Name: Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Erfahren Sie eine einfache Methode zur Induktion der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) in verschiedenen Zelltypen. Diese Technik ermöglicht die Analyse metastatischer Zellsignaturen für Krebsdiagnostik und Therapie.

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Die Autoren bedanken sich bei Julia und Martin Hatler Ramsden (R &amp; D Systems) für hilfreiche Diskussionen und Manuskript Kritik bestätigen.

1. Die Induktion der EMT <ol><li> Warmen Kulturmedium auf 37 º C in einem Wasserbad. Das verwendete Kulturmedium ist das gleiche wie für den Standard-Kultur von den Zellen von Interesse verwendeten Medien. Zum Beispiel wird die A549 humanen Lungenkarzinomzelllinie in Kaighn F12 mit 10% fötalem Rinderserum und 2 mM Glutamin gezüchtet. </li><li> Ernten Sie die Zellen von Interesse mit einem Dissoziation Lösung (zB TrypLE Express). </li><li> Suspend-Zellen in vorgewärmten Kulturmedium in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension bei 400 × g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Eingießen in einen Abfallbehälter. </li><li> Hängen Sie das Zellpellet in vorgewärmten Kulturmedien. </li><li> Count lebensfähiger Zellen mit Trypan-Blau. Entfernen einer Probe der Zellsuspension und 0,4% Trypanblau-Lösung zu verdünnen. Platz 10 ul der verdünnten Probe auf einer Zählkammer und zählen lebensfähigen Zellen (Zellen, die nicht erscheinen, blau). Verwenden Zellzahlen, um die Zelle zu bestimmen, dichte in Ihre Lösung. </li><li> Platten Zellen auf Gewebekultur-behandelten Platten oder Kolben bei 0,9-1,0 × 10 4 Zellen pro cm 2. Beispielsweise 0,5 × 10 6 Zellen in einer 100 mm-Platte in Kulturmedien, enthaltend 1X EMT Induktionsmedium Zusatz (6 ml Medium pro 100 mm-Platte) plattiert. </li><li> Kultur plattierten Zellen in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator. Überwachung der Zellmorphologie täglich. </li><li> Drei Tage nach der Plattierung, entfernen Medien und ersetzen mit frischem vorgewärmten Kulturmedien, die 1X EMT Inducing Medien Ergänzung. Weiterhin Kultur in ein 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Fünf Tage nach der Beschichtung, sind Zellen für die Analyse bereit. Zellmorphologie durch invertierte Lichtmikroskopie sichtbar. </li></ol> 2. Analyse der Proteinexpression durch Immunzytochemie <ol><li> Vorbereitung sterile 12 mm Deckgläsern für eine 24-Well-Platte, indem Deckgläschen in einer Petrischale mit 95% Ethanol. Deckgläser vorsichtig entfernen aus Ethanol unsten einer Nadel und einer gebogenen Pinzette und Flamme sterilisieren. Zeigen sterilen Deckglas in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Wiederholen Sie mit den restlichen Deckgläser. </li><li> Bereiten Sie die Zellsuspension, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben - 1.7. </li><li> Platte 1,6 x 10 4 Zellen / Vertiefung in 0,5 ml vorgewärmten Kulturmedien, die 1X EMT Inducing Medien Ergänzung. </li><li> Wachsen und ernähren Zellen wie in den Abschnitten 1.9 beschrieben - 1.11. </li><li> Fünf Tage nach dem Ausplattieren, wird das Medium entfernt und die Zellen zu fixieren mit 300 &amp;mgr; l / Vertiefung von 4% Paraformaldehyd in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fixiermittel entfernen und spülen Zellen 2x mit 1x PBS, 500 ul /. </li><li> Inkubieren Zellen in 400 &amp;mgr; l / Vertiefung Blockierungspuffer (1 × PBS, das 1% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normalem Eselserum und 0,3% Triton X-100) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubation in primären Antikörpers an Hersteller empfohlenen Konzentration in 400 ul / Blocking-Puffer für 3 Stunden bei Raumtemperature oder über Nacht bei 4 ° C. Bei Verwendung eines primären Antikörper direkt an ein Fluorochrom konjugiert ist, inkubiert Proben im Dunkeln. </li><li> In 500 &amp;mgr; l / Vertiefung 1 × PBS mit 0,1% BSA für 5 min bei jedem Waschwäsche Zellen dreimal. Bei Verwendung eines primären Antikörper direkt mit einem Fluorochrom konjugiert, gehen Sie direkt zu Schritt 2.12. </li><li> Zellen in sekundären Antikörper inkubieren bei vom Hersteller empfohlenen Konzentration in 400 ul / Vertiefung 1 × PBS, das 1% BSA für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> In 500 &amp;mgr; l / Vertiefung 1 × PBS mit 0,1% BSA für 5 min bei jedem Waschwäsche Zellen dreimal. </li><li> Wenn gewünscht, Gegenfärbung Kerne mit DAPI-Lösung. </li><li> Spülen Zellen in VE-Wasser und montieren Deck Gesicht nach unten auf einem Objektträger mit Montage Medien. </li></ol>

