Name: Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Lernen Sie eine semi-intakte Präparation des vestibulären Sinnesepithels der Maus für Elektrophysiologie und Zwei-Photonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung intrinsischer Membraneigenschaften und Calcium-Signale in Haarzellen.

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Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch einen Garnett Passe und Rodney Williams Memorial Foundation Projektstipendium R. Lim und AJ Camp zur Verfügung gestellt.

1. Tiere <ol><li> Die Mäuse wurden von der australischen Nagetier Centre (ARC; Perth, Australien) gewonnen und gehalten an der Universität von Sydney Bosch Tierlabor auf einem normalen 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit ökologischen Bereicherung. Alle beschriebenen Experimente wurden von der University of Sydney Tier Ethikkommission genehmigt. </li><li> Männliche und weibliche Mäuse (C57/Bl6) wurden für alle Experimente verwendet werden, da dieser Stamm häufig als Hintergrund für genetische Manipulation verwendet werden, und kann als äquivalent zu 8-9 Wildtyp werden. </li></ol> 2. Tissue Vorbereitung <ol><li> Bereiten 300 ml eines Glycerin-Basis künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), bestehend aus (in mM): 26 NaHCO 3, 11 Glucose, 250 Glycerin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl 2, CaCl 2 und 2,5. Vor der Zugabe von CaCl 2, Gas die Lösung mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2), um festzustellen, apH von 7,4 und vermeiden Calciumpräzipitation (Bewölkung). Einfrieren der Lösung in einem -80 ° C-Gefrierschrank für 45 min, so daß eine Ice-Slurry gebildet wird. </li><li> Tief betäuben Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Australien) über eine intraperitoneale Injektion. </li><li> Sobald Hinterbeine Extremität Prise Reflexe fehlen decapitate Mäusen mit scharfen Schere aus rostfreiem Stahl und eine sagittalen Hautschnitt mit einer Rasierklinge (gerundet # 22), um den Schädel freizulegen. An dieser Stelle und in Schritten von 2,3 bis 2,8 die Schädelhöhle, Gehirn, und die zugrunde liegenden Vestibularapparat sollte so kühl wie möglich durch die regelmäßige Anwendung von eiskaltem ACSF über das Gewebe gehalten werden. </li><li> Mit dem spitzen Arm Standard Muster Schere (FST, North Vancouver, Kanada) machen einen kleinen Schnitt in den Schädel bei Lambda und entlang der Sagittalnaht. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn nicht &quot;gezogen&quot; durch die Schermesser bei diesem Schritt. </li><li> Vorsichtig schälen Scheitelbeine weg seitlich und Os occipitale posteriorly mit flachen Kurve Pearson rongeurs (FST). </li><li> Eine kleine Spatel aus rostfreiem Stahl wird dann verwendet, um heben das Gehirn von der Oberfläche des mittleren und hinteren Schädelgrube, und die freigelegte vestibulocochlea Nerven (CNVIII) schneiden in der Mitte zwischen dem Innenohr und Hirnstamm mit einer feinen Schere Iris. Schneiden diesen Nerv minimiert unnötige Spannung auf Axone der Primärafferens und deren Verbindungen mit Haarzellen. </li><li> Nach Durchtrennung des CN VIII wird das Gehirn in toto entfernt. </li><li> Die vestibuläre Labyrinth ist jetzt deutlich sichtbar in der mittleren Schädelgrube, mit dem Cochlea zeigt anteromedial. Rongeur beiden Seiten des vestibulären Labyrinth vor sanft Ausschneiden durch Ergreifen des vorderen Bogengang und Ziehen seitlich. </li><li> Tauchen Sie die ausgeschnitten Labyrinthe (Abbildung 1) in einem Seziertisch Schale mit den eiskalten, kontinuierlich vergast ACSF in Abschnitt 2.1 beschrieben. Unter einem Stereomikroskop, halten das Labyrinth zuder Boden der Schale durch Ergreifen des Cochlea. Verwenden feinen Pinzette entfernt zu kratzen an der Knochen über der vorderen Bogengang Ampulle. Sobald ein kleines Loch in den Knochen erreicht beginnen Fingern an die Knochen von der Ampulle. Vorsicht ist geboten, nicht auf die Zange durch den Knochen drücken, da dies Schäden an der zugrunde liegenden häutigen Labyrinths und Sinnesepithel verursachen kann. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sowohl die Front-und benachbarten horizontalen halbkreisförmigen häutige Kanäle und Ampullen ausgesetzt sind (Abbildung 2). </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die isolierten Maus vestibulären Labyrinth. A. Links) Schematische Darstellung der isolierten Maus vestibulären Labyrinth. Wichtige Bezugspunkte für den Zugriff auf den vestibulären Sinnesepithel sind die Cochlea, vordere und horizontalen Bogengänge Laboreled. Sternchen zeigen den Bogengang Ampulle mit dem vestibulären Sinnesepithel. B. Rechts) Photomicrograph des isolierten vestibulären Labyrinth aus einem 1-Monate alten Maus. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Exposition der Membranöse vestibulären Labyrinth. Die Knochen über der vorderen und horizontalen Bogengang Ampullen wurden entfernt, um die schwarz / braun gesprenkelte membranöse Ampullen und zugehörige ampullären Nerven (CNVIII) offenbaren zerkratzt. Das Schema in der unteren Platte stellt die Strukturen in den hervorgehobenen Bereich der Mikroaufnahme und zeigt die Beziehung der halbkreisförmigen Kanal Kanäle der Ampullen und CNVIII. <ol start="10"><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig heben Sie die Ampullen und zugehörige utricle vom knöchernen Labyrinth, um sicherzustellen, dass der zentrale Bereich der Ampullen (Contaligt ist, das sensorische Epithel) nicht beschädigt wird. In einigen Fällen kann der proximale Teil des halbkreisförmigen membranöse Kanal müssen möglicherweise mit Iris Schere geschnitten werden, um die Ampulle aus dem Knochen zu lösen. </li><li> Übertragen Sie die Triade, die beiden Ampullen und utricle in eine Petrischale mit Leibovitz L-15 Kulturmedium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gefüllt. Verwenden Sie ein Glasfaserkabel zu &quot;Hintergrundbeleuchtung&quot; das Gewebe. Dies ermöglicht die übersichtliche Visualisierung der Crista, die das sensorische Epithel innerhalb der Ampullen. </li><li> Vorsichtig einen Einschnitt in der gesprenkelten &quot;Dach&quot; der utricle mit den feinen Iris Schere. Setzen Sie diesen Einschnitt durch das Dach des vorderen und dann die horizontale Ampullen. Als den Einschnitt so nahe an der Kante des sensorischen Epithels möglichst ohne sie zu berühren (Fig. 3A). Stellen Sie sicher, dass es keine Stücke von Membran über der Sinnesepithel (3B) </li><li> Übertragen Sie die isolierten halb intakt Vorbereitung zu einem kleinen Glass-Boden Aufnahme Kammer mit L-15 Medien gefüllt. Belasten die Herstellung mit einem Raster aus feinen Nylonfasern, die an einem abgeflachten U-förmigen Platindraht (3B). Idealerweise werden die Fasern des Gitters nicht überlagern Sinnesepithel jedoch in einigen Fällen, in denen mehr Stabilität erforderlich ist, eine einzelne Faser Durchschneiden Sinnesepithel vielleicht bevorzugt. </li></ol><img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die isolierte semi-intakten Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel. A. Schematische Darstellung der semi-intakten Vorbereitung und Elektroden-Konfiguration. Die Ampulle über der Crista wurde &quot;de-Dach&quot;, um die Oberfläche des Sinnesepithel (grün) freizulegen. B. Photomicrograph der semi-intakten &#39;Dreiklang&#39; Vorbereitung zeigt die vordere (ac) und horizontalen (hc) Crista (utricle verdecktHinterbeine ac). Beachten Sie die Nylonfaser verwendet werden, um die Herstellung der Basis der Aufnahme Kammer zu sichern. Maßstab:. 