Name: Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: Lernen Sie Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie an Bäckerhefe für Einzelzellanalysen mit automatisiertem Lineage-Tracking. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung transkriptioneller Dynamik im Zellzyklus.

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Wir danken Emily Jackson, Joshua Zeidman und Nicholas Wren für Kommentare zu der Software. Diese Arbeit wurde von GM95733 (bis NM), BBBE 103316 und MIT Anschubfinanzierung (bis NM) finanziert.

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<li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das obige Protokoll beschreibt eine einfache Methode zu erhalten und zu analysieren Fluoreszenz Zeitreihendaten mit wenig Erfahrung in der Mikrofluidik oder in der Softwareentwicklung. Er erlaubt es, Zeitraffer-Filme Fluoreszenz einzelner Hefezellen erhalten; extrahieren relevante Größe der Zellen und die Expression Messungen; Pfarrer Tracking und Abstammung Zuweisungen und analysieren das Verhalten ganzer Zellen im Laufe der Zeit mit einem handelsüblichen Gerät mikrofluidischen Kultur und eine vielseitige grafische Ben...

Einzel-Zell-Analyse der Genexpression gefördert hat unser Verständnis vieler Aspekte der Genregulation. Statische Schnappschüsse von fluoreszierenden Reporter Expression mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie bieten nützliche Informationen über die Verteilung der Single-Cell-Ausdruck, aber es fehlt die Geschichte und Entwicklung der Zeitreihen erforderlichen Daten direkt informieren Genexpression Dynamik. Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie stellt ein Mittel, um sowohl Single-Cell-Messungen und ihre Geschichte zu erhalten. Verschiedene experimentelle und analytische Techniken entwickelt worden, zu erhalten und zu quantifizieren Filme von fluoreszierenden Reporter Ausdruck verleihen somit Einblicke in Genregulation Features (siehe 1 für eine Übersicht) wie Zell-zu-Zell-Variation 2,3, bakterielle persister Bildung 4, Transkription Initiierung und Dehnung 5, Transkriptions Platzen 6,7, Zellzyklus-Abhängigkeit 8,9 und 10 Erblichkeit. Allerdings obtaining Qualität Single-Cell-Fluoreszenz Zeitreihen mit erheblichen technischen Herausforderungen bei der Kultivierung eine Monoschicht von Zellen in einer kontrollierbaren Umgebung und in High-Throughput-Quantifizierung der Fluoreszenz erworbenen Filme. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Beschaffung und Analyse von Filmen Fluoreszenz S. cerevisiae ohne erforderliche Erfahrung in der Zellkultur Gerät Herstellung oder in der Software-Entwicklung (Abbildung 1). Erstens, wir ausführlich ein Beispiel-Protokoll zur Fluoreszenz Zeitreihen filme für Bäckerhefe, die ein oder mehrere fluoreszierende Reporter erzeugen. Obwohl maßgeschneiderte mikrofluidischen Kultur Kammern errichtet worden sind und erfolgreich eingesetzt zuvor 11-13, verwenden wir einen handelsüblichen Mikrofluidikvorrichtung von CellAsic (Hayward, CA). Das System beschränkt Zellen Monoschicht Wachstum und ermöglicht kontinuierliche Kontrolle der Perfusion Umwelt. Die Mikroskopie Protokoll präsentieren