Name: Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Lernen Sie die Isolierung embryonaler ventrikulärer Endothelzellen aus transgenen Mausembryonen mittels Kollagenbehandlung und magnetischer Antikörperseparation. Diese Methode ermöglicht die Analyse spezifischer Zellpopulationen für die kardiovaskuläre Entwicklungsforschung.

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Wir möchten Andrea Portbury für die kritische Durchsicht des Manuskripts, das Mikroskop Service Labor von UNC für die Unterstützung bei der Zeitraffer-Bildgebung und die NIH (grant # R01HL061656) für finanzielle Unterstützung danken.

1. Bereiten Antikörper-konjugierten Beads <ol><li> Einen Tag vor der Dissektion, kombinieren die Antikörper der Wahl mit den entsprechenden Dynabeads (zB Ratte IgG Dynabeads für einen Antikörper bei Ratten erhöht, 4 x 10 8 Perlen / ml) pro Anweisungen des Herstellers. Für die BD Ratte anti-CD31-Antikörper (0,5 ug / ul, verwendet werden, um Endothelzellen isolieren), wird 3 ul Antikörper für jeweils 25 ul Perlen hinzugefügt, für eine endgültige Konzentration von 1,5 ug anti-CD31-Antikörper und 1 x 10 7 Perlen / 25 ul Puffer. </li><li> Inkubieren Perlen und Antikörper über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung der Collagen Teller <ol><li> Isolierte Zellen bilden Tubuli schneller als auf einem Kollagen-Gel gewachsen als lediglich eine Kollagen-beschichtete Platte entgegen. Daher sind Kollagengelen machte die Nacht vor der Dissektion, wie in 6 beschrieben. Auf dem Eis in einer Gewebekultur Kapuze, kombinieren Sie die folgenden Reagenzien (ausreichend für 19 Wells): 206,4 ul sterilem H &lt;sub&gt; 2 O, 140,4 ul Kollagen Typ I (4,08 mg / ml), 38,4 ul 10x M199 und 1,15 ul 5 M NaOH. </li><li> Pipette 20 ul dieses Kollagen-Gel in die Vertiefungen einer 384-well Gewebekulturplatten. Legen Sie die Platte in einem 37 ° C Gewebekulturinkubator für 30 min. </li><li> In 80 ul DMEM in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei 37 ° C Entfernen Sie das Kulturmedium und wiederholen Sie noch zweimal. </li><li> Nach dem letzten Spülgang, fügen Sie 80 ul 10% FBS / DMEM in jede Vertiefung und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. Entfernen des Kulturmediums vor der Zugabe der isolierten Zellen. </li></ol> 3. Verbrauchsteuern und die Digest Herz <ol><li> Euthanize eine Zeitfahr-schwangeren Maus an der gewünschten embryonalen Tag mit einem zugelassenen Euthanasie Technik. Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt. </li><li> Mit der Maus in Rückenlage, großzügig sprühen die Bauchseite des Weibchens mit 70% Ethanol vorDissektion. Mit einer Pinzette, um den unteren Bauch-Haut und Muskeln abzuheben von den inneren Organen, aufschneiden der weiblichen unteren Bauchraum um die inneren Organe zu visualisieren. </li><li> Halten Sie den Muttermund mit einer Pinzette vorsichtig geschnitten kaudal der Zange und beginnen die Aufhebung des Uterushorn aus der Bauchhöhle. Während die Aufhebung des Uterushorns, wegschneiden jede Bindegewebe, das Horn an ihrem Platz hält. Zum Abschluss Ausschneiden des Uterushorns, schneiden Sie die Kreuzung der Uterushorns mit den Eileiter, die Uterushorns befreien. </li><li> Legen Sie die Uterushorns in eine Petrischale mit kaltem 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und spülen Sie nach Bedarf. Schneiden Sie die Uterushorns über der Mittellinie, um die angeschlossenen embryonalen Säcke freizulegen. </li><li> Schneiden Sie einen Fruchtblase an der Kreuzung von der Plazenta und den Embryo zu vermeiden, versehentlich Schneiden der Embryo ein Embryo und abrufen. Setzen Sie den Embryo in einer zweiten Petrischale mit kaltem PBS. Bringen Sie die Petrischale mit dem Uterushorn zu Eis. </li><li> Decapitate des Embryos, um den Zugriff auf die Brustwand zu verbessern. Wenn Genotypisierung notwendig ist, schneiden