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<li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li>
<li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
</ol>

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Bisherige Verfahren zur Induktion EMT haben im Allgemeinen verwendet, TGF-β Stimulation oder genetische Veränderung. Obwohl TGF-β allein hat sich gezeigt, EMT in einigen Zelltypen induzieren, wurde nun gezeigt, dass TGF-β für EMT notwendig ist, aber es genügt nicht in allen Zelltypen 6,14. Mit genetischen Modifikation für EMT Induktion ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Kombination von Faktoren, einschließlich, Anti-Human-E-Cadherin-, anti-human sFRP-1, Anti-Human-Dkk-1, rekombinantes humanes Wnt-5a und rekombinantes menschliches TGF-β1, zuverlässig herbei EMT. Diese Kombination von Faktoren ist für die E-Cadherin-basierten Haftung, einen entscheidenden Schritt für EMT Induktion 4 zu blockieren, und verbessern Wnt-Signalweg durch Hinzufügen des Wnt-5a-Protein als auch mit blockierende Antikörper gegen den Wnt-Inhibitoren, sFRP-1 und Dkk -1. Wnt-und TGF-β-Signalisierung wurde gezeigt, dass in einer autokrinen Schleife dienen zur Einleitung und Aufrechterhaltung der mesenchymalen Zell state 6. Dieses Verfahren vermeidet Induktions Genmanipulation und ist effektiver als die Verwendung von TGF-β allein. Wichtig ist, dass wir in der Lage, die Induktion der EMT in Zelltypen zu beobachten, einschließlich MCF7 und PANC-1-Zellen, die zuvor gezeigt wurde, nicht nur auf die TGF-β Stimulation reagieren (Fig. 5) 14. Zellen mit EMT-Inducing Medien Supplement zeigen weniger kompakt und erhöhte spindelförmige Morphologie (Abbildung 1) behandelt. Zusätzlich gibt es eine Abnahme der Oberflächen E-Cadherin-Expression gleichzeitig mit einem Anstieg der Fibronektin, das Markenzeichen von EMT (Fig. 2 und 3) sind. Zusätzliche mesenchymalen Marker wie Vimentin und Schnecke sind auch in den EMT induzierten Zellen im Vergleich zu nicht-induzierten Kontrollen (Fig. 4) hochreguliert. Erhöhte Migration und Invasion Fähigkeiten sind die wichtigsten Funktionsmerkmale von mesenchymalen Zellen. In in vitro </em&gt; Migration und Invasion Assays Zellen mit EMT-Inducing Medien Supplement behandelt wurden, zeigten eine deutlich erhöhte Kapazität zur Migration und dringen (Abbildung 6). Diese einfache Methode zur Induktion EMT ist nützlich für die Untersuchung der EMT Signalgebung mit den Antikörperarray-Expressionsdaten in Fig. 7 gezeigt, dargestellt. Verschiedene Zelltypen können pre-und post-EMT Induktions verglichen werden, um gemeinsame Expression Signaturen mit EMT verbunden sind, wie die Erhöhung der phosphorylierte CREB und ERK1 / 2 in sowohl MCF7 und A549 EMT-induzierten Zellen gesehen zu erhalten. S133 Phosphorylierung von CREB stimuliert die DNA-Bindung und hat sich gezeigt, stromabwärts von TGF-β1-induzierten EMT 15 zu wirken. ERK1 / 2 Phosphorylierung wurde auch gezeigt, stromabwärts von TGF-β1-induzierten EMT 16 zu wirken. Unterschiede in der Signalwege zwischen den Zellen-Typen können auch erläutert, wie mit der Zunahme der GSK-3β-Phosphorylierung in A549 Zellen gegenüber p70S6 sehenK-Phosphorylierung in MCF7. GSK-3β-Phosphorylierung an Serin 9 verringert sie Funktion und GSK-3β ist gezeigt worden, um die pro-EMT-Transkriptionsfaktor, Schnecke 17 zu verhindern. Im Gegensatz dazu induziert p70S6K Snail Tätigkeit und deren Phosphorylierung wird mit der Aktivierung dieses Proteins 18 zugeordnet. Insgesamt einfache und sichere Induktion der EMT, insbesondere in bisher nicht gezeigt, um sich ausschließlich auf TGF-β-Zellen reagieren, ist für das Verständnis der Biologie von EMT, Festlegung gemeinsamer Ausdruck Signaturen für die Verwendung als prognostische Marker, und die Entwicklung und Evaluierung neuer Therapeutika für Krebs und fibrotischer Erkrankung.