wir ein einfaches Mittel, um fluoresz erhaltenENCE Filme von Bäckerhefe, aber jede Änderung experimentelle Protokoll (eine angepasste Kultur Gerät, alternative Medien Bedingungen, etc.), was ähnliche Fluoreszenz Filmdaten einzelner Hefezellen substituiert sein kann. Nächstes skizzieren wir die Analyse der Filme über eine grafische Benutzeroberfläche (GUI)-basierten Software-Paket in MATLAB (MathWorks, Natick, MA), nannte die GUI für die schnelle Analyse von Fluoreszenz Time Series (Transplantate), um Zeitreihen zu extrahieren für einzelne Zellen. Transplantate hat ähnliche Eigenschaften der vielseitigen, Open-Source-Software-Paket Handy-ID 14 in Segmentierung und Tracking-Zellen und bei der Gewinnung Fluoreszenzintensität und geometrischen Informationen. Allerdings sieht Transplantate wichtige zusätzliche Funktionen. Erstens bietet es einfach interaktive Bearbeitung der Segmentierung und Tracking-Ergebnisse zu Genauigkeit der Daten, anstatt nur statistische Ausreißer Gating der Region Spuren nach der Analyse zu überprüfen. Darüber hinaus erstreckt sich die Analyse auf automatically bezeichnen Abstammung und Zellzyklus-Sehenswürdigkeiten in der Nähe von Bäckerhefe. Festlegen, wann Mutter und Tochter, zwei unabhängige Zelle Regionen bilden teilen ist entscheidend für die Bestimmung ganzen Zelle (Mutter einschließlich damit verbundener bud) Messungen während des Zellzyklus 8. Die Suite besteht aus drei Modulen, um diese Aufgaben zu erfüllen. Die ersten Segmente Zelle Regionen auf dem Kontrast zwischen Schärfe und Unschärfe Hellfeld Bildern basiert, und ermöglicht es dem Benutzer zu definieren und zu testen visuell Segmentierung Parameter. Der zweite Titel (. Verwendung Blair und Dufresne MATLAB Umsetzung der Crocker et al IDL Routine, verfügbar unter: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) und misst Zelle Regionen durch die Zeit; vergibt automatisch Linien und ermöglicht die visuelle Inspektion und Fehlerkorrektur. Eine einfache Plotten GUI wird zur Abfrage Single-Cell-Eigenschaften enthalten. Das dritte Modul schreibt Knospe Entstehung und Teilung times und gibt Ganzzell Zeitreihendaten sowie deren erste und zweite zeitliche Ableitung (wie in 9 beschrieben). Das Analyse-Modul gibt die Daten als durch Leerzeichen getrennte Textdatei für die nachfolgende Studie in der Statistik-Software der Wahl. Somit ermöglicht das Paket dem Anwender, qualitativ hochwertige Zeitreihendaten über eine grafische Schnittstelle zu extrahieren. Wir haben diese Methode verwendet, um Echtzeit-Transkription Preise in einzelnen Hefe-Zellen als Funktion des Zellzyklus 9 schätzen. Während die Module für Hefezellen, die Parameter oder optimiert worden sind, falls erforderlich, die frei verfügbare Code kann für andere Organismen und Bildtypen angepasst werden. Segmentierung, Tracking und Linie Zuordnungsalgorithmen kann spezifisch für Arten der Bildgebung zugewiesen und den Organismus in Frage. Die bestehenden Algorithmen konnte ersetzt werden, aber immer noch die GUI-Schnittstelle, die benutzerfreundliche visuelle Kontrolle und Korrektur der Segmentierung und Tracking-Fehler, die unweigerlich Berufs erlaubtr mit einem Algorithmus.