Sie den Schwanz, um es zu entfernen und speichern in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis gelegt. </li><li> Mit dem Embryo auf dem Rücken, schnitt den Brustwand, um das Herz und die Lunge zu visualisieren. Um zu vermeiden, schneiden das Herz, einen vertikalen Schnitt entlang der Seite des Brustkorbs, nahe einem Vorderbein, durch einen horizontalen Schnitt über der Unterseite der Rippen gefolgt, dann, ziehen Sie die Brustwand und aus dem Weg. Bis in etwa embryonalen Tag 13,5, ist die Brustwand transparent, Unterstützung in der Visualisierung. </li><li> Heben Sie das Herz mit einer Pinzette und schneiden Sie die Schiffe unten. Dann, vor den großen Gefäßen geschnitten, um das Herz zu befreien. Wenn die Lungengefäße nicht geschnitten werden, kann die Lunge mit dem Herzen entfernt werden. So entfernen fremden Gewebe wie Lunge, falls erforderlich. </li><li> Trennen und entsorgen Sie die Vorhöfe und der großen Gefäße aus den Herzkammern. Mit einer Schere zerkleinern die Ventrikel in kleine Stücke (ca. 1 mm 3 &lt;/ Sup&gt;) und in etwa 500 ul Kollagenase (1 mg / ml in sterilem PBS). Die Proben auf Eis, bis alle Kammern haben gehackt worden und in Kollagenase. </li><li> Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis die Ventrikel aus allen Embryonen herausgeschnitten haben, sammeln jedes Herz in einem separaten Eppendorf-Röhrchen. Wenn alle Embryonen die gleiche Genotyp haben, können in einem einzigen Herzen Eppendorf-Röhrchen gepoolt werden. Die Anzahl der Proben zu einem einzigen Zeitpunkt verarbeitet werden, können auf der Grundlage der Magnet für die Isolierung verwendet beschränkt werden, die Dynamag (123-21D) verwendet hier hält maximal 16 Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Legen Sie die gehackte Ventrikel bei 37 ° C unter Schütteln für 45 min. Alle 15 min, entfernen Sie vorsichtig die Proben und Pipette auf und ab, um mechanisch distanzieren die Zellen. </li></ol> 4. Isolierung der Endothelzellen <ol><li> Führen Sie das Ventrikel-Kollagenaselösung durch ein 70 um-Filter, um weitere Klumpen von Zellen zu entfernen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 g für 10 min. Verwerfender Überstand mit rund 200 ul 10% FBS in DMEM ersetzen und Pipette auf und ab, um die Zellen zu distanzieren. </li><li> Wiederholen Sie den vorherigen Schritt einmal. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 g für 10 min nach der zweiten 10% FBS / DMEM waschen. Die Zellen in 50 ul 10% FBS / DMEM. </li><li> Während der letzten Zentrifugationsschritt, bereiten Sie die Perlen. <ol><li> Legen Sie die Eppendorf-Röhrchen, die den Antikörper und Perlen auf einem Magneten für 1 min. </li><li> Mit dem Rohr an Ort und Stelle auf dem Magneten, entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie den Schlauch vom Magneten und fügen etwa 100 ul 10% FBS / DMEM. </li><li> Legen Sie das Rohr auf der Magnet für 1 min. Entfernen Sie den Überstand und wäscht nochmals mit 10% FBS / DMEM. Wiederholen für insgesamt 3 wäscht. </li><li> Nach dem letzten Waschen, resuspendieren Antikörper-konjugierten Perlen in 10% FBS / DMEM (5 ul pro Probe). </li></ol></li><li> Zu jeder Zelle Probe 5 ul der Antikörper-konjugierten Perlen. Legen Sie die Perlen-Zell-Suspensionen bei 4 ° C unter Schütteln for 30 min. </li><li> In einer Laminarströmungshaube, legen Sie die Eppendorf-Röhrchen, die Zellen und Antikörper-konjugierten Perlen auf dem Magneten für 1 min. Entfernen Sie den Überstand, entfernen Sie die Rohre aus dem Magneten und waschen mit ca. 100 ul 10% FBS / DMEM. Wiederholen Sie dies für 5 Wäschen. </li><li> Nach dem letzten Waschen, legen Sie die Rohre auf der Magnet für 1 min, den Überstand entfernen, und entfernen Sie die Rohre von dem Magneten. In etwa 100 ul DMEM. </li><li> Legen Sie die Rohre auf der Magnet für 1 min, den Überstand entfernen, und entfernen Sie die Rohre von dem Magneten. 