Name: Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Immunfluoreszenzfärbung der neonatalen Mäuseretina zur Untersuchung der Angiogenese. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung der Gefäßplexus und hilft Forschern, Mechanismen der Gefäßentwicklung zu verstehen.

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Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust und der British Heart Foundation.

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. 1. Enukleation und Fixierung der Augen Postnatale <ol><li> Zeigen human getötet Maus Welpe auf seiner Seite, entfernen Sie die Haut über dem Auge mit einer Schere. </li><li> Mit einer Schere und Pinzette, um das Auge entkernen. </li><li> Platz Schere unter dem entkernten Auge, schneiden Sie den Sehnerv und das umgebende Gewebe und heben Sie die Augen. In einen 24-Well-Platte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 2x PBS bei Raumtemperatur durchgeführt. </li><li> Lassen Sie jedes Auge für 10 fix - 15 min, dann kalt 2x PBS auf Eis übertragen für 5 - 10 min. Am besten ist es Enukleationen und anschließende Fixierung staffeln, um sicherzustellen, der Grad der Fixierung ist gleich für jedes Auge. </li></ol> 2. Dissektion Postnatale Murine Retinas <ol><li> Transfer-Augen in eine Petrischale mit 2x PBS mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung und unter einer disse erweiternfesselndes Mikroskop. </li><li> Entfernen Sie das Fett um die Augen mit einer Pinzette und Schere. </li><li> Pierce der Rand der Hornhaut mit einer scharfen Schere und schneiden rund um die Hornhaut und Iris und entsorgen. </li><li> Legen Zange zwischen Netzhaut und Lederhaut und entfernen Sie die Lederhaut kümmert sich nicht um die Netzhaut zu reißen. Die Aderhaut Schicht kann auch entfernt werden, aber, wenn es die Gefahr einer Schädigung der Netzhaut, die während dieser Stufe wird die Aderhaut kann wie es sich nicht signifikant auf die Qualität der Immunfärbung gelassen werden. </li><li> Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette. </li><li> Entfernen Sie die hyaloids Schiffe durch das Sammeln von ihnen zusammen in der Mitte des Auges mit feinen Pinzette dann schnell ziehen weg von der Mitte der Netzhaut (alternativ snip an der Basis der hyaloid Schiffe mit einer feinen Schere). </li><li> Spülen Sie die schalenförmigen Netzhaut mit PBS in einer sauberen Petrischale. </li><li> Stellen 4 bis 5 radiale Einschnitte erreicht etwa 2/3 des Radius der Netzhaut durch Federkraft scissors zur Schaffung eines &quot;Blütenblatt&quot; Form. </li><li> Abziehen PBS mit einer Pasteurpipette auf die Netzhaut zu glätten, und dann entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück Löschpapier. </li><li> Langsam Pipette Kälte (-20 ° C) Methanol tropfenweise auf die Oberfläche der Netzhaut bis völlig bedeckt und dann mit zusätzlichen Flut Methanol. Dies wird dazu beitragen, um die Netzhaut zu fixieren und Permeabilisierung erleichtern. Die Netzhaut wird weiß. </li><li> Transfer zu einem 2-ml-Röhrchen mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung zu erweitern. </li><li> Lassen Netzhaut in kaltem Methanol für mindestens 20 min, bevor Sie mit Immunfärbung. Von den Antikörpern verwendet hier nur VE-Cadherin nicht erfolgreich auf Methanol festen Netzhaut verwendet werden. In diesem Fall Netzhaut müssen gerade gehen Immunfärbung nach Schritt 9. </li><li> Falls erforderlich, kann Netzhaut in Methanol bei -20 ° C gelagert werden für bis zu mehrere Monate vor dem Färben. </li></ol> 3. Immuno / isolectin Färbung des Retinal Vascuschaftsgesetzgeber <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig / Methanol abgießen und vorsichtig abspülen Netzhaut kurz in PBS (in diesem Stadium die Netzhaut ist immer noch in der gleichen 2-ml-Röhrchen aus Schritt 11 oben). </li><li> PBS entfernen und Deckel Netzhaut mit 100 ul Perm / Blocks-Lösung (PBS + 0,3% + 0,2% Triton BSA) + 5% des entsprechenden Serums (siehe Tabelle 1) und leicht schütteln für 1 Stunde. </li><li> Entfernen Perm / Sperren und Inkubation Netzhaut unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 ° C mit 100 ul ausgewählten Primärantikörper (siehe Tabelle 1) und / oder IsolectinB4, alle durch Verdünnen in Perm / Blocks vorbereitet. </li><li> Entfernen Antikörper / isolectin und waschen Netzhaut 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTX). </li><li> In einigen Fällen, z. B. nach einer Färbung mit IsolectinB4-Alexa488 oder einem direkt konjugierten primären Antikörper, einen sekundären Antikörper, nicht erforderlich, und Netzhaut kann direkt angebracht werden (Schritt 7). Bei einem nicht konjugierten primären Antikörper in Schritt 3 verwendet wurde, dann wurden 100 ul der entsprechenden fluorescent sekundären Antikörper (verdünnt 1/200 in PBSTX) zugegeben und links nach Inkubation bei 4 ° C oder für 4 h bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Entfernen sekundären Antikörper und waschen Netzhaut 4 x 15 min in 2 ml PBSTX. </li><li> Übertragen Netzhaut auf Objektträger mit einem breiten Bohrung Kunststoff Pasteurpipette und entfernen Sie überschüssiges PBSTX mit saugfähigen Gewebe. Berg Netzhaut durch Zugabe von 50 ul verlängern Deckfluessigkeit auf einem Deckglas und sanft Position über die Netzhaut. </li><li> Die Objektträger zu Kühlschrank über Nacht bei 4 ° C, so dass sie flach und vor Licht geschützt sind, damit das Verlängern Deckfluessigkeit eingestellt. </li><li> Bild Netzhaut mit einem konfokalen Mikroskop oder eine Epifluoreszenzmikroskop. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die hier vorgestellte Methode bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, Bilder von gefärbten whole mount Präparaten von Neugeborenen Maus Netzhaut zu erhalten, so dass es eine leicht quantifizierbar und physiologisch relevanten Modell der Angiogenese. Zunächst wird die Maus Auge kann es ziemlich schwierig zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe und Kugelform, so dass einige der Praxis und gute Dissektion Werkzeuge für zuverlässige Ergebnisse erforderlich sind. Präparation der Augen in 2x Konzentration PBS herg...

