei vier Grad Celsius ins Labor transportiert. Überführen Sie zuerst das Auge in eine 100 Millimeter mal 20 Millimeter große Petrischale. Spülen Sie anschließend das Auge mit EBSS, das 1% Jod enthält, ab.Anschließend ab diesem Punkt mit einer Lösung, die 70 % Ethanol enthält, sterilisieren. In einer sterilen Haube arbeiten. Die Hornhaut vorsichtig aus dem Auge herausschneiden und in eine 35 Millimeter mal 10 Millimeter große Petrischale mit EBSS geben, wobei die epitheliale Zellschicht nach oben zeigt.Entfernen Sie vorsichtig alle noch am Kornea anhängenden Reste des Irisgewebes. Falls erforderlich, überführen Sie die Kornea in eine andere Schale mit EBSS, wobei die endotheliale Zellschicht nach oben zeigt, und spülen Sie sie anschließend zweimal mit EBSS ab. Danach legen Sie die Kornea mit der endothelialen Schicht nach oben in eine Sanduhrform und bedecken sie mit Wachstumsmedium. Zum Spülen entfernen Sie das Medium mit einer Saugpipette. Geben Sie 300 Mikroliter einer 0,5 Gramm pro Liter Tripsin-Lösung auf die endotheliale Schicht der Hornhaut. Stellen Sie die Sanduhr mit der Hornhaut in eine abgedeckte Petrischale und überführen Sie sie für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator.Nachdem die Sanduhr entnommen wurde, wurden die Endothelzellen vorsichtig mit einer flammenglasierten, hakenförmigen Glas-Pasteurpipette von der Hornhaut abgeschabt. Die Lösung, die die Endothelzellen enthält, abpipettieren und zu einem 25 Quadratzentimeter großen Kulturkolben hinzufügen, der vier Milliliter Kulturmedium enthält. Anschließend 300 Mikroliter Wachstumsmedium auf die Hornhaut auftragen.Wiederholen Sie das Abkratzen und geben Sie die Lösung mit den endothelialen Zellen dem Kulturfläschchen hinzu. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, dann stellen Sie die Kulturfläschchen mit den kornealen endothelialen Zellen im Wachstumsmedium in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Zwei Tage später fügen Sie sechs Milliliter Kulturmedium hinzu und erneuern das Wachstumsmedium alle zwei Tage.Die Zellen sollten innerhalb von sieben bis zehn Tagen nach der Isolierung bis zur Passage konfluent sein. Zunächst das Kulturmedium abpipettieren und die Zellen anschließend zweimal mit EBSS spülen. Danach zwei Milliliter Trypsin-Lösung zu den Zellen geben und das Kolben in den Inkubator für drei bis vier Minuten stellen.Fügen Sie dann 12 Milliliter Wachstumsmedium hinzu und pipettieren Sie das Medium dreimal auf und ab, um die Zellen zu verteilen. Anschließend zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hemozytometers oder eines automatischen Zellzählgeräts. Geben Sie 165.000 Zellen in zweifache Kulturslides.Bereiten Sie anschließend 75 cm² große Kulturkolben für einen neuen Passagierschritt mit einer Dichte von 6.250 Zellen pro cm² vor, geben Sie frisches Kulturmedium bis zu einem Gesamtvolumen von 25 mL hinzu und stellen Sie die Kolben sowie die Kammerobjektträger in den Inkubator. Das Medium wird alle zwei Tage erneuert, und die Konfluenz der Zellschicht sollte innerhalb von drei bis vier Tagen erreicht sein. Beladen Sie zunächst die Zellen auf dem Kammerobjektträger mit 10 µM Fluoh-4:00 AM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung für 30 Minuten bei 37 °C unter leichtem Schütteln, während die Zellen in Fluoh-4:00 AM inkubieren. Koppeln Sie eine Glas-Mikropipette mit einem Nadeldurchmesser von weniger als einem Mikrometer an einen Piezo-Elektrokrystall-Nanopositionierer und verbinden Sie diese mit einem Verstärker, der an einem Mikromanipulator befestigt ist.Stellen Sie die Spannung des Nano-Positionierers auf einen Wert zwischen 0,2 und 1,5 Volt ein. Entfernen Sie die 4:00 AM-Lösung. Waschen Sie die Zellen anschließend fünfmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und inkubieren Sie die Zellen danach mindestens fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBS, bevor Sie die Messung durchführen.Angeregt mit 488 Nanometern durch einen Argonlaser und unter Verwendung des