Benutzung einer Zählkammer zum Zählen von Zellen

Using a Hemacytometer to Count Cells

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Using a Hemacytometer to Count Cells

2.2: Gel Purification

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10:19 min

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February 01, 2013

Overview

Bei vielen biomedizinischen Experimenten muss die Zellanzahl bekannt sein, um genaue, reproduzierbare, und statistisch-relevante Daten zu erhalten. Daher ist es für einen erfolgreichen Biowissenschaftler wichtig zu lernen wie man Zellen zählt. Der häufigste Weg um Zellen zu zählen ist mit der Zählkammer – also mit einem Instrument mit zwei laserbeschrifteten Liniennetzen, das die Zellzählung von Teilproben mit Hilfe eines Lichtmikroskops ermöglicht. Diese Daten können dann verwendet werden, um die Gesamtanzahl von Zellen in einer experimentellen Probe zu bestimmen.

Dieses Video zeigt wie man die Probenkonzentration angleicht, so dass man weder zu viele noch zu wenige Zellen zählt; wie man eine Zählkammer benutzt um eine ~10 μl Teilprobe zu zählen; wie man bestimmt welchen Quadranten des laserbeschrifteten Liniennetzes man für die Zählung benutzt; wie man die Gesamtzellzahl der experimentellen Probe berechnet, und wie man die Lebendzellzahl mit Hilfe von Trypanblau bestimmt. Außerdem erläutern wir bei welchen experimentellen Situationen eine genaue Bestimmung der Zellzahl nötig ist, einschließlich der Benutzung von automatisierten Zellzählern.

Procedure

Das Zählen von Zellen ist ein wichtiger Schritt in vielen auf Zellen basierenden Verfahren um die Zellzahl und die Lebendzellzahl zu bestimmen. Im Allgemeinen ist das Ziel des Zählens zu bestimmen wie viel einer Probe mit unbekannter Konzentration verdünnt werden soll. Das am häufigsten verwendete Laborgerät für das Zählen von Zellen ist die Zählkammer.

Die Zählkammer wurde ursprünglich entwickelt um Blutzellen zu zählen. In der Mitte der Zählkammer befinden sich zwei Kammern auf denen laserbeschriftete Liniennetzen aufgetragen sind.

Das Liniennetz besteht aus 9 Hauptquadranten. Die 4 Eckquadranten sind in 16 kleinere Quadranten unterteilt. Der mittige Quadrant ist in weitere 25 dieser kleineren Quadranten unterteilt, die wiederum in 16 Mikroquadranten unterteilt sind.

Am anderen Ende der Kammer ist ein Spalt, in welchen die zu zählende Probe pipettiert wird.

Auf jeweils beiden Seiten der Zählkammer befinden sich zwei Trägerstege, auf die das Quarzdeckglas gelegt wird, das normalerweise 0.1 mm über der Zählkammer liegt.

Da die Fläche von jedem großen Quadrant 1 mm2 beträgt, ist das Volumen das jeder Quadrant fasst 0.1 mm3, oder 1/10000 eines ml.

Bevor man anfängt zu zählen, sollte man sich einen Moment Zeit nehmen um Fusseln, Fingerabdrücke oder Wasserrückstände mit Ethanol und KimWipes von dem Deckglas und der Zählkammer zu entfernen.

Dann gibt man eine kleines bisschen Wasser auf die zwei äußeren Trägerstege, damit das Deckglas durch Oberflächenspannung festgehalten wird.

Nun sollte man die Zellsuspension langsam durch Pipettieren vermischen, um Zellklumpen zu zerstören. Dann benutzt man eine Mikropipette um ca. 10 l der Zellsuspension durch den Spalt in die Zählkammer zu pipettieren. Die Lösung wird durch die Kapillarkraft in den Zwischenraum gesaugt, woraufhin das ganze Liniennetz bedeckt sein sollte.

Während sich die Zellen absetzen, wählt man das richtige Objektiv aus. Dann legt man die Zählkammer auf den Objekttisch.

Nun schaut man sich die Zellen durch das Lichtmikroskop an. Wenn weniger als 5 Zellen in jedem der großen Quadranten vorhanden sind, sollte man die Probe nochmals zentrifugieren und das Pellet in einem kleineren Volumen resuspendieren. Wenn die Zellen übereinander liegen oder zu dicht beieinander sind um sie einfach voneinander zu unterscheiden, verdünnt man die Probe in einem größeren Volumen. Man sollte sicherstellen, dass man sich den Verdünnungsfaktor merkt, den man später für die Berechnung braucht.

