Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, oocytenähnliche Zellen aus somatischen, aus der Haut stammenden Stammzellen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem saubere und undifferenzierte Stammzellen verwendet werden, die aus der Haut neugeborener Mäuse gewonnen wurden. Im zweiten Schritt werden die Stammzellen dissoziiert, wodurch sie für die Differenzierung vorbereitet werden.

Anschließend werden die Stammzellen in ein definiertes Differenzierungsmedium ausplattiert. Um die Bildung von Keimzellen zu induzieren, werden Ergebnisse erzielt, die mittels semiquantitativer Echtzeit-PCR die Expression oozytenspezifischer Marker zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Reproduktionsbiologie zu beantworten.

Da eine geschlossene Umgebung zur Untersuchung der Keimzellen, der eSight-Bildung und -Entwicklung bereitgestellt wird, sollten alle für das Protokoll benötigten Medien zwei bis drei Stunden vor der Verwendung vorbereitet und mit gelöstem Verschluss in den Zellkulturtrockenschrank gestellt werden, in dem das Experiment durchgeführt wird. Die beiden hier verwendeten Medien sind das Stammzellmedium, bestehend aus D-M-A-M-F 12, ergänzt mit B 27, BFGF und EGF, sowie das Keimzellen-Differenzierungsmedium, bestehend aus M1 99, ergänzt mit FSH, LH, B-S-A-I-T-S, Natriumpyruvat, Tuin und EGF. Stammzellen, isoliert aus neugeborenen Mäusen.

Welpen werden für die in vitro Keimzeldifferenzierung im zweiten bis vierten Durchgang verwendet. Da die Effizienz der Bildung zellähnlicher Zellen oder OLCs direkt mit der Qualität der Ausgangsstammzellen zusammenhängt, sollte die Differenzierung beginnen, sobald die Population sauber und gesund erscheint, was in der Regel um den zweiten Durchgang herum der Fall ist. 48 Stunden vor der Einleitung der Differenzierung subkultivieren Sie die Stammzellen mithilfe einer serologischen Pipette, entfernen Sie alle suspendierten sphärischen Zellaggregate und das verbrauchte Medium aus der Kulturschale und geben Sie diese in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Es ist wichtig, ausschließlich die suspendierten sphärischen Zellaggregate und nicht die Zellen zu sammeln, die am Boden der Schale haften und sich spontan differenzieren.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 µL frischem Stammzellmedium. Erwärmen Sie auf 37 °C. Pipettieren Sie die Aggregate vorsichtig, um die Zellen teilweise zu dissociieren.

Pipettieren Sie die Zellen nicht aggressiv, da dies die Zellviabilität verringern würde. Waschen Sie die teilweise dissoziierten Zellen in 9,5 Milliliter frischem, vorgewärmtem Stammzellmedium auf einer Low-Attachment-Zellkulturschale mit 10 Zentimeter Durchmesser. Stellen Sie die Zellen für 48 Stunden in einen Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 zurück.

Um mit dem Differenzierungsverfahren für OLC zu beginnen, entfernen Sie mithilfe einer serologischen Pipette die Stammzellen aus der Kulturschale und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie alle anhaftenden Zellen zurück. Pelletieren Sie die Zellen bei 500 × g für fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 µL steriler PBS. Pipettieren Sie die Zellen energisch mit einer Weitlumen-Pipettenspitze für 1000 µL zu Klumpen, die nicht größer als 10 bis 20 Zellen sind.

Für den Erfolg dieses Protokolls ist es entscheidend, regelmäßig den Dissoziierungsgrad zu überprüfen, um während der Dissoziation den richtigen Grad zu gewährleisten. Entnehmen Sie periodisch eine kleine Menge der Zellen und kontrollieren Sie unter einem Mikroskop mit weißem Licht, ob die aggregierten Zellen in Klumpen von 10 bis 20 einzelnen Zellen vorliegen. Überdissoziieren Sie die Zellen nicht, da dies zu einer verminderten Zellviabilität führt.