100 um C. Eine Aufnahme Elektrode auf einem einzelnen vestibulären Haarzellen positioniert. Maßstab: 15 um. 3. Elektrophysiologie <ol><li> Perfundieren die semi-intakten Präparat mit kontinuierlich Sauerstoff L-15-Medium. Der Datenträger enthält einen pH-Indikator (Phenolrot) und die Farbe des Mediums sollte in den Aufnahmen überwacht werden. Der pH-Wert mit Sauerstoff sollte 7,3-7,4 sein und entsprechen einer roten Farbe. </li><li> Bereiten Aufnahme Pipetten von 1,5 mm (1,19 mm ID) Borosilikatglas mit einem Zwei-Schritt-Protokoll (Wärme Stufe 1: 72, und Wärme Schritt 2: 50) auf einem Feinpipettenziehvorrichtung (Narishige, Japan, Modell PP-830), um ein zu erreichen endgültige Impedanz von 3-4 MOhm. </li><li> Füllen Sie den Schaft der Pipette mit 3-4 mm Kaliumfluorid-basierte interne Lösung, die (in mm) 110 KF, KCl 12, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl 2,3 D-Glukose und 2 Na-ATP, pH 7,4 mit KOH. </li><li> Wickeln der Schaft der Pipette 2-3 mal und bis zur Spitze wie möglich mit einer dünnen Parafilm, um die Elektrode zu isolieren und zu reduzieren Pipette Kapazität. </li><li> Positionieren Sie die Pipette über die Sinnesepithel unter Low-Power-Vergrößerung (5X) auf einem aufrechten Mikroskop (Olympus BX51). Wechseln Sie zu hohe Leistung (40X) und visualisieren einzelnen vestibulären Haarzellen mit einem angeschlossenen CCD-Kamera. </li><li> Position Pipette an der Membran eines visualisierten Haarzellen (3C) mit einem Mikromanipulator (Sutter Instruments, Kalifornien, USA). Sobald ein Gigaohm Dichtung erreicht, Bruch der Zellmembran mit einer kleinen Menge von Unterdruck durch eine Saugöffnung auf der Pipettenhalter aufgebracht. </li><li> Machen whole-cell voltage clamp Aufnahmen unter Verwendung von Standardverfahren 8-9. </li></ol> 4. Zwei-Photonen-Mikroskopie <ol><li> Vorbereiten einer 0,9% igen Kochsalzlösung, enthaltend 5 mM Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB 1-; hexakaliumsalz; Invitrogen, Deutschland). </li><li> Während noch unter Wasser, legen Sie die &quot;de-Dach&quot; semi-intakten Dreiklang Vorbereitung auf ein kleines Stück Filterpapier (4x4 mm, 0,8 um dick, Millipore, Deutschland) sicherzustellen, dass die Sinnesepithel ungehindert von oben ist. </li><li> Das Filterpapier und Vorbereitung auf die Salzlösung bedeckt Basis Platinelektrode (7 ul) eines Elektroporators bestehend aus der Kombination von einem Impulsgeber und einem breitbandigen Verstärker, und die Abdeckung mit weiteren 5 ul 5 mM Lösung des synthetischen Calcium Indikator-Farbstoff Oregon Green 488 BAPTA-1 (Abbildung 4). </li></ol><img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> Abbildung 4. Masse Elektroporation. A. schematische Darstellung Querschnitt Elektroporation Konfiguration. Der semi-intakten Zubereitung (*) auf einem Stück Filterpapier in Calcium dy eingetaucht platzierte (Oregon Green 488 BAPTA-1) und Strom zwischen 2 Platin-Elektroden aufgebracht. Adaptiert von Briggman und Euler, 2011 10. <ol start="4"><li> Bringen Sie die obere Platinelektrode parallel mit der Basis-Elektrode in einem Abstand von etwa 2 mm, darauf achten, daß die Ausrichtung der Vorbereitung stören, wenn