Nun ist es Zeit die Zellen zu zählen.

Wie wir schon gesagt haben, ist auf die Zählkammer ein laserbeschriftetes Liniennetz aufgetragen. Die Linien der Quadranten machen es einfach sich beim Zählen zu orientieren. Man sollte die Größe des Quadranten nach der Zelldichte auswählen. Zum Beispiel zählt man bei kleinerer Zellzahl alle Zellen in einem der Eckquadranten. Für Proben mit mittlerer Zelldichte wählt man einen der 16 kleineren Quadranten zum Zählen aus. Bei sehr hoher Zelldichte sollte man die Zellen in einem der mittleren 25 Quadranten zählen. Unabhängig davon welchen Quadranten man aussucht und wie hoch die Zelldichte ist, sollte man mindestens 20-50 Zellen pro Quadrant zählen.

Nicht alle Zellen passen genau in den jeweiligen Quadranten. Man kann die Zellen zählen, welche die oberen und linken Abgrenzungslinien berühren und die Zellen ignorieren, welche die unteren und rechten Abgrenzungslinien berühren. Um die genaueste Zählung zu erhalten, benutzt man ein Zählgerät und bestimmt den Durchschnittswert von 4 Zählungen in gleich großen Quadranten.

Um die Zellzahl in 1 ml Volumen zu bestimmen, multipliziert man die Zellzahl mit 10000, weil, wie wir schon gesagt haben, jeder große Quadrant 1/10000 eines ml ist. Wenn man einen dieser großen Quadranten gezählt hat, multipliziert man die Zahl einfach mit 1. Wenn man einen der kleineren Eckquadranten gezählt hat, multipliziert man die Zahl mit 16. Wenn man alle Zellen einem der 25 mittleren Quadranten gezählt hat, multipliziert man die Nummer mit 25. Wenn man die Probe vor der Zählung verdünnt hat, muss man auch noch den Verdünnungsfaktor in die Berechnung einbeziehen.

Um die Zellzahl in 1ml der Probe zu bestimmen, müssen die 20 Zellen in dem mittleren Quadranten mit 104 und 25 multipliziert werden, was insgesamt 5×106 Zellen in 1ml der Probe ergibt.

Nun das wir die Gesamtzellzahl in 1 ml berechnet haben, müssen wir die Nummer noch mit dem Gesamtvolumen der Lösung multiplizieren. Wenn wir also beispielsweise 5×106 Zellen in einem ml haben, ist die Gesamtzellzahl 1×107 in 2 ml.

Um Pipettierfehlern, Verzählen oder eventueller ungleichmäßiger Verteilung von Zellen vorzubeugen, belädt man die andere Seite der Zählkammer und zählt die Probe ein zweites Mal.

Wenn man die Zellen unter dem Mikroskop zählt, kann man auch gleichzeitig die Lebendzellzahl der Probe bestimmen. Trypanblau, ein Lebendzellfarbstoff, wird dazu oft mit der Probe vor der Beladung der Zählkammer vermischt.

Lebende Zellen werden nicht eingefärbt, da diese sehr selektiv sind mit dem, was durch ihre Zellmembranen durchgeht. Eine tote Zelle hat keine intakte Zellmembran, wodurch das Trypanblau das Zytoplasma einfärbt.

Um die Lebendzellzahl zu bestimmen, verdünnt man eine Teilprobe der Zellsuspension mit Trypanblau. Danach pipettiert man die Probe wie eine normale Zellprobe auf. Unter Phasenkontrast erscheinen lebende Zellen hell und golden und sollten gezählt werden; Zellen die trüb, tot und blau sind zählt man nicht.

Man berechnet die Zellzahl wie zuvor, nur das man dieses Mal die Gesamtzellzahl mit dem Trypanblauverdünnungsfaktor multipliziert. Das heißt, wenn unsere ursprüngliche Beispielprobe zuerst in Trypanblau verdünnt worden wäre, müssten wir unsere Zellzahl mit der 1:10 Verdünnung multiplizieren, um eine Gesamtzahl von 1X108 zu erhalten.

Nach der Zählung sollte man nicht vergessen das Deckglas und die Zählkammer gründlich zu reinigen.