Die Angiogenese ist ein komplexer Entwicklungsprozess durch die Bildung neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert und ist durch mehrere Signalwege reguliert. Der prominenteste von ihnen ist der VEGF-Weg. VEGF wird von ischämischen Zellen und führt zur Einleitung der Angiogenese sprießen in benachbarte Blutgefäße freigesetzt. Die führende Endothelzellen aus einer neuen vaskulären Spross ist eine &quot;Spitze&quot; Zelle, die filopodia dass erreichen, in Richtung der Quelle von VEGF erzeugt und wird durch proliferierende &quot;Stiel&quot; Endothelzellen gefolgt. Auf diese Weise aktivierten Endothelzellen migrieren und proliferieren zu einer avaskuläre Region, wo sie neue Gefäßrohren bilden. Um diese Rohre zu stabilisieren, um den Blutfluss zu unterstützen, interagieren Endothelzellen mit Perizyten und glatte Muskelzellen, die die neuen Blutgefäße 1 umgeben. Angiogenese ist für die Vaskularisierung des Embryos und wachsende Gewebe. Allerdings trägt es auch zu vielen pathologischencal Erkrankungen wie Krebs, während Mängel in der Angiogenese mit ischämischen Erkrankungen. Die Entwicklung effektiver medikamentöser Behandlung, die Angiogenese als Mittel zur Behandlung von Krankheiten zu regulieren ist daher von großem Interesse. Zum Beispiel wird eine wirksame anti-angiogenen Faktoren reduzieren Krebswachstum, während proangiogene Strategien verwendet werden, um Ischämie zu behandeln. Somit sind Modelle der Angiogenese wichtig, ein besseres Verständnis der Regulation der Gefäßneubildung und für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu erhöhen oder zu verringern vaskulären Wachstum. Ein grundlegendes Element der Angiogenese Forschung ist die Wahl eines geeigneten Gefäß-Modell. Viele in vitro Modelle wurden entwickelt, um die grundlegenden Schritte der Angiogenese wie endotheliale Zellmigration, Proliferation und das Überleben 2,3 reproduzieren. Ein häufig in vitro-Assay verwendet wird, ist die Bildung eines verzweigten Netzes von Endothelzellen auf Matrigel Matrix, obwohl tsein ist nicht spezifisch für Endothelzellen, noch übernimmt sie in der Regel übernehmen die Unterstützung von Perizyten oder glatten Muskelzellen. Beurteilung der ex vivo Keimung Angiogenese mit Maus Orgelkultur wie Embryoidkörper Assay, der Aortenring-Assay und der fötalen Mittelfußknochen Assay erlaubt die Analyse von Angiogenese von Endothelzellen im Zusammenhang mit zusätzlichen Stützzellen. Allerdings sind die wichtigsten Einschränkungen dieser Assays die mangelnde Durchblutung und die Regression von Gefäßen im Laufe der Zeit, so dass eine begrenzte Fenster für die Analyse. Deshalb, um die Regulation der Angiogenese genauer zu verstehen, werden in-vivo-Modelle, wie sie in der Maus mit subkutan implantierten Schwämmen oder Matrigel Stecker entwickelt erforderlich, sowie die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell. Allerdings sind diese Modelle schwierig zu analysieren aufgrund der komplexen 3D-Architektur der neovessels. Im Gegensatz dazu hat der Zebrafisch ein ausgezeichnetes Modell für die Visualisierung der Angiogenese in der ganzen bewährt4 Organismus. Allerdings ist die Maus evolutionär sehr viel enger als die menschliche Zebrafisch verwandt, um die Maus ein bevorzugtes Modell in vielen Fällen. Folglich Angiogenese der postnatalen Maus Netzhaut stellt eine gut charakterisierte Methode der Wahl für die Angiogenese Forschung. Sie ermöglicht nicht nur eine physiologische Umgebung, sondern auch ein 2D Gefäßplexus, die leicht sichtbar gemacht werden können unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen. Die Architektur des Schiffes Netzwerk Endothelproliferation, sprießen, perivaskuläre Zellrekrutierung und Gefäß Umbau kann allen untersuchten mit dieser Technik werden. In der Neugeborenen-Maus Netzhaut tritt Entwicklung der Blutgefäße der Netzhaut in der ersten Woche der postnatalen Leben. Mäuse, im Gegensatz zum Menschen, der blind geboren werden und die Netzhaut nur vascularized werden nach der Geburt. Retinal Schiffe ergeben sich aus der Mitte der Netzhaut in der Nähe des Sehnervs bei postnatalen Tag 0 (P0) und die Entwicklung von Angiogenese zur Bildung eines sehr anzuordnen,d Gefäßplexus, die Netzhautperipherie erreicht um etwa 5 P8. Blutgefäßen entwickeln in charakteristischer Weise mit der Kapillarplexus allmählich und ausgehend von der optischen Platte in Richtung der Peripherie ein regelmäßiges alternierendes Muster von Arterien und Venen mit einem dazwischen kapillares Netzwerk zu erzeugen. Das retinale Gefäßsystem ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese als die Gefäße leicht identifiziert werden, da sie, was im Wesentlichen in einer 2D-Ebene wachsen zu untersuchen, wodurch es relativ einfach, die retinalen Gefäße in flach-mount Zubereitungen 5 untersuchen. Verfahren zur Isolierung der Maus Neugeborenen Netzhaut zur Analyse der endothelialen Zell-Antworten Spitze über mehrere Stunden ex vivo wurde 6 gemeldet. Alternativ erfordert eine genauere Untersuchung des gesamten Gefäßsystems der Netzhaut und damit verbundene vaskuläre Marker Immunfärbung von festen Proben Netzhaut in verschiedenen Stadien der Entwicklung. Hier bieten wir Ihneneine detaillierte Beschreibung eines zuverlässigen und technisch geradlinig Methode, die wir verwenden für whole mount Färbung des murinen retinalen vaskulären Plexus, von der ersten Enukleation der postnatalen Auge (siehe auch 7) durch die Färbeprotokolle zur endgültigen Bildgebung unter dem Mikroskop.