sie mit der Oregon Green 488 BAPTA-1-Lösung wird zu kontaktieren. </li><li> Übergeben Sie einen kurzen Stromimpuls in der Zubereitung (Parameter für den aktuellen, +13 V, 10 ms Impulsbreite, Frequenz 1 Hz, 10 Rechteckpulse) 10-11. </li><li> Auf dem Boden einer Glasboden Aufnahme Kammer mit L-15-Medium gefüllt ist, legen Sie einen kleinen Klecks Silikonöl und Position der semi-intakten Vorbereitung auf sie, wieder dafür, dass die Sinnesepithel ungehindert von oben ist. Um Stabilität in Bildgebung zu gewährleisten, ersetzen Sie die Nylon-Gitter über die Zubereitung wie oben beschrieben (siehe Punkt 2.13). </li><li> Mit der Zwei-Photonen-Mikroskop machen optischen Aufnahmen spontanneous Calcium Aktivität im sensorischen Epithel (Abbildung 7) mit Standard Bildgebungsprotokolle 10-11. </li></ol>

<ol><li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li>
<li>Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li>
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<li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li>
<li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die zugrunde liegenden Mechanismen unseren Gleichgewichtssinn haben begrenzte Aufmerksamkeit im Vergleich mit anderen sensorischen Systemen erhalten, z. B. die visuelle und auditive Systeme. Von den Studien, die Veränderungen in der vestibulären oder Balance-Funktion untersucht haben, haben die meisten auf verhaltensorientierten Maßnahmen einschließlich der vestibulookulären Reflex konzentriert, mit unvollständigen Kenntnis der fundamentalen Bausteine ​​der Balance-den vestibulären Haarzellen sich. Diese Studie...

Trotz der bedeutenden Beitrag des vestibulären Systems zu unserem täglichen Leben, bleiben ein klares Verständnis der Prozesse, die für die beobachtete Abnahme in vestibulären Funktion mit dem Alter schwer zu fassen. Ein Grund für diesen Mangel an Wissen ist, dass Rückgang der vestibulären Funktion hat fast ausschließlich erforscht mit Verhaltensstörungen Assays, einschließlich der vestibulookulären Reflex (VOR), eine genaue Anzeige der extrinsische vestibulären Funktion, sondern bietet nur begrenzten Einblick in die Veränderungen der intrinsischen Komponenten . Dies ist ein wesentliches Hindernis für unser Verständnis der vestibulären Haarzellen Funktion in Gesundheit, Krankheit oder Alterung. Zwar gibt es viele Studien einzelner vestibulären Haarzellen wurde ein entscheidender Nachteil war die Abhängigkeit von akuten Haarzellen Zubereitungen, in denen Haarzellen und sogar Kelch afferenten Terminals aus ihrer normalen Umgebung über mechanische und / oder enzymatische Behandlung entfernt werden. Solche Ansätze zwangsBly stören das empfindliche Mikroarchitektur zwischen Haarzellen und Kelch und Haarzellen und Stützzellen. Mit der Entwicklung von semi-intakten Präparate 1-5 und einem isolierten Maus Labyrinth Zubereitung 6, gibt es jetzt eine Möglichkeit, die verschiedenen Formen der synaptischen Kommunikation unter den Bedingungen, die stärker die in vivo ähneln studieren. Tatsächlich zeigte Lim et al. (2011) deutliche Unterschiede in ganzen Zellen Ströme von akut isoliert Typ I aufgezeichnet vestibulären Haarzellen zu denen, die eingebettet in die Neuroepithel blieb verglichen. Insbesondere wird angenommen, dass Kalium in den interzellulären Raum ansammeln, zwischen den Haarzellen und Kelch afferenten und signifikant verändern Haar-Zell-Antwort 7. Diese Art von Informationen wäre unmöglich, ohne die semi-intakten Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel hier beschriebenen zu erhalten. Wir zeigen