Epitheliale mesenchymale Transition (EMT) ist der Prozess, durch den eine polarisierte Epithelzelle erfährt eine Vielzahl von Änderungen, die sich in einer sehr beweglich, Fibroblasten-ähnliche Zellen mesenchymalen. Dieser Prozess erfolgt zum Teil durch Veränderungen der Genexpression und der Degradation von Adhärenzverbindungen, was zu einer erhöhten Fähigkeit zu migrieren und zu erobern. Physiologisch EMT spielt eine wichtige Rolle während der embryonalen Entwicklung und Wundheilung. Verlust der Kontrolle über die richtige EMT kann zur Fibrose und Metastasierung von Karzinomen 1,2 führen. Die Reduktion von E-Cadherin auf der Oberfläche der Epithelzellen ist ein kritischer Schritt in der Progression einer Zelle durch EMT 3,4. E-Cadherin ist ein Single-Pass-Transmembranprotein, das direkt mit Cadherin Proteine ​​auf benachbarten Zellen interagiert. Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Zelladhäsion, E-Cadherin Einflüsse Zellsignalisierung über Wechselwirkungen zwischen dem zytoplasmatischen Schwanz von E-Cadherin einda Vielzahl von regulatorischen Proteinen, insbesondere β-Catenin. β-Catenin spielt eine Rolle bei der Stabilisierung der Adhärenzverbindungen. Während der Wnt-Signalisierung wird β-Catenin von E-Cadherin freigegeben und an den Kern, wo es als ein Transkriptionsfaktor, der stromabwärts des Wnt-Signalwegs 3,4,5 wirkt transloziert. Im Zellkern ist β-Catenin wurde gezeigt, dass die Transkription von mehreren EMT bezogene Faktoren wie Twist, Slug, Fibronektin, und eine Vielzahl von Matrix-Metalloproteasen 3,6 zu erhöhen. Neben Wnts hat TGF-β Signal gezeigt worden, um eine bedeutende Rolle bei EMT Induktion sowohl während der normalen Entwicklung und bei Krankheitszuständen 7,8,9 spielen. TGF-β ist in der EMT, die während der Gaumen Bildung und in der Entwicklung von Herz 10 tritt beteiligt. Es hat sich auch in Fibrose und in der Krebsprogression zur Metastasierung 7 in Verbindung gebracht. Das hier beschriebene Verfahren provides konsistente Induktion der EMT in einer Vielzahl von Zelltypen ohne genetische Manipulation. Dieses Verfahren verwendet eine Mischung aus E-Cadherin, sFRP-1 und Dkk-1-blockierende Antikörper und Wnt-5a und TGF-β1 rekombinanten Proteinen. Dieser Cocktail ist für die E-Cadherin-basierten Haftung zu blockieren und gleichzeitig die Wnt-und TGF-β-Signalisierung. Die Fähigkeit für robuste EMT Induktion ist entscheidend für das Verständnis der Biologie dieser Prozess und wie man sie für therapeutische Zwecke zu manipulieren. Strom gemeinsam Marker der EMT, E-Cadherin (in EMT herunterreguliert) und Vimentin (in EMT hochreguliert), können gefunden werden in Krebs co-exprimiert und somit nicht bieten die besten Diagnosemarker von potentiellen metastatischen Zellen 12. Wichtiger ist, ist die Analyse von einer Vielzahl von Zelltypen, EMT laufen haben nützliche gemeinsame Genexpression Signaturen, die für diagnostische Zwecke bei Krebs und Fibrose 11 eingesetzt werden können. Zusätzlich haben neuere Studien gezeigt, dass EMT kann eine Rolle bei der Bildung von Krebs-Stammzellen zu spielen, was darauf hindeutet, dass Zellen, die EMT durchlaufen haben kann für Wirkstoff-Screening sein, um Verbindungen, die diese Zielzellen kann 13 zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Epithelzellen von Interesse</td><td></td><td></td><td>Wir haben getestet: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7 und PANC1</td></tr><tr><td>EMT Inducing Media Supplement</td><td>R& D Systems</td><td>CCM017</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TGF-&#946; 1</td><td>Forschung und Entwicklung D Systems</td><td>240-B</td><td>Verwendet bei 10 ng/ml</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin NL557 konjugierten Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>NL648R</td><td>Wird in einer Verdünnung von 1:10 für die Immunzytochemie</td></tr><tr><td>verwendet Anti-E-Cadherin </td><td>R& D Systems</td><td>MAB1838</td><td>Einsatz bei 0,1 &mu; g/ml für Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-Fibronektin</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1918</td><td>Einsatz bei 10 &mu; g/ml für Immunzytochemie; Verwendet bei 0,5 μ; g/ml für Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>R& D Systems</td><td>AF5718</td><td>bei 0,2 μ; g/ml für Western Blotting</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse NL493 Sekundärantikörper</td><td>R& D Systems</td><td>NL009</td><td>Wird in einer Verdünnung von 1:200 für die Immunzytochemie</td></tr><tr><td>verwendet Donkey Anti-Goat HRP Sekundärantikörper</td><td>R& D Systems</td><td>HAF109</td><td>wird im Verhältnis 1:2000 für das Western-Blotting</td></tr> von <tr><td>Ziegen-Anti-Maus-HRP-Sekundärantikörpern</td><td>R& verwendet D Systems</td><td>HAF007</td><td>Verwendet im Verhältnis 1:2000 für Western Blotting</td></tr><tr><td>EMT 3-Farben-Immunzytochemie-Kit</td><td>R& D Systems</td><td>SC026</td><td>Wird laut Hersteller verwendet s Anweisungen. Dieses Kit enthält direkt konjugierte Antikörper gegen E-Cadherin, Vimentin und Snail.