Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Krafterzeugung während einer maximalen Kontraktion von Zebrafisch, Larve und Rumpfmuskulatur zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Nahtschlaufen hergestellt werden, die verwendet werden, um die Larven während der Kraftmessungen an Ort und Stelle zu halten. Anschließend werden die betäubten Larven in der Versuchskammer positioniert.

Einmal an Ort und Stelle, wird die Kraft während einer maximalen Twitch-Kontraktion aufgezeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, die Abmessungen der Rumpfmuskulatur zu messen, so dass die Spitzenkraft auf die Muskelquerschnittsfläche normalisiert werden kann. Letztendlich wird die Messung der Krafterzeugung während der Kontraktion verwendet, um Veränderungen der Muskelfunktion und der allgemeinen Muskelgesundheit aufzuzeigen.

Obwohl wir diese Methode an Wildtyp-Zebrafischlarven demonstrieren, kann sie auch mit gentechnisch veränderten Larven oder mit Larven angewendet werden, die mit Medikamenten oder Giftstoffen behandelt wurden. Die Methode kann dann zur Charakterisierung von Muskelkrankheitsmodellen und zur Bewertung von Behandlungen oder zur Untersuchung von Muskelentwicklung, Verletzungen oder chemischer Toxizität verwendet werden. Der erste Schritt besteht darin, die Nahtschlaufen vorzubereiten, mit denen die Larven an Ort und Stelle gehalten werden.

Verwenden Sie während der Kraftprüfung eine Pinzette, um das unsterile Nahtmaterial in drei Stränge zu trennen. Sobald du dich getrennt hast, beginnst du damit, einen doppelten Überhandknoten in einen der Stränge zu binden, aber höre auf, bevor du den Knoten vollständig festziehst, um eine kleine Schlaufe zu machen. Anstatt die Schlaufe zu beenden, verwenden Sie eine Schere, um überschüssiges Naht von den Schwänzen zu schneiden.

Lege die Schlaufe für die spätere Verwendung auf die Haftnotiz einer Haftnotiz. Machen Sie zwei Nahtschlaufen für jede Larve, die getestet werden soll. Stellen Sie zunächst die Prüfapparatur auf den Tisch eines Stereomikroskops.

Schließen Sie anschließend die Kabel des Kraftaufnehmers und des Längenreglers an das Prüfgerät an. Schalten Sie den Kraftaufnehmer und den Längenregler ein und legen Sie den Schalter an der Vorderseite des Längenreglers um. Dadurch wird das Längenreglerrohr mit einem Einwegtransfer überbrückt. Pipette.

Füllen Sie die Versuchskammer mit Testlösung. Nehmen Sie mit einer Pinzette eine Nahtschlaufe an einem der Schwänze als Greif auf. Die Schlaufe an dem gekrümmten Teil kann die Naht knicken und dazu führen, dass sie in den nachfolgenden Schritten reißt.

Hängen Sie eine Schlaufe an das Kraftaufnehmerrohr und eine andere an den Längenregler Mit einer Einweg-Transferpipette übertragen Sie eine Zebrafischlarve in eine kleine Petrischale, die mit Testlösung gefüllt ist. Sobald das Anästhetikum gewirkt hat, stupsen Sie den Schwanz vorsichtig an, um sicherzustellen, dass es an Berührung mangelt, die das Schwimmen hervorruft. Anschließend werden die Larven mit einer Glaspipette mit einer Pinzette in die Versuchskammer überführt.

Führen Sie den vorderen Teil der Larve vorsichtig durch die Nahtschlaufe am Kraftaufnehmerrohr und fassen Sie dabei beide Enden der Nahtschlaufe. Ziehen Sie gleichzeitig daran, um die Schlaufe hinter dem Eichensack oder der Schwimmblase mit einer Pinzette festzuziehen. Halten Sie einen Nahtschwanz fest und ziehen Sie, wodurch sich die Larven um 90 Grad um den Schlauch drehen, bis die Seitenseite der Larve nach oben zeigt.

Bewegen Sie das Längenreglerrohr mit der an dem Längenregler angebrachten X-, Y-, Z-Positioniervorrichtung entlang der x-Achse und unter dem Rüssel und Schwanz der Larven. Zwischen den Enden des Längenreglerrohrs und des Kraftaufnehmerrohrs ist Platz zu lassen. Führen Sie anschließend die Nahtschlaufe über den Schwanz der Larven und ziehen Sie die Nahtschlaufe fest.

Wie bereits gezeigt, müssen Sie möglicherweise den hinteren Teil der Larven so schwenken, dass die Seitenseite nach oben zeigt. Sobald sie an Ort und Stelle sind, schneiden Sie die Enden der Nahtschlaufe ab. Verwenden Sie die Positionierungsvorrichtungen XY, Z, um die Röhren langsam abzusenken, bis sie gerade noch den Boden der Kammer berühren.

Heben Sie dann die Larven in einem angemessenen Abstand zum Kammerboden an. Dies sollte innerhalb des Arbeitsabstands eines später verwendeten inversen Mikroskopobjektivs liegen. Stellen Sie abschließend das Längenreglerrohr so ein, dass die Längsachse der Larve mit der Längsachse des Kraftaufnehmerrohrs ausgerichtet ist.