100-200 ul vorgewärmt 0,25% Trypsin-EDTA. Inkubieren der Proben bei 37 ° C und 5% CO 2 für 5 min. </li><li> Legen Sie die Rohre auf den Magneten für 2 min. Sorgfältig übertragen die Zellen enthaltende Überstand in frische Eppendorf-Röhrchen. Zentrifugieren für 5 min bei 400 x g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. Die Zellen in 80-100 ul Wachstumsmedium und Platte in einer 96 - oder 384-Well-Kulturschale behandelt, abhängig von der erwarteten Ausbeute(Ca. 450-600 Zellen aus den Herzkammern E14.5-E16.5 Embryonen). Für Endothelzellen, verwenden endothelial growth Kulturmedium (nachstehend definiert). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Arbeiten mit primären embryonalen Zellen ermöglicht neuartige Experimente in vitro kritischen Schritte der Entwicklung zu befassen. Allerdings ist das Verfahren zur Isolierung nicht trivial. Kritische Schritte zur Isolierung jede Art von Zellen auch gewährleistet, dass die Zellen gut auf Kollagenaseverdau getrennt und dann, dass sie gut in den Waschschritten suspendiert. Mechanische Präparation durch Pipettieren sehr hilft Trennung der Zellen während der Kollagenase Schritt, und der Schritt des Filterns entfern...

Das Aufkommen der immortalisierten Zelllinien revolutioniert hat grundlegende zellbiologische 1. Die derzeit verfügbaren Zelllinien werden aus einer Vielzahl von Organen abgeleitet und sind alle wichtigen Zelltypen. Allerdings haben etablierte Zelllinien einige Einschränkungen. Verfahren nach Immortalisierung offensichtlich verändert das Verhalten der Zellen, insbesondere in Bezug auf Lebensdauer und Proliferation, kann aber auch Einfluss auf die Expression von unerwarteten Proteine ​​wie Zytoskelettproteinen 2. Darüber hinaus, obwohl viele verschiedene Zelllinien zur Verfügung stehen, gibt es erhebliche Vielfalt selbst unter einem Zelltyp in einem gesamten Organismus. Endothelzellen zeigen insbesondere diverse Verhaltensweisen, ob sie Linie Arterien oder Venen und welche Art von Flow ist in dem Gefäß 3 basierend. Noch Pressen aus einer Entwicklungsstörung Sicht ist jedoch, dass die überwiegende Mehrheit der verfügbaren Zelllinien aus adultem Gewebe abgeleitet sind (siehe zB ter Sammlung via ATCC). Diese Erwachsenen Zelllinien wahrscheinlich nicht rekapitulieren die dynamische Natur von ihrer embryonalen Vorstufen. Die sich rasch verändernden Raumzeit Genexpression während der Entwicklung beobachtet auch darauf hin, dass ein Endothelzellen von einem Organ in einem bestimmten Entwicklungsstadium verhalten sich möglicherweise nicht auf die gleiche Weise als Endothelzellen von demselben Organ in einem anderen Entwicklungsstadium. Als Alternative zur Verwendung von kommerziell erhältlichen immortalisierten Zelllinien können primäre Zellen aus dem spezifischen Gewebe von Interesse isoliert werden. Zu den Vorteilen dieser Technik können diese primären Zellen aus einem bestimmten Organ oder Teil eines Organs zu einem bestimmten Entwicklungsstadium isoliert werden. Weiterhin können diese primären Zellen aus der Vielzahl der verfügbaren transgenen Tieren isoliert werden, so dass die in-vitro-Studie von Gen-Knockout-und Knock-in werden, ohne andere Probleme wie Transfektionseffizienz. Nicht überraschend, vieleTechniken wurden veröffentlicht detailliert, wie zu isolieren spezifischen Zelltypen 4,5. Im Allgemeinen beinhalten diese Verfahren das Sammeln der Region von Interesse, dissoziieren die Zellen, Markieren des spezifischen Zelltyp von Interesse und das Isolieren die Zellen zur weiteren Analyse. Um einen frühen embryonalen Population von koronarer Endothelzellen zu untersuchen, haben wir unten skaliert eine zuvor veröffentlichte Verfahren 4 zur Verwendung mit einem kleineren Organ. Mit diesem verkleinerten Verfahren können wir die koronare Endothelzellen aus dem embryonalen Herzen zu bestimmten embryonalen Stadien isolieren. Diese Zellen können dann in herkömmlichen Assays Endothelzellen wie Migration Analysen verwendet werden. Bis frühen embryonalen Zelllinien häufiger geworden, die Arbeit mit den primären Zellen ist ein unschätzbares Technik.