Fügen Sie anschließend 9,5 Milliliter PBS zu den dissoziierten Zellen hinzu und überführen Sie 15 Mikroliter dieser Zellsuspension in ein Hämozytometer zur Zellzählung. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für fünf Minuten. Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspendieren Sie die Zellen in Differenzierungsmedium auf eine Konzentration von 1,32 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.

Pipettieren Sie die Zellen, indem Sie 500 Mikroliter pro Vertiefung in eine flache 24-Loch-Suspensionskulturschale geben. Stellen Sie die 24-Loch-Schale 48 Stunden lang in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach 48 Stunden entfernen Sie 250 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung und überführen sie in ein entsprechend beschriftetes 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie 250 µL frisches Differenzierungsmedium zu jedem Brunnen hinzu, zentrifugieren Sie das verbrauchte Medium bei 500 ×g für fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie alle pelletierten Zellen in 50 µL frischem Differenzierungsmedium. Geben Sie die Zellsuspension in das entsprechende Kulturbrüschchen der Differenzierungsplatte zurück. Wechseln Sie alle 48 Stunden bis zum Tag 12 der Differenzierung jeweils die Hälfte des Mediums auf die gleiche Weise aus.

Während der frühen Differenzierungsphase heften sich die Zellen am Boden der Kulturschale an und breiten sich aus. Dieses repräsentative Bild zeigt Zellen 42 bis 72 Stunden nach Beginn der Differenzierung, die positiv für OCT vier sind. Ein Marker für undifferenzierte Stammzellen ist in grün dargestellt; die Kerne sind mit Hirst kontrastgefärbt und blau markiert.

Während die Differenzierung fortschreitet, sind Zellaggregate zu erkennen, die OCT4-positive Zellen in grün markiert aufweisen, umgeben von OCT4-negativen Zellen. Die Maßstabsleiste für dieses Bild beträgt 100 Mikrometer. Diese Abbildung zeigt ein Bild im weißen Licht einer follikelähnlichen Struktur nach Ablösung von der Kulturoberfläche; die Maßstabsleiste entspricht 40 Mikrometern.

Bei fortgesetzter Kultivierung wächst der LCS und erreicht einen Durchmesser von etwa 45 Mikrometern. Die Maßstabsleiste in diesem Bild entspricht 10 Mikrometern. Große OCT4-positive LCS sind entweder von Zellen umgeben oder einzeln in der Kultur sichtbar.

Diese LCS können mithilfe von Trägerzellen oder Trypsinaugen gesammelt werden, um LCS ohne angeheftete andere Zellen zu erhalten. Um zu bestätigen, dass die LCS ähnliche Transkripte wie natürliche OO-Standorte exprimieren, wurden die LCS gesammelt und auf die Expression gemeinsamer OO-Standort-Marker wie Z-P-C-S-C-P drei CMOs, T vier BMP 15 und Vasa getestet. Diese Abbildung zeigt die Transkriptmengen dieser Marker in 10 LCS im Vergleich zu 10 Neugeborenen-Maus-Zyten.

Die Ergebnisse zeigen, dass die LCS weniger ZPC exprimieren als Cytes. Da ZPC eine Komponente der zyten-spezifischen Zona-lucida-Membranstruktur ist, könnte dies die fragile Beschaffenheit und die dünnere Zita-Membran der LCS erklären. Die Expression des Meiose-SCP3 ist in den LCS im Vergleich zu natürlichen Cytes höher.

Jedoch wird ein anderer Meiose-Marker, CMOs, auf einem niedrigeren Niveau exprimiert. Diese Diskrepanz in den Expressionsniveaus könnte teilweise das gegenwärtige Versagen von LCS, die Meiose abzuschließen, erklären. Andere Marker wie BMP 15 und Vasa unterscheiden sich zwischen lcs- und O-Standorten nicht signifikant.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Gesundheit der ursprünglichen Stammzellpopulation entscheidend für dessen Erfolg ist.