die semi-intakten Präparat der Maus crista 3Und zeigen repräsentative Ergebnisse von whole-cell Patch Elektrophysiologie erhalten und Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Leibovitz medium L-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA-1-oregon green</td><td>Invitrogen</td><td>O6806<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Upright Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Zwei-Photonen-Mikroskop</td><td>Olympus/La Vision</td><td>BX51WI/ TriMScope II</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF Pinzette</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Schere mit Standardmuster</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>InstraTECH A-D Konverter</td><td>HEKA</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Mikromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-225/M</td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp-Verstärker</td><td>Axon Instruments</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssoftware (Elektrophysiologie)</td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imspector Datenerfassungssoftware (Zwei-Photon)</td><td>Max-Planck-Innovation</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

eine isolierte semi-intakt vorbereitung der maus vestibuläre sinnesepithel für elektrophysiologie und hochauflösende zwei-photonen-mikroskopie

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Verstehen vestibulären Haarzellen funktionieren unter normalen Bedingungen, oder wie Trauma, Krankheit und Altern stören diese Funktion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von präventiven Ansätze und / oder neue therapeutische Strategien. Allerdings haben die meisten Studien, die abnormale vestibulären Funktion nicht auf der zellulären Ebene gewesen, aber konzentrierte sich hauptsächlich auf Verhaltens-Assays Vestibularisausfall wie Ganganalysen und vestibulookulären Reflex Leistung. Während diese Arbeit wertvolle Daten über das, was passiert, wenn etwas schief geht ergeben hat, ist nur wenig Informationen über die zugrunde liegenden Ursachen der Funktionsstörung aufgelesen. Von den Studien, dass auf der zellulären und subzellulären Prozessen, die Vestibularfunktion zugrunde zu konzentrieren, haben die meisten auf akut isolierten Haarzellen, ohne ihre synaptischen Verbindungen und Unterstützung Zellumgebung verlassen. Daher ist eine große technische Herausforderung gewesen Zugriff auf die außerordentlich empfindlich vestibulären Haarzellen in einem prepTrennung, die am wenigsten gestört, physiologisch. Hier zeigen wir eine semi-intakten Präparat der Maus vestibulären Sinnesepithel, die die lokale Mikroumgebung behält einschließlich Haarzellen / primären afferenten Komplexe.

Die elektrophysiologischen Eigenschaften des vestibulären Haarzellen sind abhängig von der komplexen microarchitecture 7, in dem sie eingebettet sind. 5 zeigt, dass die semi-intakten Epithel vestibulären Herstellung verwendet werden, um zwischen Typs unterschieden werden können I Haarzellen (5A), Typ II Haarzellen (5B), und der Kelch primären afferenten (5C) auf der Grundlage charakteristische Ganzzell Leitwerte. Diese Merkmale beinhalten ein...

Analyse der vestibulären Haarzellen Funktion wird durch ihre Lage tief innerhalb der schwierigste Teil des Schädels, der Felsenbein kompliziert. Die meisten funktionalen Haarzellen Studien haben akut isolierten Haarzellen verwendet. Hier beschreiben wir eine semi-intakten Herstellung von Maus vestibulären Epithel für elektrophysiologische und Zwei-Photonen-Mikroskopie Studien.

Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine nahezu normale Präparation des vestibulären Sinnesepithels der Maus zu erhalten, die zur Untersuchung grundlegender zellulärer und subzellulärer Prozesse der vestibulären Haarzellen verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst das knöcherne vestibuläre Labyrinth aus dem Schädelkasten isoliert wird. Im zweiten Schritt wird vorsichtig mit feiner Pinzette an dem knöchernen Labyrinth gekratzt, um das darunterliegende membranöse Labyrinth freizulegen, bevor es vollständig aus seiner knöchernen Hülle entfernt wird.Anschließend wird das vestibuläre Sinnesepithel freigelegt, indem die überlagernde Membran mit feinen Iris-Scheren entfernt wird. Im letzten Schritt wird die halb intakte Präparation des Sinnesepithels auf einer Kammer mit Glasboden befestigt und mit einem beschwerten Nylonnetz stabilisiert. Abschließend werden Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Zweiphotonen-Mikroskopie verwendet, um die intrinsischen Membraneigenschaften bzw. den Kalziumsignalisierungsprofil jeder Art von vestibulärem Haarzelle und/oder primärer afferenter Zelle zu charakterisieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, einschließlich isolierter Haarzellenpräparationen, liegt darin, dass wir die Anordnung der Haarzellen und ihrer primären afferenten Neuronen unter so nahe wie möglich an normalen Bedingungen erhalten können. Dies bedeutet, dass wir Messungen unter nahezu physiologischen Bedingungen durchführen können und diese Messungen gleichzeitig vornehmen können. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Dissektion sehr schwierig zu erlernen ist, hauptsächlich weil das Vestibularorgan tief im Schläfenbein des Schädels eingehüllt ist und außerdem das sensorische Epithel selbst sehr klein ist und während der Dissektion leicht beschädigt werden kann.Die Elektroporation und die Zwei-Photonen-Verfahren werden von Stefano DeMarco demonstriert, einem Kollegen, der in meinem Labor arbeitet. Nachdem eine C57BL/6-Maus gemäß den lokalen institutionellen und behördlichen Richtlinien tief anästhesiert und enthauptet wurde und der Schädel freigelegt ist, wird eine kleine Inzision am Lambda im Schädel vorgenommen und entlang der sagittalen Naht geschnitten. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn nicht durch die Scherklinge mitgezogen wird.Während dieses Schritts kalte A-Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit auf das Gehirn auftragen, um das Gewebe abzukühlen, und anschließend vorsichtig die Parietal-Knochen seitlich sowie den Hinterhauptsknochen nach posterior mit einer flach gebogenen Pearson-Urs-Zange ablösen. Erneut kalte A-Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit auftragen. Danach mit einem kleinen Edelstahlspatel das Gehirn vorsichtig von der Oberfläche der mittleren und hinteren Schädelgrube anheben. Das vestibuläre Labyrinth ist nun in der mittleren Schädelgrube deutlich sichtbar, wobei die Cochlea nach vorne weist.Fügen Sie an der Medialseite eiskalte A-CSF hinzu und rühren Sie auf beiden Seiten des vestibulären Labyrinths. Dann entfernen Sie vorsichtig das vestibuläre Labyrinth, indem Sie den vorderen Bogengang greifen und lateral ziehen. Legen Sie die entfernten Labyrinthe in eine Petrischale, die eiskalte enthält.Kontinuierlich belüftete A CSF unter einem Stereomikroskop platziert. Dieses Diagramm zeigt das ausgeschnittene Labyrinth im Detail. Danach, während man unter dem Stereomikroskop arbeitet, greifen Sie mit feinen Pinzetten das Cochlea an und halten das Labyrinth auf den Boden der Schale. Verwenden