</td></tr><tr><td>96-Well-BME-Zellinvasions-Assay</td><td>R& D Systems</td><td>3455-096-K</td><td>Dieses Kit wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet.</td></tr><tr><td>Proteome Profiler Humanes Phospho-MAPK Array Kit</td><td>R& D Systems</td><td>ARY002B</td><td>Dieses Kit wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet19.</td></tr><tr><td>Montagemedien</td><td>R& D Systems</td><td>CTS011</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Trypanblau-Lösung</td><td>Life Technologies</td><td>15350-061</td><td></td></tr><tr><td>1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)95</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselserum</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>789-704</td> In <td>1X PBS verdünnen, um eine 10%ige Stammlösung</td></tr><tr><td>herzustellen Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td> In <td>1X PBS auf eine Arbeitskonzentration von 4% verdünnen.</td></tr><tr><td>DAPI Lösung</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Herstellung einer Stammlösung bei 14,3 mM durch Auflösen in Wasser. Die Arbeitslösung ist eine 1:5000-Verdünnung der Stammlösung in 1X PBS.</td></tr><tr><td>Feine spitze gebogene Pinzette</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Deckgläser</td><td>Carolina Biological 633009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fettfreie Trockenmilch</td><td></td><td></td><td>Wird mit 5 % TBST zum Blockieren im Western Blotting</td></tr><tr><td>TBST verwendet [25 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tween 20]</td><td></td><td></td><td>Zum Western Blotting Blockieren und Waschen</td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td></td><td></td><td>Für Western Blotting </td></tr><tr><td>4-20% SDS-Seitengel</td><td></td><td></td><td>Für Western Blotting</td></tr><tr><td>ECL-Substrat</td><td></td><td></td><td>Für Western Blotting</td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platten/Kolben, mit Gewebekulturen behandelte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten, mit Gewebekulturen behandelt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten / Pipettenspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettierhilfe / Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 > C/5%CO2 Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Lichtmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induktion und analyse von epithelialen zu mesenchymalen transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epitheliale mesenchymale Transition (EMT) ist für die richtige Morphogenese während der Entwicklung. Fehlregulation dieses Prozesses wurde als ein Schlüsselereignis in der Fibrose und der Progression von Karzinomen zu einem metastasierten Zustand gebracht worden. Das Verständnis der Prozesse, die EMT zugrunde liegen, ist für die Frühdiagnose und klinische Kontrolle dieser Krankheitszustände Imperativ. Zuverlässige Induktion der EMT in vitro ist ein nützliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung sowie zur gemeinsamen Genexpressionssignaturen für diagnostische Zwecke zu identifizieren. Hier zeigen wir ein einfaches Verfahren für die Induktion der EMT in einer Vielzahl von Zelltypen. Verfahren zur Analyse von Zellen, prä-und post-EMT-Induktion durch Immunzytochemie sind ebenfalls enthalten. Darüber hinaus zeigen wir die Wirksamkeit dieser Methode durch Antikörper-basierten Array-Analyse und Migration / Invasion Assays.

. EMT Induzieren hier beschriebenen Kulturbedingungen eine robuste Methode zur Induktion von EMT in einer Vielzahl von Zelltypen 1 und 2 zeigen die Morphologie und Markerexpressionsniveaus für 4 verschiedenen menschlichen Zelllinien: T98G-Glioblastomzellen, Kolon-Adenokarzinom-Zellen HT29 , A549-Lungenkarzinomzellen und MCF10A Brustepithelzellen. Zellen, die mit der EMT Inducing Medien Supplement behandelt wurden, änderte sich von einem klassischen epithelialen Morphologie (den 1A - 1D) zu einem mesenchymalen, spindelförmige Morphologie (1E - 1H). EMT-induzierten Zellen erschien im Vergleich zu nicht-induzierten Zellen weniger dicht in engen Kolonien verpackt. Nicht-induzierten MCF10A Proben enthielten dicht gepackten Clustern lockerer gepackten Zellen umgeben. Diese dicht gepackten Clustern waren E-Cadherin-positiven (2D) und verschwanden nach Behandlung mit der EMT Inducing Medien Supplement (2H). EMT wurde auch durch die Herunterregulierung von epithelialen Marker und Hochregulation von mesenchymalen