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Pipetten aus Kunststoff 3 ml</td><td>Wissenschaftliches Laborzubehör</td><td>PIP4210</td><td>Spitze mit einer Schere entfernen, um eine</td></tr><tr><td>BD Falcon 24-Well-Platten</td> zu erstellen <td>Wissenschaftliches Laborzubehör</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>ausgewählte Petrischalen TV 90 mm</td><td>Wissenschaftliches Laborzubehör</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Histobond-Objektträger</td><td>VWR</td><td>631-0624</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 22 x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #5</td><td>World Präzisionsinstrumente</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Federschere 10,5 cm lang, mit geraden 8 mm Klingen</td><td>World Präzisionsinstrumente</td><td>501235</td><td>Für die Enukleation</td></tr> verwendet <tr><td>Vannas Schere 8,5 cm lang, mit geraden 7 mm Klingen und 0,025 x 0,015 mm superfeinen Spitzen</td><td>World precision instruments</td><td>500086</td><td>Wird zum Präzieren der Netzhaut</td></tr><tr><td>verwendet Superfeine Vannas-Schere 8 cm lang mit geraden 3 mm Klingen und 0,015 x 0,015 mm superfeinen Spitzen World precision instruments</td><td></td><td>501778</td><td>Wird zum Präparieren von</td></tr><tr><td>kristallklaren&#8217; Röhren der Netzhaut verwendet 2 ml</td><td>Starlab</td><td>E1420-2000<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Reagenzien</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches</td><td></td><td>Sigma S0876</td><td>PBS-Reagenz</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS-Reagenz</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>PBS-Reagenz</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>In 2x PBS auffüllen und bei -20 &#176 lagern; C</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7638</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Anti-Fade-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Eindeckreagenz</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4-alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Verwendung bei 1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4-alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td>Anwendung bei 1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td colspan="4">Primary Antibodies</td></tr><tr><td>Anti-NG2 (Kaninchen polyklonal )</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>Weist Perizyten</td></tr><tr><td>Anti-GFAP (Klon GA5, Maus monoklonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB360</td><td>Weist Astrozyten</td></tr><tr><td>Anti-Desmin (Klon Y66, Kaninchen monoklonal)</td><td>Millipore</td><td>04-585</td><td>Erkennt Perizyten</td></tr><tr><td>Anti-Collagen IV (Kaninchen polyklonal )</td><td>Chemicon</td><td>AB756P</td><td>Erkennt vaskuläre Basalmembran</td></tr><tr><td>Anti-Alpha Aktin-Cy3 (Klon 1A4, Maus monoklonal)</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Erkennt vaskuläre glatte Muskelzellen.</td></tr><tr><td>Anti-Endoglin (Klon MJ7/18, monoklonal bei Ratten)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550546</td><td>Nachweis von Endothelzellen</td></tr><tr><td>Anti-CD31 (Klon MEC13.3, monoklonal bei Ratte)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Nachweis von Endothelzellen</td></tr><tr><td>Anti-VE-Cadherin (Klon 11D4.1, monoklonal bei Ratte)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550548</td><td>Nachweis von Endothelzellverbindungen</td></tr><tr><td>Anti-Alk1 (polyklonal bei Ziegen)</td><td>R& D Systems</td><td>AF770</td><td>Erkennt Endothelzellen</td></tr><tr><td colspan="4">Sekundäre Antikörper</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 &#176;C gelagert.</td></tr><tr><td>Anti-Ratten-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 &#176;C gelagert.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Ratten-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td>Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 &#176;C gelagert.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 &#176;C gelagert.</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Ziegen-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11058</td><td>Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 &#176;C gelagert.</td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskope</td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam HRc</td><td>Kamera für Dissektionsmikroskop</td></tr><tr><td>Epifluoreszierendes Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axioimager mit Apotome</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam HRm</td><td>Kamera für Axioimager</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td></td></tr></tbody></table>