Sie eine zweite Pinzette, um das Knochengewebe über der Ampulle des vorderen Bogengangs abzukratzen. Sobald ein kleines Loch im Knochen entstanden ist, beginnen Sie, das Knochengewebe von der Ampulle wegzuklopfen. Achten Sie darauf, die Pinzette nicht durch den Knochen zu drücken, da dies Schäden am darunterliegenden membranösen Labyrinth und sensorischen Epithel verursachen kann.Setzen Sie dieses Verfahren fort, bis sowohl die vordere als auch die angrenzende horizontale halbkreisförmige Membran, die Kanäle und das pul freigelegt sind, wie hier gezeigt. Heben Sie nun mit feinen Pinzetten vorsichtig das pul zusammen mit dem zugehörigen Utriculus von dem knöchernen Labyrinth an, und achten Sie darauf, dass der zentrale Bereich des puli, der das sensorische Epithel enthält, nicht beschädigt wird. Überführen Sie das Triade, das die beiden pule und den Utriculus enthält, in eine Petrischale, die mit Leibovitz' L-15-Kulturmedium gefüllt ist.Verwenden Sie eine Glasfaser, um das Gewebe von hinten zu beleuchten, um eine klare Sicht auf die Krista mit dem sensorischen Epithel innerhalb des Pul zu ermöglichen. Verwenden Sie nun die feinen Iris-Scheren, um vorsichtig einen Einschnitt in das gesprenkelte Dach des Amp zu machen. Führen Sie den Einschnitt so nah wie möglich an der Kante des sensorischen Epithels durch, ohne dieses zu berühren.Wie hier gezeigt, stellen Sie sicher, dass keine Membranstücke das sensorische Epithel überlagern. Dieses Schema zeigt die Form der endgültigen Präparation und die Positionierung der Ableitelektrode. Übertragen Sie die isolierte, halb intakte Präparation in eine kleine Aufzeichnungskammer mit Glasboden, die mit L-15-Medium gefüllt ist, und drücken Sie die Präparation vorsichtig mit einem Raster aus feinen Nylonfasern nieder, das an einem abgeflachten, U-förmigen Platindraht befestigt ist. Das Gewebe ist nun bereit für elektrophysiologische Ableitungen.Perfusieren Sie das halb intakte Präparat mit kontinuierlich mit Sauerstoff angereichertem L-15-Medium. Stellen Sie sicher, dass das Medium rot bleibt, um einen pH-Wert bei Sauerstoffgehalt von 7,3 bis 7,4 anzuzeigen. Bereiten Sie während des gesamten Verfahrens Aufzeichnungspipetten aus Glas mit 1,5 Millimeter Außendurchmesser und 1,19 Millimeter Innendurchmesser vor.Entnehmen Sie Silikatglas mithilfe eines zweistufigen Protokolls auf einem Mikropipettenzuggerät, um eine endgültige Impedanz von drei bis vier Megaohm zu erreichen. Füllen Sie den Schaft der Pipette mit drei bis vier Millimetern einer Kaliumfluorid-basierten intrazellulären Lösung. Wickeln Sie anschließend den Schaft der Pipette zwei bis drei Mal und so weit wie möglich bis zur Spitze mit einem dünnen Streifen Parafilm um, um die Elektrode zu isolieren und die Pipettenkapazität zu verringern.Platzieren Sie die Pipette unter geringer Vergr&ouml;&szlig;erung (f&uuml;nffache Vergr&ouml;&szlig;erung) auf einem aufrechten Mikroskop &uuml;ber das Sinnesepithel. Wechseln Sie zu einer 40-fachen h&ouml;heren Vergr&ouml;&szlig;erung und visualisieren Sie einzelne vestibul&auml;re Haarzellen mit einer angeschlossenen CCD-Kamera. Positionieren Sie die Pipette mithilfe des Mikromanipulators auf der Membran einer sichtbaren Haarzelle.Wenn ein Gigaohm-Siegel erreicht ist, durchbrechen Sie die Zellmembran durch Anlegen eines geringen negativen Drucks über einen Absauganschluss am Pipettenhalter und nehmen Sie Ganzzell-Spannungsclamp-Aufzeichnungen unter Verwendung standardisierter Techniken für die Zweiphotonenmikroskopie vor. Belassen Sie das Dé-roofing halb intakt. Die Präparation unter Flüssigkeit