<table><tbody><tr><td>Y04C Hefe-Perfusionsplatte</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX Mikrofluidische Perfusionsplattform</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Öl DIC Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Cascade II EMCCD Kamera</td><td>Photometrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200 Metallhalogenid-Bogenlampe</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siegro-Bandpass-Filterwürfel und Anregungs- und Emissionsfilterset</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>Set #89006</td><td>Verwendet für YFP (Venus/Citrin), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>MAC 5000 Controller und Filterräder</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Die 64-Bit-Version verarbeitet große Datendateien besser als die 32-Bit-Version</td></tr></tbody></table>

acquiring fluoreszenz zeitraffer-filme von bäckerhefe und analysieren von einzel-zell-dynamics mit transplantaten

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie hat sich zu einem mächtigen Werkzeug für die Untersuchung vieler biologischer Prozesse auf der Ebene einzelner Zellen. Insbesondere bieten Filme Darstellung der zeitlichen Abhängigkeit der Genexpression Einblick in die Dynamik seiner Regelung, aber es gibt viele technische Herausforderungen zu erhalten und zu analysieren Fluoreszenz Filme von Einzelzellen. Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll mit einem kommerziell erhältlichen Gerät mikrofluidischen Kultur, solche Daten zu erzeugen, und ein MATLAB-basierte, grafische Benutzeroberfläche (GUI)-basierten Software-Paket, um die Fluoreszenz-Bildern zu quantifizieren. Die Software-Segmenten und Spuren Zellen, kann der Benutzer visuell kuratieren Fehler in den Daten und ordnet Linie und Teilung Zeiten. Die GUI weitere Analysen der Zeitreihe Ganzzell Spuren sowie deren erste und zweite zeitliche Ableitung zu erzeugen. Während die Software wurde entwickelt, S. cerevisiae, sollte seine Modularität und Vielseitigkeit ermöglichen es to dienen als Plattform für die Untersuchung anderer Zelltypen mit wenigen Änderungen.

Eine erfolgreich durchgeführt und analysiert Experiment wird meist kontinuierliche Zeitreihen für einzelne ganze Zellen mit realistisch zugeordnet Knospe Entstehung und Teilung Zeiten ergeben. Als Beispiel führten wir das obige Protokoll mit einem haploiden Hefestamm Expression eines integrierten Kopie Cerulean fluoreszierendes Protein (GFP) vom konstitutiven ADH1 Promotor angetrieben wird, um zu beobachten, wie Wachstum und die globalen Expression im Laufe der Zeit in einzelne Zellen (Tabelle ...

Wir präsentieren ein einfaches Protokoll zur Fluoreszenzmikroskopie Filme von wachsenden Hefezellen und eine GUI-basierte Software-Paket, um Single-Cell-Zeitreihen extrahieren zu erhalten. Die Analyse umfasst automatisierte Linie und Teilung Zeitzuweisung mit Sichtprüfung und manuelle curation der verfolgten Daten integriert.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Fluoreszenz-Aufnahmen einzelner wachsender Hefezellen zu erhalten und für jede Zelle Zeitreihen der Reporterausprägung zu extrahieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Monoschicht von Zellen in einer mikrofluidischen Kammer kultiviert wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine zeitraffende Fluoreszenzmikroskopie für einen oder mehrere Reporter durchzuführen.Anschließend werden die Aufnahmen mit dem Graft-Softwarepaket verarbeitet, um die Zellen über die Zeit hinweg zu verfolgen und zu vermessen. Im letzten Schritt werden die Zellmessungen und Linienzuweisungen analysiert und die Zeitreihen der Reporterexpression für jede einzelne Zelle exportiert. Letztendlich wird eine aus den Expressionszeitreihen abgeleitete momentane Transkriptionsrate verwendet, um Veränderungen der Transkription sowohl während des Zellzyklus als auch als Reaktion auf wechselnde Transkriptionsfaktor-Konzentrationen darzustellen.