Marker bewertet. Die Herunterregulierung von E-Cadherin-Expression ist in der Regel folgende EMT Induktion in verschiedenen Zelltypen beobachtet 3,4 Abbildung 2 zeigt die Oberflächenexpression von E-Cadherin in der Mehrzahl von unbehandelten Zellen (Fig. 2A - 2D; rot). Im Vergleich zu seiner Abwesenheit nach EMT Induktion (2E - 2H, rot). Eine Zelllinie T98G, wurde festgestellt, einen extrem niedrigen Basisniveau von E-Cadherin vor EMT Induktion, die ihre Analyse ausgeschlossen haben. Hochregulation von mesenchymalen Marker, Fibronektin, war auch nach der Induktion mit der EMT Inducing Medien Supplement (Figuren 2A - 2D gegenüber 2E - 2H, grün) sichtbar. Die Expression von E-Cadherin und Fibronectin durch Immunzytochemie gesehenwurden ferner durch Western-Blot von Gesamtzell-Lysaten (Fig. 3) bestätigt. Der Western-Blot bestätigt Herunterregulierung von E-Cadherin und Hochregulation von Fibronektin-Expression durch Immunzytochemie gesehen. Die Banden wurden mit Densitometrie und normiert auf GAPDH, um die relative Veränderung nach EMT fach Induktion bestimmen quantifiziert. E-Cadherin-Spiegel wurden 6,4 und 3,4 fach in A549 und MCF10A Zellen reduziert sind. Fibronektin-Spiegel wurden um 4,6, 4,1 und 2,3-fach in T98G, A549 und MCF10A-Zellen. Obwohl die Western-Blot keine signifikante Reduktion von E-Cadherin-Protein-Spiegel in HT29-Zellen nach Induktion EMT zeigen die immunzytochemischen Ergebnisse zeigen eine Verringerung in der Oberflächenexpression von E-Cadherin (2B gegen 2F), die nicht in unterscheiden ist Western Blot von Gesamtzell-Lysaten. Um weiter zu evaluieren EMT-Status, weitere bekannte Markers für EMT wurden analysiert, Pre-und Post-EMT-Induktion. In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen wurde E-Cadherin in allen untersuchten Zelllinien herunterreguliert, was darauf hinweist, dass EMT induziert. Darüber hinaus sind die mesenchymalen Marker Vimentin und Schnecke, wurden in A549, T98G und MCF10A Zellen nach der Behandlung mit EMT Inducing Medien Supplement (Abbildung 4) hochreguliert. Die HT29-Zelllinie hat (Daten nicht gezeigt) nicht Ausdruck dieser mesenchymalen Marker entweder mit oder ohne Induktions EMT zeigen, was darauf hindeuten kann, dass diese Zellen nutzen alternative Wege für die EMT-Induktion. Obwohl TGF-β ausreicht, um EMT in bestimmten Kontexten 7,8,9 Zelle induzieren, haben die anderen Zelltypen nicht nur reagieren auf die Zugabe von TGF-β 14. MCF7-Brustkrebszellen und PANC-1-humane Pankreas-Karzinom-Zellen sind sowohl gemeldet nicht auf TGF-β Signal allein 14 reagieren. Um festzustellen, ob die beiden Linien konnte EMT in vitr unterzieheno, wurden die Zellen in Gegenwart des EMT Induktionsmedium kultiviert Supplement. Die Zellen wurden mit rekombinantem TGF-β1 allein angeregt, bei der Konzentration im Medien EMT Inducing Ergänzung. Diese Zellen behielten ihre epitheliale Morphologie, bestehend aus dicht gepackten Kolonien von Zellen (Daten nicht gezeigt) und Oberflächen E-Cadherin-Spiegel wurden ähnlich denen in den Kontrollzellen beobachtet (Fig. 5C und 5D gegenüber den Fig. 5A und 5B). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen mit EMT-Induktionsmedium Supplement stimuliert eine drastische Abnahme der Oberflächen E-Cadherin-Ebenen (Fig. 5E und 5F). Diese Zellen erhalten auch eine mesenchymale Morphologie, wie Zellen wurde weniger kompakter und spindelförmigen (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass die hier beschriebenen Verfahren EMT induzieren kann EMT Morphologie und Markerexpression Veränderungen in Zellen typischerweise beständig gegen TGF-β-i Förderungnduced EMT. Zusätzlich zu den Veränderungen in der Marker-Ausdruck ist ein weiteres Markenzeichen von mesenchymalen Zellen ihre Fähigkeit zu wandern und zu erobern. Migration und Invasion von Zellen mit oder ohne Ergänzung EMT induzierenden Medien wurden unter Verwendung des 96-Well-Zellinvasion BME Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert kultiviert. Kurz gesagt wurden die Zellen auf 96-Well-Platten ausgesät (50000 Zellen / Vertiefung), die Filtereinsätze mit 8,0 &amp;mgr; m Poren. Nach 48 h wurde die Migration von Calcein AM-Färbung der Zellen, die durch das Filter gewandert waren, beurteilt. Jede Probe wurde dreifach zweimal mit ähnlichen Ergebnissen getestet. Repräsentative Ergebnisse eines Experiments sind in Fig. 6A gezeigt. Statistisch signifikanter Anstieg (P-Wert &lt;0,003) bei der Zellmigration wurden sowohl mit A549 und PANC-1-Zellen nach Induktion EMT gesehen. Um die Fähigkeit dieser Zellen einzudringen (dh wandern durch extrazelluläre Matrix) zu bewerten, wurde dieselbe Analysemit einer Basalmembran-Extrakt-beschichteten Filter durchgeführt. EMT-induzierten Zellen zeigten eine statistisch signifikante (p-Wert &lt;0,001) Anstieg der Invasion Fähigkeiten im Vergleich zu unbehandelten Zellen, wie in Fig. 6B zu sehen. Die robuste Induktion von EMT ist nützlich für die Analyse von Veränderungen der Genexpression und Signalisierung, die sich in diesen Zellen. Antikörper-basierte Array-Analyse unter Verwendung von Lysaten von beiden behandelten und unbehandelten Zellen ist eine Methode, um die Expressionsniveaus von einer Vielzahl von Molekülen in einer einzelnen Probe zu analysieren. Als ein Beispiel, analysierten wir die Ebenen der phosphorylierten MAPK Familienmitglieder in Lysaten aus nichtinduzierten und EMT-induzierten MCF7 und A549-Zellen unter Verwendung des Proteome Profiler Menschen Phospho-MAPK-Array-Kit. Das Array wurde zweimal aus unabhängigen EMT-Induktion Behandlungen mit ähnlichen Ergebnissen führen. Abbildung 7 zeigt repräsentative Daten von einem Array. Beide Zelltypen zeigten erhöhte Phosphorylierung von CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204) und ERK2 (T185/Y187) in EMT-induzierten Zellen im Vergleich zu Kontrollen. Unterschiede in der Signalereignisse wurden zwischen den beiden Zelltypen ebenso beobachtet. A549-Zellen zeigten einen Anstieg der GSK-3-β (S9) Phosphorylierung, während MCF7-Zellen zeigten erhöhte p70S6K (T421/S424) Phosphorylierung. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Fig. 1 ist. Mesenchymale Morphologie Induktion nach Stimulation mit dem EMT Inducing Medien Supplement (A - D). Epitheliale Morphologie in den vier Zelltypen angegeben folgenden Kultur für 5 Tage im Standard-Kulturmedien ohne die EMT Inducing Medien Supplement (E - H). Mesenchymalen Morphologie in der vier Zelltypen angegeben mit der EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> 2. Herabregulierung von epithelialen Marker-Expression und Hochregulation von mesenchymalen Marker-Expression in EMT-induzierten Zellen. Zellen wurden durch Immunfluoreszenz angefärbt, um die Expression des epithelialen Marker, E-Cadherin (rot) zu erfassen, und die mesenchymalen Marker, Fibronectin (grün). (A - D) Kontrollzellen ohne die EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert (E -. H) Zellen mit EMT-Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. Alle Zellen sind mit DAPI (blau) gegengefärbt. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Fig. 3"/> 3. Bestätigung der epithelialen und mesenchymalen Marker Ausdruck mit Western-Blot ein<html> . alysis Western-Blot von Gesamtzell-Lysaten der vier Zelltypen angegeben, mit (EMT) oder ohne behandelt (-) der EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage. Bands für E-Cadherin, Fibronektin und GAPDH Ladekontrolle sind auf der linken Seite angezeigt. Die Größenmarker ist auf der rechten Seite angegeben. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Fig. 4"/> 4. Hochregulation der mesenchymalen Marker Vimentin und Schnecke im EMT-induzierten Zellen. Zellen wurden durch mehrfarbige Immunfluoreszenz angefärbt, um die Expression des epithelialen Marker, E-Cadherin (grau) erkennen und die mesenchymalen Marker Vimentin (grün) und Schnecke (rot) . (A - C) Kontrollzellen ohne die EMT Inducing Medienzusatz für 5 Tage kultiviert. (D - F) Zellen mit EMT-Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. mmer &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> 5. Induktion der EMT in TGF-β1 nicht-ansprechenden Zellen. (A und B) Zellen, die mit Medium allein für 5 Tage kultiviert. (C und D)-Zellen in Medium, enthaltend 10 ng / ml TGF-β1 für 5 Tage kultiviert. (E und F) Zellen in EMT Inducing Medien Ergänzung für 5 Tage kultiviert. Alle Zellen sind für die E-Cadherin-Expression (rot) gefärbt und mit DAPI (blau) gegengefärbt. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Fig. 6"/> 6. EMT-induzierten Zellen Migration und Invasion Kapazitäten erhöht. A. Anzahl der Zellen, die durch eine 8 um Porenfilter nach Inkubation für 48 h migriert. B. Durchschnittliche Anzahl derZellen, die in der Lage, durch eine 8 um Porenfilter mit Basalmembran-Extrakt nach Inkubation für 48 h beschichtet waren einzudringen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung über 3 Brunnen. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Fig. 7"/> Abbildung 7. Antikörper-basierten Array-Expressionsanalyse von EMT-Induktion. Lysate aus A549 (A und C) und MCF7 (B und D) Zellen mit oder ohne EMT Inducing Medien Supplement kultiviert wurden, wurden für die Array-Analyse unter Verwendung der Proteome Profiler Menschen Phospho-MAPK-Array-Kit verwendet. Flecken markiert A und B wurden dann unter Verwendung Densitometrie quantifiziert. Vergleiche der un-induzierte EMT-induzierten Lysate werden in den entsprechenden Balken unten (C und D) gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung &lt;sehen</a>/ A&gt;.