belassen und auf ein kleines Stück Filterpapier übertragen.Stellen Sie sicher, dass das sensorische Epithel von oben unverdeckt ist. Legen Sie das Filterpapier und die Präparation auf die mit Salzlösung bedeckte Basis-Platinelektrode eines Elektroporators. Bringen Sie die obere Platinelektrode parallel zur Basiselektrode und in einem Abstand von etwa zwei Millimetern an, wobei darauf geachtet werden muss, die Orientierung der Präparation nicht zu stören.Wenn Kontakt mit dem Oregon Green 488 BAPTA hergestellt wird, wird eine Lösung wie in diesem Bild gezeigt hergestellt. Geben Sie einen kurzen Stromimpuls über das Präparat. Geben Sie einen kleinen Tropfen Silikonöl auf den Boden einer Aufnahmekammer mit Glasboden, die mit L-15-Medium gefüllt ist.Danach die halb intakte Präparation erneut darauf platzieren und sicherstellen, dass das sensorische Epithel von oben unverdeckt bleibt. Um die Stabilität während der Bildgebung zu gewährleisten, das Nylonraster wieder über die Präparation legen. Anschließend mit dem Zwei-Photonen-Mikroskop optische Aufnahmen der spontanen Kalziumaktivität im sensorischen Epithel unter Verwendung standardisierter Bildgebungsprotokolle durchführen.Dieses Bild zeigt Ganzzellströme, die von einer Haarzelle des Typs eins des Vestibularorganes aufgezeichnet wurden und die durch große, kollabierende Abschlussströme gekennzeichnet sind, die hier durch den Pfeil angezeigt werden. Ganzzellströme wurden von einer Haarzelle des Typs zwei des Vestibularorganes aufgezeichnet. Beachten Sie das Fehlen von Abschlussströmen.Diese Aufnahme zeigt eine Ganzzell-Aufzeichnung von einem kalikiformen primären afferenten Neuron, das durch vorübergehende, natriumvermittelte Ströme gekennzeichnet ist, wie durch den Pfeil nach Depolarisation von einem negativen Ruhemembranpotential von minus 120 Millivolt angezeigt. Alle Zellen wurden bei minus 60 Millivolt gehalten. Diese Abbildung zeigt Strom-Spannungs-Beziehungen für Haarzellen vom Typ zwei, die von jungen und älteren Mäusen bei zunehmender Depolarisationsdauer aufgezeichnet wurden.Diese Histogramme zeigen die durchschnittliche Leitfähigkeit und ein Aktivierungsverhältnis von Haarzellen des Typs zwei bei jungen und alten Mäusen, basierend auf den 100 Millisekunden IV-Kurven. Diese Zwei-Photonen-Mikroaufnahmen zeigen die BAFTA-eins-Oregon-Grün-Calcium-Aktivierung als Reaktion auf normales L-15-PERFU-acht im oberen Panel bzw. auf L-15, das 100 Millimolar Kaliumchlorid enthält, im unteren Panel. Die Pfeile zeigen dieselbe einzelne Haarzelle vor und nach der Zugabe von Kaliumchlorid.Diese Darstellung zeigt das Kalzium-Fluoreszenzprofil der einzelnen Zelle, die im vorherigen Bild durch den Pfeil markiert ist. Dieses Zweiphotonen-Mikroskopiebild des sensorischen Epithels zeigt die Beladung einzelner Haarzellen mit Oregon Green 488 BAPTA-1. Der Ausschnitt zeigt die subzelluläre Lokalisation von Kalzium im Zytoplasma einer Typ-1-Haarzelle, wie durch den Pfeil angegeben, oder in der Kalix-primären afferenten Faser, die eine Typ-1-Haarzelle umgibt, wie durch die Doppelpfeile gekennzeichnet.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die Dissektion weniger als 10 Minuten dauern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das vestibuläre sensorische Epithel isoliert, wie man es intakt hält und wie man seine Lebensfähigkeit für elektrophysiologische Ableitungen und für die Zweiphotonen-Calcium-Bildgebung erhält.

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Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

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