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Genregulation zu beantworten, beispielsweise wie schnell verschiedene Promotoren auf die plötzliche Zugabe oder Entfernung eines aktiven Transkriptionsfaktors reagieren. Wie stark variiert diese Reaktion in einer Zellpopulation, und wie beeinflussen unterschiedliche zelluläre Eigenschaften – einschließlich Morphologie und Zellzyklusphase – die Antwort? Darüber hinaus kann mit dieser Methode der Einfluss mehrfacher Zugaben und Entfernungen eines aktiven Transkriptionsfaktors auf die Genexpression untersucht werden.Bereiten Sie Hefezellen vor, die unter nährstoffreichen Bedingungen im stationären Wachstum bei einer Dichte vorliegen, die für das Beladen in die mikrofluidische Vorrichtung geeignet ist, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie dann eine Y-zero-four-C-mikrofluidische Kultivierungsplatte von Cell ASIC vor, indem Sie die Vertiefungen nach Entfernung der Transportlösung mit steriler Wasser mittels des Onyx-Perfusionssystems spülen, wobei Wasser für fünf Minuten bei sechs PSI durch die Vertiefungen eins bis sechs geleitet wird, um die Kanäle zu spülen, gefolgt von einer Strömung aus der Ladevertiefung acht bei sechs PSI für 10 Sekunden. Entfernen Sie das Wasser aus allen Vertiefungen und ersetzen Sie es durch 250 Mikroliter SC-Medien in den Zulaufvertiefungen eins bis sechs sowie 50 Mikroliter der vorbereiteten Zellkultur in der Zellladevertiefung.Dichten Sie den Onyx-Manifold mit dem achten Kanal gegen die Platte ab und beginnen Sie mit der Spülung der Kanäle und der Kulturkammer, indem Sie über die Einlasslöcher eins bis sechs bei sechs PSI für zwei Minuten fließen lassen. Anschließend lassen Sie mindestens fünf Minuten lang ausschließlich über das Einlassloch fließen, das das Startmedium enthält. Setzen Sie diesen Durchfluss bei sechs PSI kontinuierlich fort, während Sie die Platte mit Mikroskoptape auf der Objekttischhalterung fixieren, um Verschiebungen während des gesamten Experiments zu verhindern und so die Zellverfolgung während der Datenauswertung zu verbessern; nach Vorbereitung des Mikroskops gemäß der schriftlichen Anleitung geben Sie einige Tropfen Immersionsflüssigkeit auf das Objektiv und befestigen das mikrofluidische Gerät sicher.Positionieren Sie auf der Bühne des umgekehrten Mikroskops den linken Drittelbereich der ersten Kulturkammer unter Verwendung eines der eingebetteten Positions­markierungen im Fokus. Schalten Sie den Durchfluss aus dem Mediumzulauf­brunnen ab und leiten Sie für fünf Sekunden lange Impulse bei sechs PSI Fluss aus dem Zellladebrunnen Nummer acht. Bewegen Sie die Bühne, um die Kulturkammer auf Zellen zu untersuchen.Erhöhen Sie die Beladungsflusszeit und den -druck, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist, vermeiden Sie jedoch eine Überlastung und Verstopfung der äußersten linken Barriere, durch die frisches Medium in die Kammer gelangt. Beginnen Sie mit dem Fließen aus dem Mediumzulaufbrunnen, der das Startmedium bei sechs PSI enthält. In Metamorph oder einer anderen Mikroskopie-Automatisierungs- und Steuerungssoftware.Richten Sie eine mehrdimensionale Aufnahme ein, um über die Zeit mehrere Bilder an mehreren Objektträgerpositionen aufzunehmen. Legen Sie die Anzahl der Zeitpunkte und das Intervall zwischen ihnen fest. Wählen Sie anschließend mehrere