Ein einfaches Verfahren ist für die Induktion von epithelialen mesenchymale Transition (EMT) in einer Vielzahl von Zelltypen beschrieben. Methoden zur Analyse von Zellen in EMT-Staaten durch Immunzytochemie sind enthalten.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Induktion des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs oder EMT in vitro bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst der gewünschte epitheliale Zelltyp in Gegenwart des EMT-induzierenden Mediumzusatzes ausgesät wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, drei Tage nach der initialen Aussaat das Kulturmedium durch frisches Kulturmedium zu ersetzen, das den EMT-Induzierenden-Mediumzusatz enthält.Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen fünf Tage nach der initialen Aussaat für eine nachgeschaltete Charakterisierung, beispielsweise Immunfärbung, zu gewinnen. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, dass die Zellen mesenchymale Eigenschaften durch Lichtmikroskopie, Immunzytochemie, Western-Blot-Analyse-Array oder ein anderes Analyseverfahren der Wahl annehmen. Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie TGF-beta-Stimulation oder genetischer Modifikation bestehen darin, dass diese Methode im Gegensatz zur genetischen Modifikation schnell und einfach ist und die EMT-Induktion in einer Vielzahl von Zelltypen ermöglicht, von denen einige möglicherweise allein auf TGF-beta-Stimulation nicht ansprechen.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose von Krebsmetastasen. Diese Technik ermöglicht es Forschern, gemeinsame Expressionsprofile metastatischer Zellen zu entwickeln, die in der Diagnose verwendet werden könnten. Außerdem stellt sie Zellen zur Verfügung, die für die Wirkstoffscreening verwendet werden können.Beginnen Sie damit, das Kulturmedium für die betreffenden Zellen in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius aufzuwärmen. Anschließend gewinnen Sie die Zellen mithilfe einer Dissoziationslösung, beispielsweise mit Triple E Express. Suspendieren Sie die Zellen dann in vorgewärmtem Kulturmedium in einem kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 400 ×g.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, indem Sie ihn in einen Abfallbehälter gießen, und resuspendieren Sie das Zellpellet in vorgewärmtem Kulturmedium. Zählen Sie nun die lebensfähigen Zellen und verdünnen Sie eine Probe der Zellsuspension in 0,4 %iger Trypanblaulösung. Geben Sie 10 Mikroliter der verdünnten Probe auf ein Hämozytometer und zählen Sie die lebensfähigen Zellen. Lebensfähige Zellen. Färben sich nicht blau, nachdem die Zelldichte in Ihrer Lösungsplatte bestimmt wurde. Neun- bis zehntausend Zellen pro Quadratzentimeter in vorgewärmtem Kulturmedium, das ein XEMT-induzierendes Medienzusatz enthaltend, auf Gewebekultur behandelten Platten oder Kolben kultivieren.Die kultivierten Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren und ihre Morphologie täglich mittels eines invertierten Lichtmikroskops überwachen. Drei Tage später das Medium durch frisches, vorgewärmtes Kulturmedium ersetzen, das ein XEMT-induzierendes Mediumzusatz enthielt. Fünf Tage nach der Aussaat sind die Zellen zur Analyse bereit.Die Zellmorphologie unter einem invertierten Lichtmikroskop betrachten. Die Zellen können nun für nachgeschaltete Untersuchungen fixiert oder geerntet werden. Bereiten Sie sterile Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 Millimetern für eine 24-Loch-Platte vor, indem Sie die Deckgläser in eine Petrischale mit 95 %igem Ethanol geben. Entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette aus dem Ethanol.Flammen sterilisieren jeden Deckel und übertragen ihn vorsichtig in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte. Das Handhaben der Deckgläser erfordert Sorgfalt und Übung. Anschließend werden 0,5 Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium, das ein XEMT-induzierendes Medium enthält, zugegeben, und es werden jeweils 16.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät.Züchten und versorgen Sie die Zellen nun wie zuvor beschrieben. Fünf Tage nach der Aussaat der Zellen entfernen Sie das Medium und fixieren mit 300 Mikrolitern pro Vertiefung 4 % Paraformaldehyd in 1× PBS; lassen Sie die Fixierung 20 Minuten bei Raumtemperatur andauern. Anschließend entfernen Sie das Fixativ und waschen die Zellen zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern 1× PBS pro Vertiefung.Als Nächstes inkubieren Sie die fixierten Zellen pro Vertiefung in 400 µL Blockpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem Auftragen des Blocks bereiten Sie den Primärantikörper in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration in 400 µL Blockpuffer pro Vertiefung vor. Entfernen Sie dann die Blocklösung aus den Vertiefungen und geben Sie die Antikörperlösung zu den Zellen hinzu.Inkubieren Sie die Zellen entweder drei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Falls der primäre Antikörper direkt mit einem Fluorochrom konjugiert ist, inkubieren Sie sie im Dunkeln. Entfernen Sie anschließend den primären Antikörper und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit jeweils 500 µL 1× PBS, das 0,1 % BSA enthält. Lassen Sie jeden Waschschritt fünf Minuten dauern und schützen Sie die Zellen bei Bedarf vor Licht.Falls erforderlich, inkubieren Sie die Zellen mit einem sekundären Antikörper in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration. Verdünnen Sie den Antikörper in 400 µL pro Mulde eines XPBS, das 1 % BSA enthält. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, nach einer Stunde.Waschen Sie die Zellen dreimal, genau wie nach den Waschschritten zur Entfernung des primären Antikörpers. Falls gewünscht, fügen Sie eine DPI-Gegenfärbung zu den Zellen hinzu. Spülen Sie die Deckgläser abschließend mit entionisiertem Wasser und bringen Sie sie mit der Zellseite nach unten auf Objektträgern mit Eindeckmedium auf.Auch hier ist Vorsicht beim Umgang mit den Deckgläsern geboten. Die EMT-induzierenden Kulturbedingungen stellen eine robuste Methode zur Induktion der EMT in einer Vielzahl von Zelltypen dar. Dies wurde an vier verschiedenen menschlichen Zelllinien getestet.Zellen, die mit dem EMT-induzierenden Mediumzusatz behandelt wurden, veränderten ihre klassisch epitheliale Morphologie hin zu einer mesenchymalen, spindelförmigen Morphologie. Die Doppelfärbung zur Expression von E-Cadherin und Fibronectin zeigte die Herunterregulation des epithelialen Markers E-Cadherin in Rot und die Hochregulation des mesenchymalen Markers Fibronectin in Grün. Nicht induzierte CF-10-A-Proben enthielten dicht gepackte Zellhaufen, die von lockerer angeordneten Zellen umgeben waren. Diese Haufen waren E-Cadherin-positiv, dargestellt in Rot.Die Cluster verschwanden nach der Behandlung mit dem EMT-induzierenden Mediumszusatz. Dies ging einher mit einer Zunahme der Fibronectin-Expression in grün. T 98.Es wurde festgestellt, dass G vor der EMT-Induktion einen äußerst niedrigen Grundwert an Terrin aufwies, was eine Analyse ausschloss. Mit diesem Marker zeigte sich jedoch eine signifikante Zunahme der Fibronectin-Konzentrationen nach EMT-Induktion in diesen Zellen. Die Expressionsniveaus von e adhere und Fibronectin wurden zusätzlich durch Western Blotting von Gesamtzelllysaten bestätigt.Obwohl die Westernblot-Analyse keine signifikante Reduktion der gesamten EAD-herrin-Proteinmengen in HT-29-Zellen zeigt, wurde eine Verringerung der Oberflächenexpression von terrin durch immunchemische Färbung nachgewiesen. Um den EMT-Status weiter zu bewerten, wurden mesenchymale Marker, die für die EMT charakteristisch sind – menton in grün und snail in rot – vor und nach der EMT-Induktion analysiert, was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt. Eki, hier in grau dargestellt, war in allen untersuchten Zelllinien herunterreguliert, was darauf hinweist, dass die EMT induziert wurde. Zusätzlich zeigte sich eine Hochregulation von snail in rot und menton in grün in A549-, T98G- und MCF10A-Zellen. CCF7-Human-Brustkrebszellen und PanIN-Human-Pankreaskarzinomzellen werden beide in der Literatur als nicht in der Lage beschrieben, allein durch TGF-beta-Signalgebung in die EMT einzutreten.Diese Befunde wurden mit rekombinantem TGF-beta-1 allein bestätigt. Bei der Konzentration im EMT-induzierenden Mediumzusatz behielten die Zellen ihre epitheliale Morphologie bei, und die Oberflächenlevel von E-kohärent waren vergleichbar mit denen der Kontrollzellen. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die mit dem EMT-induzierenden Mediumzusatz stimuliert wurden, eine drastische Abnahme ihrer Oberflächen-E-Cadherin-Level.Diese Zellen wiesen außerdem eine stärker mesenchymale Morphologie auf. Ein weiteres Kennzeichen mesenchymaler Zellen ist ihre Fähigkeit zur Migration und Invasion. Dies wurde mithilfe des 96-Well-BME-Zellinvasionsassays analysiert.Entsprechend den Herstelleranweisungen wurden bei beiden Zelltypen, 5 49 und pan one Zellen, signifikante Zunahmen der Zellmigration beobachtet. Nach der EMT-Induktion wurde der gleiche Assay mit einem Filter, der mit einem Basalmembran-Extrakt beschichtet war, durchgeführt, um die Invasionsfähigkeit zu testen. EMT-induzierte Zellen zeigten im Vergleich zu unbehandelten Zellen eine signifikante Steigerung der Invasionsfähigkeit.Die robuste Induktion der EMT ist nützlich für die Analyse von Genexpressionsänderungen und Signalvorgängen, die in diesen Zellen stattfinden. Ein kommerzielles, antikörperbasiertes Array unter Verwendung von Lysaten aus MCF seven- und A549-Zellen wurde verwendet, um die Spiegel phosphorylierter Mitglieder der MA-Kinase-Familie zu analysieren. Beide Zelltypen zeigten eine erhöhte Phosphorylierung von Kreb IRK1 und IRK2 in EMT-induzierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen.Die A549-Zellen zeigten ebenfalls eine Zunahme der Phosphorylierung von GSK-3β. Die Mc7-Zellen zeigten eine erhöhte Phosphorylierung von P70S6K sowie eine erhöhte Phosphorylierung von Kreb-1 und DIRK-2. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass je nach Zelltyp gewisse Variabilität in den Ergebnissen auftreten kann, nicht jedoch bei allen Zellen.Wir verwenden dieselben downstream gerichteten Signalwege zur EMT-Induktion, die zu Unterschieden in der Markerexpression zwischen Zelltypen führen. Zudem zeigen viele Marker der EMT keine strikten Ein- und Aus-Zustände und können in epithelialen Zellen basale Expressionsspiegel aufweisen. Solche Marker können eine wechselseitige Verlagerung ihrer Lokalisation beim Übergang in den mesenchymalen Zustand zeigen, nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde.Andere Methoden wie die Wirkstoff-Screening können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Verbindungen in der Lage sind, den Übergang von epithelialen zu mesenchymalen Zellen zu modulieren. Solche Verbindungen könnten bei der Behandlung von Krebs und Fibrose sehr nützlich sein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

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