Strahlteilers HFT 48. Sammeln Sie die Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern mit einem Langpass-Emissionsfilter, LP 505, wobei die Blende hier auf das Minimum eingestellt ist; dabei wird ein Öl-Immersion-Objektiv mit 40-facher Vergrößerung verwendet. Platzieren Sie die Kammerkammer auf dem Objekttisch eines konfokalen Mikroskops und suchen Sie einen Bereich mit konfluenten Zellen. Bewegen Sie als Nächstes den Mikromanipulator, um die Glas-Mikropipette so zu positionieren, dass sie in einem Winkel von 45 Grad die Zellmembran berührt. Bedienen Sie den Mikromanipulator, um die Glas-Mikropipette kurzfristig mit weniger als 1 % der Einzelzellmembran in Kontakt zu bringen und die Zelle für eine Sekunde mechanisch zu stimulieren. Anschließend messen Sie räumliche Änderungen der Kalziumionenkonzentration nach der mechanischen Stimulation, indem Sie mit einem konfokalen Mikroskop Bilder aufnehmen und speichern.Zeichnen Sie abschließend mithilfe der Software des konfokalen Mikroskops einen polygonalen Bereich von Interesse, um die gesamte Oberfläche der reaktiven Zellen zu definieren. Mechanisch induzierte Kalziumtransienten werden unter Kontrollbedingungen in bovinen Hornhautendothelzellen an verschiedenen Zeitpunkten anhand repräsentativer pseudofarbiger Fluoreszenzbilder dargestellt, wobei die Fluoreszenzintensitäten vor der Stimulation im ersten Bild gezeigt sind. Der weiße Pfeil im zweiten Bild markiert die mechanisch stimulierte Zelle.Die Kalziumwelle breitet sich auf sechs benachbarte Zellschichten aus, wobei eine Gesamtfläche von Zellen erreicht wird, die eine aktive Fläche von 62.870 Quadratmikrometern ergibt. Der Liniengraph zeigt den zeitlichen Verlauf des normalisierten Fluoreszenzwerts oder NF in der mechanisch stimulierten Zelle, gekennzeichnet als ms, sowie den Durchschnittswert des NF in den benachbarten Zellschichten eins bis fünf, die im Graphen als MB eins bis MB fünf beschriftet sind. Diese Bilder zeigen signifikante Veränderungen in der Ausbreitung interzellulärer Kalziumwellen nach Behandlung mit exogenen Nukleotiden im linken Graphen und nach Behandlung mit Ecto-Nukleotidase-Inhibitoren im rechten Graphen. Im Detail zeigt der linke Graph eine signifikante Abnahme der aktiven Fläche nach Behandlung von bovinen Hornhautendothelzellen mit den exogenen Aras Aase sechs und Aase sieben, die ATP und ADP hydrolysieren und dadurch den pericrinen interzellulären Kommunikationsweg hemmen.Das Sternchen kennzeichnet einen P-Wert von weniger als 0,001 bei Vorhandensein im Vergleich zur Abwesenheit von Ace. Das Diagramm auf der rechten Seite zeigt einen signifikanten Anstieg der aktiven Fläche nach der Behandlung von BCEC mit einem selektiven ecto-Nukleotid-Inhibitor, A RL 6 7 1 56, wodurch der pericrine interzelluläre Kommunikationsweg verstärkt wird. Das Sternchen kennzeichnet einen P-Wert von weniger als 0,001 bei Vorhandensein im Vergleich zur Abwesenheit von a RL, sobald dies beherrscht ist.Diese Technik kann bei ordnungsgemäßer Durchführung für ein Experiment unter einer Bedingung in fünf bis zehn Minuten durchgeführt werden. Die Durchführung einer ganzen Versuchsreihe, anhand derer verschiedene Bedingungen verglichen werden können, erfordert einen Tag, um statistische Schlussfolgerungen zu ziehen. Unabhängige Experimente müssen an verschiedenen Tagen und mit verschiedenen Chargen isolierter Zellen durchgeführt werden.Die Messung und Quantifizierung der Ausbreitung intrazellulärer Kalziumwellen ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung der zellbiologischen Regulation verschiedener Connexin-Isoformen als Gap-Junction-Kanäle und Hemi-Kanäle. Ich möchte außerdem betonen, dass diese Methode nicht isoliert betrachtet werden sollte, sondern durch andere molekulare und funktionelle Ansätze ergänzt werden muss, die von der Dye-Transfer- bis zur ATP-Freisetzungsmessung und Elektrophysiologie reichen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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