Nun das wir uns ausführlich mit dem Zählen beschäftigt haben, sprechen wir über Gründe weshalb man die Zellzahl in bestimmten Experimenten bestimmen muss.

Nachdem man Zellen von normalen oder experimentellen Geweben isoliert, ist es wichtig zu wissen wie viele Zellen man erhalten hat. Hier will ein Forscher wissen wie viele Splenozyten, oder Zellen der Milz, von der Milz einer Maus isoliert worden sind.

Wenn man Experimente macht um zu bestimmen wie zwei verschiedenen Zellpopulationen reagieren, ist es wichtig zu wissen wie viele Zellen man zusammen mischt, zum Beispiel in dieser Kultur von B und T Zellen.

Für bestimmte auf Zellen basierende Verfahren muss man wissen wie viele Zellen vorhanden sind. Hier wird ein ELISPOT Verfahren benutzt um zu bestimmen wie viele Zellen in einer Probe IFN sekretieren, also ein entzündungsförderndes Protein welches bei einer Infektion mit humanen Papillomviren sekretiert wird.

Wenn man ein Experiment macht bei dem RNA von Zellen extrahiert wird, ist es wichtig zu wissen wie viele Zellen man hat, um eine ausreichende Menge an mRNA in dem Experiment zu erhalten.

Die Zählkammer ist ein relativ billiges und relativ leicht zu benutzendes Instrument für die Zellzählung. Es kann allerdings lange dauern und man kann Fehler machen.

Der Scepter automatische Zellzähler im Pipettenformat ist, wie der Name schon sagt, ein Zählgerät das eine höhere Zählgenauigkeit als die Zählkammer ermöglicht, und das sowohl die Größe als auch das Volumen von Zellen in einer Probe bestimmen kann.

Der TC10 automatische Zellzähler kann sowohl die Zellzahl, als auch die Lebendzellzahl bestimmen, und errechnet automatisch die Zellzahl in der Probe. Außerdem kann man die Zellen auf einem Bildschirm anzuschauen.

Das war die Einführung in die Zellzählung von JoVE. In diesem Video haben wir wiederholt was eine Zählkammer ist, wie man Zellen zählt und wie man die Lebendzellzahl bestimmt. Außerdem haben wir verschiedene Gründe erläutert wieso man Zellen zählen muss. Danke für eure Aufmerksamkeit und denkt daran nicht die blauen Zellen zu zählen!

Transcript

Cell counting is an important step in many cell-based assays for determining cell number and viability. In general, the goal of counting is to understand how much a sample of an unknown cell concentration should be diluted for further use. The most common laboratory tool for counting cells is the hemacytometer.

The hemacytometer is a counting tool that was originally created for counting blood cells. At the center of the hemacytometer are two counting chambers, upon which a laser etched grid can be found.

The grid is made up of 9 major quadrants. The four corner quadrants are further divided into 16 smaller quadrants. The central quadrant is divided into 25 of these smaller quadrants, each of which is yet further divided into 16 micro-quadrants.

At the far end of each chamber are sample introduction ports, into which the cell sample to be counted is dispensed.

On either side of the counting chambers are the cover slip mounting supports, upon which the quartz coverslip rests, usually about 0.1 mm above the counting chamber.

Since the area of each large square is 1 mm2, the volume contained by each large square is 0.1 mm3 or 1/10,000th of a ml.

Before counting, always take a moment to use ethanol and a kimwipe to clean and dry away any lint, fingerprints, or watermarks from the coverslip and the counting chamber.

Then carefully add a small amount of water to each of the coverslip mounting supports, the surface tension of the water will hold the coverslip in place.

Now gently triturate the cell suspension, or pipette it up and down, to dislodge any cell clumps. Use a micropipette to aspirate about 10 μl of the suspension and then load one of the introduction ports with the sample. The solution will be drawn into the counting chamber by capillary action and should cover the entire grid.

While the cells are settling, select the objective. Then load the hemacytometer onto the stage.

Next view the cells under the microscope. If there are fewer than 5 cells in each of the large quadrants, you may need to spin your sample down again and resuspend the pellet in a smaller volume. If the cells are overlapping each other or are simply too dense to easily distinguish from one another, you may need to dilute your sample in a higher volume of solution. Be sure to keep track of the factor with which you are diluting your cells. You will need it in a later calculation.