ganze berge immunfluoreszenzfärbung der neonatal maus retina zu untersuchen angiogenese<em&gt; in vivo</em

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenese ist der komplexe Prozess der Bildung neuer Blutgefäße durch die Sprossen neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert. Angiogenese spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der normalen Entwicklung von Organen und Geweben, sondern auch in vielen Krankheiten, bei denen die Bildung von Blutgefäßen ist dysregulated, wie Krebs, Blindheit und ischämischen Erkrankungen. Im Erwachsenenalter sind die Blutgefäße in der Regel Ruhestrom so Angiogenese ist ein wichtiges Ziel für neuartige Medikamentenentwicklung zu versuchen und zu regulieren Gefäßneubildung gezielt in Krankheit. Um besser zu verstehen, Angiogenese und geeignete Strategien zu regulieren entwickeln werden Modelle benötigt, die genau die verschiedenen biologischen Schritte, die beteiligt sind. Die Maus Neugeborenen Netzhaut bietet ein hervorragendes Modell der Angiogenese, weil Arterien, Venen und Kapillaren zu entwickeln, um eine Gefäßplexus während der ersten Woche nach der Geburt bilden. Dieses Modell hat auch den Vorteil, dass ein zwei-didimensionale (2D)-Struktur-Analyse machen einfach im Vergleich mit der komplexen 3D-Anatomie der anderen vaskulären Netzwerken. Durch die Analyse der retinalen Gefäßplexus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt, ist es möglich, die verschiedenen Phasen der Angiogenese unter dem Mikroskop zu beobachten. Dieser Artikel beschreibt eine einfaches Verfahren zur Analyse des Gefäßsystems einer Maus Netzhaut unter Verwendung von fluoreszierenden Färbung mit isolectin und vaskuläre spezifische Antikörper.