Objektträgerpositionen mit jeweils etwa 10 Zellen aus.Richten Sie die Aufnahme so ein, dass das Programm an jeder Stufenposition und zu jedem Zeitpunkt die Fokussierung auf das durchtransmittierte helle Feldbild mithilfe der in Metamorph integrierten Autofokus-Methode durchführt, wobei der Autofokus als benutzerdefiniertes Journal zu Beginn jeder Stufenposition implementiert wird, um eine höhere Kontrolle über die Fokusgenauigkeit zu erzielen. Stellen Sie außerdem das Programm so ein, dass es das Helligkeitsfeldbild bei plus einem Mikrometer zur Fokalebene aufnimmt und ein unscharfes Helligkeitsfeldbild bei minus vier Mikrometern zur Fokalebene erfasst.Verwenden Sie benutzerdefinierte geschriebene Protokolle, um bei Bedarf den Fokus zwischen den Bildern zu wechseln. Stellen Sie abschließend das Programm ein. Nehmen Sie ein Graustufenbild für jeden fluoreszierenden Reporter in der Fokusebene auf.Verwenden Sie Einstellungen, die für eine schnelle Aufnahme mit minimalem Photo-Bleaching optimiert sind. Bereiten Sie das Flussprogramm für das Experiment in der Onyx-Steuerungssoftware vor. Starten Sie dann gleichzeitig das Aufnahmeprogramm in Metamorph und das Flussprogramm in der Onyx-Steuerungssoftware.Führen Sie die Format-Data-M-Datei in MATLAB aus, um die grafische Benutzeroberfläche (GUI) für die Dateneingabe zu öffnen. Geben Sie oben den Ordner an, der die Bilddateien enthält, um das Datenverzeichnis festzulegen, und verwenden Sie die GUI, um die im Experiment aufgezeichneten Datentypen und Bilddateien anzugeben. Fahren Sie fort, indem Sie die Segmentierungsparameter gemäß der schriftlichen Anleitung auswählen.Die Auswahl geeigneter Parameter für die Segmentierung von Hellfeldbildern kann schwierig sein und hat einen erheblichen Einfluss auf die Qualität der resultierenden Zeitreihendaten. Wir konzentrieren uns darauf, alle Zellbereiche zu identifizieren, wobei der Vorzug einer Übersegmentierung gegenüber einer Untersegmentierung der Bereiche gilt. Bei der visuellen Dateninspektion können übersegmentierte Bereiche später zu ganzen Zellbereichen zusammengefügt werden, untersegmentierte Bereiche hingegen nicht geteilt werden. Stellen Sie die verschiedenen Segmentierungsparameter ein und überprüfen Sie die Segmentierungsgüte, indem Sie auf „Test erfolgreich“ klicken. Segmentierte Bereiche werden grün mit magentafarbenen Rändern dargestellt. Stellen Sie sicher, dass Sie den Schieberegler verwenden, um mehrere Zeitpunkte im Film zu überprüfen, sobald die Segmentierung zufriedenstellend ist.Wählen Sie „Fertig“, um die Segmentierungsparameter an die Formatdaten-GUI zurückzugeben. Nachdem Sie die Farbparameter wie im Text beschrieben ausgewählt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche „Automatischer Schwellenwert“, um den Schwellenwert automatisch zu bestimmen. Mithilfe der Tzu-Methode werden im Bild die Bereiche hervorgehoben, die oberhalb des Schwellenwerts erhalten bleiben.Die Schwelle kann manuell über das Bearbeitungsfeld angepasst werden. Nutzen Sie die Bildlaufleiste, um zu überprüfen, ob die Schwelle für alle Zeitpunkte geeignet ist. Sobald Sie zufrieden sind, klicken Sie auf „Fertig“.Um den Schwellenwert zum Format-Daten-GUI zurückzukehren, klicken Sie auf „add“ und „segment“. Um die Farbmaske zu erstellen, drücken Sie „format data“, um die Bilddateien einzulesen, die Daten zu verarbeiten und eine Punkt-Matrix-Datei im angegebenen Ordner zu erstellen. Diese Datei dient als Eingabe für die Prozess-Zeitreihen-GUI.Führen Sie die Prozess-Zeitreihen-M-Datei in MATLAB aus, um die Tracking-GUI zu öffnen. Legen Sie nach dem Öffnen der GUI zunächst die Kammerhöhe fest. Dies gibt die