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>zeitlich trächtige Mäuse</td><td></td><td></td><td>Zur Präparierung im embryonalen Stadium von Interesse</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ I</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzell-Wachstumsmedium</td> <td>(hergestellt im Labor, wie in den Anmerkungen beschrieben)</td><td></td><td>DMEM mit 20% FBS, 5 &mu; M &#946;-mercapt&#8211; thanol, 50 &mu; g/ml EKG und 1x Penicillin/Streptomycin</td></tr><tr><td>&#946;-mercapt&#8211; thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>EKGS</td><td>Biomedizinische Technologien, Inc.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>384-Well-Kulturplatte</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>Die Platte wurde mit einem dünnen Kollagengel hergestellt, wie in 6; Arbeitsfläche 10 mm2</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>Verwendung bei einem Konzentration von 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>M199, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>Wird wie angegeben in 13 </td></tr><tr>verwendet <td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Stereoskopisches Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Thermo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von embryonalen ventrikuläre endothelzellen

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Zellkultur hat unsere Fähigkeit, einzelne Populationen von Zellen unter Kulturbedingungen unzähligen beurteilen verbessert. Während immortalisierten Zelllinien signifikante Vorteile für ihre Benutzerfreundlichkeit bieten, sind diese Zelllinien nicht für alle möglichen Zelltypen. Durch die Isolierung primärer Zellen aus einer bestimmten Region von Interesse, insbesondere aus einer transgenen Maus, können nuancierter Untersuchungen durchgeführt werden. Die grundlegende Technik beinhaltet Sezieren des Organs oder teilweise Organ von Interesse (zB das Herz oder einen bestimmten Bereich des Herzens) und Dissoziation des Organs, um einzelne Zellen. Diese Zellen werden dann mit magnetischen Kügelchen, konjugiert mit einem Antikörper, der interessierenden Zelltyp erkennt inkubiert. Die Zellen von Interesse kann dann mit Hilfe eines Magneten getrennt werden, mit einer kurzen Inkubation Trypsin Dissoziation der Zellen von den Kügelchen. Diese isolierten Zellen können dann gezüchtet und analysiert werden, wie gewünscht. Diese Technik wurde ursprünglich für erwachsene Maus Orgel konzipierts, kann aber leicht nach unten skaliert werden für die Verwendung mit embryonalen Organe, wie hier gezeigt. Denn unser Interesse ist in der Entwicklung einer koronaren Gefäßsystem, wollten wir diese Population von Zellen in bestimmten embryonalen Stadien zu studieren. Somit hatte die ursprüngliche Protokoll geändert werden, um die Kompatibilität mit der geringen Größe der embryonalen Ventrikel und der geringen Ertragspotenzial von Endothelzellen in diesen Entwicklungsstadien werden. Mit Hilfe dieser abgespeckte Ansatz haben wir koronaren Plexus Umbau in transgenen embryonalen ventrikuläre Endothelzellen beurteilt.

Verwendung eines Endothelzellen-spezifischen Antikörper, der CD31 erkennt, wurden Endothelzellen aus den Ventrikeln des embryonalen (E) 13,5 (1A) und 18,5 (1B-1D) Embryonen isoliert. Wenn auf einer unbehandelten Kulturschale gezüchtet, diese Zellen bleiben gerundet und würde eine Kopfsteinpflaster-Muster bilden, wenn in der Nähe konfluent (Abb. 1A). Verdünnen Kollagen hat auch zur Beschichtung verwendet die Vertiefungen, und während die Endothelzellen an (Abbild...