Now it’s time to count the cells!

As we talked about earlier, the counting chamber is covered in a laser-etched grid. The lines of the quadrants make it easier to keep track of the cells you are counting. Choose the size quadrant for counting depending on the density of the cells in your sample. For example, if there are a low number of cells, count all the cells in one of the corner quadrants. For samples with a medium amount of cells, choose one of the 16 smaller quadrants. If there is a very high density of cells, count the cells in one of the 25 central quadrants. No matter which quadrant you choose or the density of the cell sample, count at least 20-50 cells per quandrant.

Not all of the cells will fall neatly within the quadrants. You can count the cells that touch the top and left lines, but disregard the ones touching the bottom or right ones. To get the most accurate count, use a cell counter to keep track of the cells and take the average of the number of cells in 4 quadrants of the same size.

To calculate the number of cells in a 1 ml volume, multiply the number of cells counted by 10,000, because, as we mentioned before, each large square on the grid is 1/10,000th of a ml. If you counted one of these larger quadrants, simply multiply this number 1. If you counted one of the smaller squares in one of the corner quadrants, multiply this number by 16. If you counted all of the cells in one of the 25 central quadrants, multiply this number by 25. If you happened to dilute your cell suspension before loading the hemacyotmeter, you will also need to multiply by the dilution factor.

Then, to calculate the number of cells in 1 ml of this sample, we would multiply the 20 cells in this central quadrant by 104 and 25 to get a total of 5 x 106 cells in 1 ml of the sample.

Now that we know the total number of cells in 1 ml of the sample, we need to multiply this number by the total volume of our solution. So for example, if we have 5 x 106 cells in 1 ml, then in 2 ml, we will have a total of 1 x 107 cells.

Then, to avoid errors from miscounting, uneven distribution of cells, or pipetting errors, load the other side of the chamber and count your cell sample a second time.

Counting the cells under the microscope is also a great time to evaluate the viability of the cells in your sample. Trypan blue, a vital stain, is often mixed with the sample prior to being loaded into the hemacytometer for this purpose.

Live cells exclude this dye, because living cells are very selective about what they allow through their membranes. A dead cell, however, does not have an intact membrane, which allows the trypan blue to pass through and stain the cytoplasm.

To check the viability of your cell sample, dilute an aliquot of your cell suspension in trypan blue, and then load the trypan blue stained sample just like the regular cell sample. Under the phase contrast, the live cells will appear bright and golden and should be counted; do not count any of the dull, dead, blue cells.

Calculate the number of cells as before, this time multiplying the final number by the trypan blue dilution factor. So if our original representative sample had first been diluted in trypan blue, we then would have multiplied our total number of cells by our 1:10 trypan blue dilution, for a total of 1×108 cells in our sample.

When you’re finished counting, remember to clean the coverslip and counting chamber!

Now that you are a cell counting pro, let’s talk about some of the reasons you might need to know how many cells you have in a particular experiment.

After isolating cells from a normal or experimental tissue, it’s important to know how many cells you’ve recovered. Here the investigators will want to know how many splenocytes, or spleen cells, they have isolated from this mouse spleen.

When you are performing an experiment to see how two different cell populations react, it’s important to know how many of each cell type you are mixing together, like in this co-culture experiment with B and T cells.

You will want to know how many cells you have for many other types of cell-based assays. Here an ELISPOT assay is being set up to determine the number of cells in a sample that will secrete IFNγ, an inflammatory protein, in response to the human papilloma virus.

When performing an experiment in which mRNA needs to be extracted, or isolated, from your cells of interest, it’s important to know how many calls you’re starting with, in order to acquire a sufficient amount of mRNA for the experiment.

The hemacytometer is an inexpensive and relatively easy to use tool for counting cells, but it can be tedious and has the potential for human error.

The Scepter Handheld Automatic Counter is, as the name implies, a hand held counting device that has an improved counting accuracy compared to the hemacytometer and that can discriminate both the size and volume of the cells in a cell sample.

The TC10 automated cell counter evaluates both cell number and viability, automatically calculates the total cell number in your sample, and allows the cells to be viewed on its readout screen as well.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cell counting. In this video we reviewed: what a hemacytometer is, how to count cells and determine cell viability, and some different reasons you may need to count cells. Thanks for watching and remember not to count the blue cells!

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