Höhe der Kammer an, in der die Zellen eingefangen sind.Es dient als Einschränkung bei der Annäherung des Zellvolumens als 3D-Ellipsoid basierend auf der Haupt- und Nebenachse des Zellbereichs. Anschließend legen Sie Mikrometer pro Pixel fest. Dies ist der Umrechnungsfaktor, der verwendet wird, um den Abstand von Pixeln in Mikrometer in den Bildern zu kalibrieren, sodass die Querschnittsfläche und das Volumen in Quadratmikrometern bzw. Kubikmikrometern kalibriert werden können.Als Nächstes verwenden Sie das Filterbedienfeld, um Mindest- und Maximalparameter festzulegen, um Störbereiche in der Maske auszufiltern. Die Fläche ist der Bereich in Pixeln. ECC ist der Exzentrizitätsfaktor, der umso kreisförmiger ist, je näher der Wert null kommt.Und SF ist der Formfaktor, der umso kreisförmiger wird, je näher der Wert der Eins kommt. Laden Sie die Bilder im Eingabe-Ausgabe-Bedienfeld für Dateien und wählen Sie die gewünschte Punkt-Mat-Datendatei aus, die von der Format-Data-GUI ausgegeben wird. Die Regionsmaske wird auf jeden Farbkanal angewendet, und es werden verschiedene Messungen durchgeführt. Die Datendatei wird anschließend gespeichert, nachdem der Parameter „Zellen verfolgen“ (track cells) wie im Text beschrieben ausgewählt wurde.Klicken Sie auf „Zellen verfolgen“, um Bereiche von einem Frame zum nächsten mithilfe der Regions-OIDs zu verfolgen, um Linienzugehörigkeiten für neu erscheinende Knospen zuzuweisen und die Daten zu speichern. Ändern Sie bei Bedarf die Parameter in den Popup-Fenstern. Linienzugehörigkeiten werden automatisch zugewiesen, indem die Abstände zwischen möglichen Knospen und potenziellen Mütterzellen minimiert werden. In jedem Frame.Klicken Sie auf die Schaltfläche über dem Bereich mit den ausgewählten Zellinformationen und bereinigen Sie mithilfe der verschiedenen gummiartigen Werkzeuge oder Tastaturkürzel – wie im Textprotokoll beschrieben – schlecht segmentierte Bereiche sowie Fehler bei der ID- oder Linienzuweisung, um die Daten ordnungsgemäß zu kurationieren. Führen Sie übersegmentierte Bereiche zusammen, löschen Sie Bereiche, die nicht die gesamte Zelle erfassen, und stellen Sie sicher, dass Mutter-Tochter-Beziehungen korrekt zugeordnet sind. Entfernen Sie außerdem alle grünen IDs, indem Sie Bereiche zusammenführen.Fixieren der ID, Zuweisen der Region zu einer Mutter, Zuweisen keiner Mutter oder Löschen der Region. Da die Knospdaten während der abschließenden Endanalyse zu denen der Mutter hinzugefügt werden. Eine Bud-Region nicht mit ihrer Mutter zusammenführen.Überprüfen Sie die Daten visuell für jeden Einzelbildschritt bis zum letzten Zeitpunkt von Interesse. Es ist nicht erforderlich, die gesamte Zeitspanne zu erfassen. Falls die späteren Einzelbilder nicht verwendet werden, speichern Sie die Änderungen unbedingt, sobald alle Zellbereiche über den gewünschten Zeitraum hinweg überprüft wurden. Die Daten für alle Fluoreszenzkanäle und deren zeitliche Veränderungen sind nun zur Ausgabe bereit.Wenden Sie die Zeitreihenanalyse an, um die Zeitreihen für ganze Zellen über die Zeit zu analysieren. Berechnen Sie Informationen zum Zellzyklus und leiten Sie Ableitungen ab. Ein Fenster öffnet sich, in dem die Auswahl der gewünschten Messungen und die Eingabe der Analyseparameter möglich ist. Geben Sie den letzten im Gooey kurierten Zeitpunkt ein.Die voreingestellten Parameter für die Glättung und die Zellzykluszuweisung eignen sich gut für haploide und diploide Stämme, die in Fünf-Minuten-Intervallen abgebildet wurden, können jedoch für optimale Ergebnisse angepasst werden müssen. Nachdem alle Parameter festgelegt wurden, wählen Sie „analysieren“, um