Primäre Zellkultur ist eine nützliche Technik für die Analyse von spezifischen Populationen von Zellen, insbesondere von transgenen Maus-Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien. Hierin werden embryonalen Ventrikel seziert und distanziert, und Antikörper-konjugierten Perlen erkennen und trennen die Endothelzellen für die weitere Analyse.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, embryonale ventrikuläre Endothelzellen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Embryo zur Dissektion entnommen wird. Anschließend wird das Herz herauspräpariert.Die Atri werden entfernt und die zerkleinerten Ventrikel in eine Kollagenlösung überführt. Die Einzelzell-Suspension wird anschließend mit einem Antikörper inkubiert, der die endothelialen Zellen erkennt. Schließlich wird ein Magnet verwendet, um die Antikörper-gebundenen endothelialen Zellen zu isolieren.Schließlich können Ergebnisse erhalten werden, die die endotheliale Kettenbildung mittels Hellfeldmikroskopie zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kardiovaskulären Entwicklung zu beantworten, beispielsweise welche Faktoren die Migration koronarer endothelialer Zellen fördern. Obwohl diese Methode Einblicke in das Verhalten endothelialer Zellen ermöglicht, kann sie auch auf andere Zelltypen wie Myozyten und Fibroblasten angewendet werden. Am Tag vor der Durchführung der Dissektion arbeitet man in einer Zellkulturhaube und mischt den gewählten Antikörper mit den entsprechenden Dyna-Beads gemäß den Herstelleranweisungen für den hier verwendeten Rat Anti-CD31-Antikörper.Drei Mikroliter Antikörper werden zu 25 Mikrolitern Kügelchen gegeben, um eine Endkonzentration von 1,5 Mikrogramm pro 10 hoch 7 Kügelchen zu erreichen; inkubieren Sie die Kügelchen über Nacht bei vier Grad Celsius mit dem Antikörper, um Kollagengele vorzubereiten, die eine schnelle Tubulusbildung isolierter Zellen in einer Gewebekulturhaube auf Eis ermöglichen. Kombinieren Sie Kollagen Typ I, sterilem Wasser, 10× M199 und fünf molarer Natriumhydroxid. Gemäß dem schriftlichen Protokoll pipettieren Sie 20 Mikroliter des Kollagengels in die Vertiefungen einer 384-Loch-Gewebekulturplatte.Stellen Sie die Platte 30 Minuten lang in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 80 Mikroliter DMM in jedes Loch und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das Kulturmedium und wiederholen Sie die Wäsche nach dem letzten Spülgang noch zweimal; fügen Sie dann 80 Mikroliter 10 % FBS DM zu jedem Loch hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.Nach der Tötung einer zeitlich befruchteten Maus am gewünschten embryonalen Tag. Unter Verwendung einer genehmigten Technik und gemäß dem schriftlichen Protokoll entfernen Sie das Uterushorn und legen es in eine Petrischale mit einem XPBS, wo es gespült wird. Sobald die embryonalen Hülle durch einen medianen Schnitt an der Verbindung von Plazenta und Embryo freigelegt wurden, schneiden Sie eine embryonale Hülle auf und entnehmen den Embryo.Legen Sie das Embryo in eine zweite Petrischale mit kaltem PBS und legen Sie das Uterushorn zurück auf Eis, um den Zugang zur Brustwand zu verbessern. Entfernen Sie den Kopf des Embryos. Falls eine Genotypisierung durchgeführt wird, schneiden Sie den Schwanz ab und bewahren Sie ihn in einem Röhrchen auf Eis auf. Schneiden Sie, mit dem Embryo auf dem Rücken liegend,Öffnen Sie die Brustwand, um Herz und Lunge sichtbar zu machen, um Verletzungen des Herzens zu vermeiden. Führen Sie einen vertikalen Schnitt entlang der Seite des Rippenbogens in der Nähe eines Gliedmaßenskeletts durch, gefolgt von einem horizontalen Schnitt am unteren Ende der Rippen. Heben Sie dann vorsichtig die Brustwand nach oben und zur Seite, und zwar bis etwa zum embryonalen Tag 13,5.Die Brustwand ist durchsichtig, was die Visualisierung erleichtert. Heben Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Herz an und durchtrennen Sie die darunterliegenden Gefäße. Falls gewünscht, überführen Sie das Herz in eine saubere Schale, um es von den Lungen zu lösen, und durchtrennen Sie die Gefäße oberhalb der großen Gefäße.Als Nächstes trennen und entsorgen Sie die Vorhöfe und großen Gefäße von den Ventrikeln. Zerkleinern Sie dann mit einer Schere die Ventrikel in kleine Stücke und geben Sie sie in etwa 500 Mikroliter Kollagenase auf Eis. Entfernen und verarbeiten Sie die Ventrikel der verbleibenden Embryonen, wobei jedes Herz in einem separaten Röhrchen gesammelt wird.Platzieren Sie die zerkleinerten Ventrikel 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Entfernen Sie alle 15 Minuten vorsichtig die Proben und pipettieren Sie sie mehrmals auf und ab, um die Zellen mechanisch zu dissoziieren. Nach der Inkubation wird die Ventrikel-Kollagenase-Lösung durch einen 70-Mikrometer-Filter filtriert, um verbleibende Zellklumpen zu entfernen. Anschließend werden die Zellen 10 Minuten bei 400 ×g zentrifugiert, der Überstand wird verworfen und durch etwa 200 Mikroliter DMEM mit 10 % FBS ersetzt. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen, zentrifugieren Sie erneut, und führen Sie danach eine zweite Wäsche und Zentrifugation durch. Resuspendieren Sie die Zellen abschließend in 50 Mikrolitern DMEM mit 10 % FBS.Bereiten Sie als Nächstes die Kügelchen vor, indem Sie das Röhrchen mit Antikörper und Kügelchen für eine Minute auf einen Magneten stellen und den Überstand abpipettieren. Entfernen Sie dann das Röhrchen vom Magneten und geben Sie etwa 100 Mikroliter 10 % FBS in DMM hinzu. Stellen Sie das Röhrchen erneut für eine Minute auf den Magneten und entfernen Sie anschließend den Überstand.Wiederholen Sie die Waschung insgesamt dreimal nach der endgültigen Waschung. Resuspendieren Sie die Antikörper-gekoppelten Perlen in 10 % FBS in DMM und geben Sie je fünf Mikroliter der Antikörper-gekoppelten Perlen zu jeder Zellprobe hinzu. Inkubieren Sie die Perlen-Zell-Suspensionen bei vier Grad Celsius mit Schütteln für 30 Minuten in einer laminaren Luftstromhaube, stellen Sie die Proben für eine Minute auf den Magneten und aspirieren Sie den Überstand.Entfernen Sie die Röhrchen vom Magneten und waschen Sie sie mit etwa 100 Mikrolitern 10 % FPS und dm. Wiederholen Sie dies insgesamt fünfmal nach dem letzten Waschschritt. Suspendieren Sie die Kügelchen in etwa 100 Mikrolitern DMEM.Stellen Sie die Röhrchen eine Minute lang auf den Magneten. Entfernen Sie das Medium, geben Sie dann 100 bis 200 Mikroliter vorgewärmtes 0,25 %iges Trypsin in EDTA hinzu, inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für fünf Minuten. Stellen Sie die Röhrchen anschließend zwei Minuten lang auf den Magneten.Überführen Sie dann vorsichtig die Zellen enthaltende Überstände in frische Röhrchen und zentrifugieren Sie diese fünf Minuten bei 400 × g. Entfernen Sie anschließend den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 80 bis 100 Mikroliter endothelialem Wachstumsmedium und geben Sie sie in eine 96- oder 384-Well-Kulturschale, abhängig von der erwarteten Zellausbeute. Jedes Ventrikel-Paar von Embryonen vom Tag E 14,5 bis E 16,5 ergibt typischerweise 450 bis 600 Zellen, wie hier mithilfe eines endothelspezifischen Antikörpers, der CD 31 erkennt, gezeigt wurde. Endothelzellen wurden aus den Ventrikeln von Embryonen des Tages E 13,5 isoliert.Wenn sie auf einer unbehandelten Kulturschale gezüchtet werden, bleiben diese Zellen rund und bilden bei annähernder Konfluenz ein gepflastertes Muster. Obwohl die Zellen an Platten haften, die mit verdünntem Kollagen beschichtet sind, bilden diese aus E18,5-Ventrikeln isolierten Zellen weniger Ketten als auf einem Kollagengel. Außerdem bilden die Zellen auf dem Kollagengel im Vergleich zur kollagenbeschichteten Platte schneller Zell-Zell-Interaktionen und Ketten, was ihre Identität bestätigt.Die Zellen in dieser Abbildung färben positiv mit dem endothelialen Marker ISO-Selektin. Zusätzlich, wie hier gezeigt, färbten aus E 18,5-Ventrikeln isolierte endotheliale Zellen positiv mit den endothelialen Markern PAM und Flick-1. Diese Abbildung zeigt endotheliale Zellen, die aus den Ventrikeln eines E 14,5-Embryos isoliert und mit dem endothelspezifischen Farbstoff Cyto markiert wurden.16 isolierte Zellen überleben bis zu einer geschwächten Kultur, sind aber resistent gegenüber Imitation und eignen sich daher am besten für terminale Experimente. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa dreieinhalb Stunden durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Assays wie Röhrenbildungsassays und Transwell-Migrationsassays durchgeführt werden, um zu bestimmen, wie sich diese isolierten Zellen in vitro verhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

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