Nach Präparation der Netzhaut sollte wie eine flache Blume (Abbildung 1) zu suchen. Durch die Verwendung des Protokolls skizzierten können Endothelzellen gesehen mit isolectin B4-Alexa488 Färbung und Unterstützung vaskulären Muskelzellen visualisiert mit anti-alpha Glattmuskelaktin (Abbildung 2). Die Low-Power-Ansicht mit einem 5X Ziel in 2 ermöglicht einen Überblick über das vaskuläre Organisation der Netzhaut. Auch indem Sie eine andere Kombination von Antikörpern in ...

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine erlaubt<em&gt; In vivo</em&gt; Kontext. Immunfluoreszenzfärbung genau visualisieren die Gefäßplexus ist entscheidend für den Erfolg dieser Art von Studien.

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Angiogenese in der Netzhaut der neugeborenen Maus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Augen von neugeborenen Mäusen entnommen werden, anschließend ein Fixansatz im dritten Schritt die postnatale Mausretina vorsichtig in eine blütenblattähnliche Form disseziert wird und der letzte Schritt in der Färbung des retinalen Gefäßsystems besteht. Letztendlich wird die Visualisierung des Gefäßsystems der Mausretina durch fluoreszenzmarkierte Färbung und konfokale Mikroskopie ermöglicht.Demonstriert wird dieses Verfahren von Dr. Simon Tlo, einem Postdoktoranden in meinem Labor, und Kathleen Allenson, einer ehemaligen Mitarbeiterin meines Labors. Während des gesamten Verfahrens ist die Standardtemperatur Raumtemperatur. Beginnen Sie damit, ein human getötetes Mäusejunges mit einer Schere auf die Seite zu legen.Entfernen Sie die Haut, die das Auge bedeckt. Schneiden Sie anschließend mit der Schere unterhalb des Auges den Sehnerv und das umgebende Gewebe durch und heben Sie das Auge heraus. Überführen Sie das enukleierte Auge in eine 24-Well-Platte, die Fixierflüssigkeit enthält, bestehend aus 4 % PFA in zweifacher Me

whole-mount-immunofluorescent-staining-neonatal-mouse-retina-to

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine Methode für die Einbeziehung von Plasmid-DNA in murinen Zellen der Netzhaut zum Zwecke der Durchführung entweder gewinnen oder Verlust der Funktion...