Einzelzell-Zeitreihendaten zu exportieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Ein erfolgreich durchgeführtes und ausgewertetes Experiment liefert überwiegend kontinuierliche Zeitreihen für einzelne ganze Zellen mit realistisch zugewiesenen Aufgangs- und Teilungszeiten für einen Halo-Hefe-Stamm, der eine integrierte Kopie des Ian-Fluoreszenzproteins oder CFP unter Kontrolle des konstitutiven DH1-Promotors exprimiert. Ganzzell-Messungen über die Zeit wurden aus der Zeitreihenanalyse gewonnen.Die Hellfeldbilder zeigen die segmentierte Mutterzelle in Blau und deren Knospen in Grün. Mit der zusammenhängenden gesamten Zelle, die rot hervorgehoben ist, zeigt sich eine Abhängigkeit vom Zellzyklus sowohl für das Volumen als auch für die Expression. Hier zeigen schraffierte Bereiche, wann sich die Zelle in SG zwei M befindet und eine Knospe bildet; die Knospung beginnt beim Übergang von G eins zu S, dargestellt durch die Farbänderung von weiß nach grau.Schattierung und Zellteilung treten beim Übergang von M nach G1 auf, gekennzeichnet durch den Wechsel von grauer zu weißer Schattierung nach der Knospung. Das gesamte kombinierte Volumen nimmt schneller zu als zuvor, während die Proteinkonzentration oder mittlere Intensität leicht abnimmt. Der Anstieg der kombinierten integrierten Proteinmenge beschleunigt sich nach der Knospung im Vergleich zum alleinigen Mutterbereich. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung einer korrekten Berücksichtigung des Beitrags der Knospen zur Gesamtzellmessung und unterstreichen die Notwendigkeit einer ordnungsgemäßen Klonisierung und zeitlichen Zuordnung der Zellteilung. Die differenzierte Zeitreihe kann verwendet werden, um einen instantanen relativen mRNA-Spiegel und Transkriptionsrate zu berechnen, die beide ebenfalls nach der Knospung ansteigen, wodurch die Fähigkeit zur Erzeugung stabiler Zeit gegeben ist. Ableitungen von Messzeitreihen profitieren auch kinetische Studien, die das im Textprotokoll beschriebene schaltbare Expressionssystem verwenden.Eine Zeitreihenanalyse zeigt, wann der Transkriptionsfaktor in den Kern lokalisiert ist und wann das Zielgen beginnt und endet. Die hier gezeigten Transkriptionsmikroaufnahmen stammen aus den vier angegebenen Erfassungskanälen für eine Zelle mit einem schaltbaren, mit YFP fusionierten PHO4-TetR-Transaktivator. Der Transaktivator lokalisiert sich in Reaktion auf niedrigen Phosphatgehalt in den mit RFP markierten Kern und induziert die Expression eines CFP-Reporters unter Kontrolle eines 7x-TetO-Promotors.Die abgeleiteten Transkriptionsraten ändern sich im Mittel und auf Einzelzell-Ebene abhängig von der Lokalisation. Mithilfe dieses Verfahrens können weitere Analysen der mehrdimensionalen Zeitreihendaten auf Einzelzellebene durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise, wie sich die Expression über die Zeit in der Population verändert, oder ob die Effekte extrinsischer Schwankungen über mehrere Generationen vererbt werden.Ändern sich die Kinetik der Genaktivierung bei einer erneuten Aktivierung? Spielt der Zellzyklus eine Rolle, und viele andere Fragen, die das Wachstum der Genexpression sowie Linienstammbahnen einzelner Zellen erfordern?

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Spalthefe wird hier als heterologer Wirt verwendet, um bakterielle Zytoskelettproteine wie FtsZ und MreB als translationale Fusionsproteine mit GFP zu exprimieren, um deren Polymerisation sichtbar zu machen. Auch Verbindungen, die die Polymerisation beeinflussen, werden durch Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop identifiziert.

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