Bewegen Sie das Prüfgerät zunächst auf den Tisch eines inversen Mikroskops. Schließen Sie anschließend das Wasserbad, das Umwälzthermometer und den Temperaturregler an das Prüfgerät an. Schalten Sie die erforderlichen Komponenten ein und stellen Sie die Einstellung am Temperaturregler auf den gewünschten Wert ein.

Verbinden Sie die Kabel vom Stimulator mit dem Prüfgerät. Schalten Sie den Stimulator ein, aber stimulieren Sie die Larven zu diesem Zeitpunkt nicht. Um zu überprüfen, ob die Larven parallel zum Kammerboden stehen, betrachten Sie den Teil der Larven zwischen den Enden der Röhren.

Wenn parallel, werden bei Bedarf beide Enden der Larven scharf gestellt. Stellen Sie das Kraftaufnehmerrohr so ein, dass beide Enden scharf sind und die Larve parallel ist. Schalten Sie das Video-Sarkomerlängensystem ein und drehen Sie die Videokamera so, dass die Streifen parallel zu den Seiten des Videobildes verlaufen.

Der Streifenabstand wird als Indikator für die Sarkomerlänge verwendet. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es auf die peripheren Fasern fokussiert ist, und notieren Sie sich die angegebene Sarkomerlänge. Passen Sie bei Bedarf den Längenregler an, um die Larven zu kürzen, bis die Sarkomerlänge nicht optimal ist, um die Zuckenkraft zu optimieren.

Stellen Sie zuerst den Ausgangsstrom am Stimulator auf eine niedrige Stärke ein und programmieren Sie dann eine spezielle Software, um Stromimpulse zu liefern. 0,2 Millisekunden Dauer. Geben Sie den ersten Impuls ab und verwenden Sie das Oszilloskop, um die Spitzenzuckenkraft zu messen.

Erhöhen Sie den Strom in Schritten von 50 Milliampere und messen Sie die Spitzenzuckenkraft bei jedem neuen Strompegel. Warten Sie 30 Sekunden zwischen den Zuckungen, um Ermüdung zu vermeiden, wenn der Reizstrom zunimmt. Die maximale Zuckenkraft steigt in der Regel auf ein Maximum an und verringert dann allmählich den Strom, mit dem die Larve erzeugt.

Die größte Kraft ist der optimale Reizstrom, sobald er identifiziert ist, stellen Sie die Stromamplitude auf den optimalen Reizstrom ein und passen Sie die Länge der Larven an, um eine maximale Zuckenkraft hervorzurufen. Zum Schluss entlocken Sie ein Zucken der Larvenmuskulatur. Verwenden Sie das Oszilloskop, um die Kraftreaktion aufzuzeichnen und die Aufzeichnung für eine spätere Analyse zu speichern.

Um die Abmessungen der Muskulatur zu messen, stellen Sie das Prüfgerät wieder auf das Stereomikroskop zurück. Messen Sie mit der IP-Skala die Höhe der Muskulatur in der Seitenansicht. Nehmen Sie die Messungen an einem anatomischen Orientierungspunkt vor.

Zum Beispiel die hier rot markierte Urogenitalöffnung. Achten Sie dann darauf, die Länge der Larven nicht zu verändern. Schwenken Sie die Larven mit den Fadenschlaufenenden um 90 Grad, um die Larven von unten zu betrachten.

Messen Sie die Breite der Muskulatur von unten gesehen. Abschließend werden die Nahtschlaufen mit einer Mikroklinge durchtrennt, um die Larven von den Testgeräten zu befreien. Bei gesunden Wildtyp-Zebrafischlarven sollten die Muskelfasern parallel zueinander sein, ohne große Lücken zwischen ihnen und mit Anzeichen von Streifen, Wildtyp-Zebrafischlarven, die diese Merkmale nicht aufweisen oder offensichtliche Schäden aufweisen, wie z. B. abgelöste Fasern, wie hier zu sehen, hier entsorgt werden. Die maximale Zuckungskraft in Abhängigkeit vom Reizstrom ist für eine einzelne Zebrafischlarve aufgetragen.

Der optimale Reizstrom liegt typischerweise zwischen 400 und 600 Milliampere. Hier ist eine repräsentative Kraftreaktion dargestellt, die während einer maximalen Twitch-Kontraktion einer einzelnen Larve gesammelt wurde. Hier. Die Spitzenkraftwerte von Wildtyp-Larven unterschiedlichen Alters liegen im Bereich von 0,9 bis 1,7.

Millinewtons mit älteren Larven, die mehr Kraft erzeugen als jüngere Larven. Ältere Larven erzeugen mehr Kraft als jüngere Larven, selbst wenn die Spitzenkräfte auf die Querschnittsmuskelfläche normalisiert sind. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Nahtschlaufen so festzuziehen, dass die Larven nicht leicht um den Kraftaufnehmer und die Längenreglerschläuche herumschwenken können.

Sind die Nahtschlaufen zu locker, wird die von der Larve erzeugte Kraft nicht vollständig auf den Kraftaufnehmer übertragen und die maximale Zuckenkraft wird unterschätzt.