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

Quelle: Wang, Z., et al. Transpupilläre Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus.  J. Vis. Exp. (2021). Dieses Video zeigt eine Technik für die in vivo Netzhautbildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Anästhesierte Mäuse werden auf die Bildgebung vorbereitet, indem sie ihren Kopf sichern, Augenschmiermittel auftragen und ein Deckglas über das Auge legen. Retinale Ganglienzellen (RGCs), die fluoreszierende Proteine exprimieren, werden zunächst mittels Epifluoreszenz zur...

Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Quelle: Bosco, A., et al.  In vivo Dynamik der retinalen Mikrogliaaktivierung während der Neurodegeneration: Konfokale ophthalmoskopische Bildgebung und Zellmorphometrie beim Mausglaukom. J. Vis. Exp. (2015) Dieses Video zeigt die In-vivo-Bildgebung von retinalen Mikroglia in einem Mausmodell des Glaukoms. Eine transgene Maus mit fluoreszierenden Protein-exprimierenden retinalen Mikroglia wird unter einem Ophthalmoskop positioniert. Infrarotbeleuchtung wird verwendet, um den Sehnervenkopf (ONH)...

In vivo Bildgebung von retinalen Mikroglia in einem Mausmodell des Glaukoms

Humanen Cytomegalovirus (HCMV)-Infektion des Neugeborenen stellt eine wichtige Ursache für geistige Behinderung, aber die molekularen Ereignisse, die zum Virus-induzierten Pathogenese sind noch weitgehend unverstanden. Um die Dynamik der Infektion des Gehirns zu untersuchen, passten wir...

Verwenden Sie von<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging zur Überwachung der Progression of Experimental Maus Cytomegalovirus-Infektion bei Neugeborenen

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Hier präsentieren wir das Maus-Laser-induzierte choroidale Neovaskularisation (CNV) Protokoll, ein experimentelles Modell, das die vaskulären Kennzeichen der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) nachbildet. Einmal gemeistert, kann es zuverlässig und effektiv CNV als Modellsystem induzieren, um verschiedene experimentelle Maßnahmen zu testen.

Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung und Immunfluoreszenzfärbung von Netzhaut-Flachhalterungen und Analysen von Mäusen. Auch die Verwendung der Fluoresceinfundusangiographie (FFA) bei Mäusewelpen und die Bildverarbeitung werden ausführlich beschrieben.

Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

Dieser Artikel beschreibt einen gut etablierten und reproduzierbaren Lektin-Färbungsassay für die gesamten Netzhautpräparate und die Protokolle, die für die quantitative Messung von Gefäßparametern erforderlich sind, die bei proliferativen und nicht-proliferativen Retinopathien häufig verändert sind.

Quantifizierung vaskulärer Parameter in der gesamten Netzhaut von Mäusen mit nicht-proliferativen und proliferativen Retinopathien

Das retinale Gefäßsystem der Maus ist besonders interessant, um die Mechanismen der Gefäßmusterbildung zu verstehen. Dieses Protokoll misst automatisch den Durchmesser von Netzhautgefäßen der Maus aus fluoreszierenden Angiographie-Fundusbildern in einem festen Abstand zur Sehscheibe.

Messung des retinalen Gefäßdurchmessers aus Fluoreszenzangiographie-Bildern der Maus

Die Perizyten in retinalen Gefäßen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptoren β nach retroorbitaler Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin untersucht. Die markierte Netzhaut wurde weiter mit der Gewebereinigungsmethode behandelt und als Ganzes montiert, um die dreidimensionalen Ansichten der Perizyten, die das retinale Gefäßsystem umgeben, unter einem konfokalen Mikroskop zu visualisieren.

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung 

Erfahren Sie die Immunfluoreszenzfärbung der neonatalen Mäuseretina zur Untersuchung der Angiogenese. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung der Gefäßplexus und hilft Forschern, Mechanismen der Gefäßentwicklung zu verstehen.

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese

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