Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese In vivo
9. Juli 2013
Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine erlaubt In vivo Kontext. Immunfluoreszenzfärbung genau visualisieren die Gefäßplexus ist entscheidend für den Erfolg dieser Art von Studien.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Angiogenese in der Netzhaut der neonatalen Maus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zuerst die postnatalen Augen entkernt und dann ein Fixiermittel aufgetragen wird. Der dritte Schritt besteht darin, die postnatale Netzhaut vorsichtig in eine Blütenblattform zu zerlegen, und der letzte Schritt besteht darin, das retinale Gefäßsystem zu färben. Letztendlich wird die Visualisierung der Netzhautgefäße der Maus durch Fluoreszenzfärbung und konfokale Mikroskopie erreicht.
Dieses Verfahren wird von Dr. Simon Tlo, einem Postdoktoranden in meinem Labor, und Kathleen Allenson, einem früheren Mitglied meines Labors, demonstriert. Während dieses Verfahrens ist die Standardtemperatur Raumtemperatur. Beginnen Sie damit, einen auf humane Weise getöteten Mäusewelpen mit einer Schere auf die Seite zu legen.
Entfernen Sie die Haut, die das Auge bedeckt. Schneiden Sie dann mit der Schere unter dem Auge den Sehnerv und das umgebende Gewebe ab und heben Sie das Auge heraus. Übertragen Sie das enukleierte Auge auf eine 24-Well-Platte mit Fixiermittel, das zweimal 4 % PFA enthält.
PBS fährt mit dem Präparieren des nächsten Auges fort, während man sich im Fixiermittel befindet. Die Staffelung zwischen den beiden Augendissektionen beträgt eine halbe Minute. Mit Übung.
Lassen Sie jedes Auge 10 bis 15 Minuten lang fixieren. Dann werden sie zweimal PBS für mindestens fünf bis 10 Minuten auf Eis kalt gestellt. Bevor Sie die Netzhaut isolieren, sammeln Sie so viele Augen wie gewünscht in das PBS, indem Sie eine Weidepipette aus Kunststoff verwenden, die geschnitten wurde, um den Eber zu verbreitern.
Übertragen Sie die Augen unter einem Präpariermikroskop in eine Petrischale, die zwei Mal PBS enthält. Entfernen Sie das Fett um das Auge herum mit einer Pinzette und einer Schere. Durchstechen Sie den Rand der Hornhaut mit einer scharfen Schere und schneiden Sie um die Hornhaut und Iris herum, entsorgen Sie dieses Gewebe.
Führen Sie als nächstes die Pinzette zwischen Netzhaut und Sklera ein. Entfernen Sie die Sklera und achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu zerreißen. Die Aderhautschicht kann ebenfalls entfernt werden, solange keine Gefahr besteht, dass die Netzhaut geschädigt wird.
Das Belassen der Aderhautschicht sollte die Qualität der Immunfärbung nicht wesentlich beeinträchtigen. Entfernen Sie nun mit einer Pinzette die Linse und den Glaskörper. Anschließend die aloiden Gefäße entfernen.
Sammeln Sie sie mit einer feinen Pinzette in der Mitte des Auges. Ziehen Sie sie dann schnell von der Mitte der Netzhaut weg. Seien Sie besonders vorsichtig, um alle gelben Distel zu entfernen, denn wenn Sie welche zurücklassen, können sie Ihre Standergebnisse verdecken.
Die becherförmige Netzhaut sollte nun in eine saubere Petrischale übertragen und mit PBS sauber gespült werden. Nun in die Netzhaut. Mache vier bis fünf radiale Schnitte, die etwa zwei Drittel des Weges zur Mitte hinreichen.
Verwenden Sie eine Federschere, um diese pedalförmige Netzhaut zu erstellen. Dieser Schritt erfordert Geduld und Übung, um ihn zu perfektionieren. Entnehmen Sie nun den größten Teil des PBS mit einer Weidepipette.
Dadurch wird die Netzhaut abgeflacht. Entfernen Sie dann überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück saugfähigem Papier. Tragen Sie anschließend minus 20 Grad Methanol Tropfen für Tropfen auf die Oberfläche der Netzhaut auf, bis sie größtenteils untergetaucht ist, und fügen Sie dann großzügig Methanol hinzu.
Die Netzhaut wird weiß. Dieser Schritt hilft, die Netzhaut zu fixieren und erleichtert die Permeation. Übertragen Sie die Netzhäute im kalten Methanol in ein kleines Röhrchen.
Mit einer Kunststoffpipette mit breitem Durchgang. Lassen Sie sie bei Bedarf mindestens 20 Minuten im kalten Methanol inkubieren, die Netzhäute können mehrere Monate bei minus 20 Grad im Methanol verbleiben. Die Antikörper werden nur hier verwendet.
Der Cine kann nicht erfolgreich auf der fixierten Netzhaut der Mutter verwendet werden. In diesem Fall muss die Netzhaut direkt mit der Immunfärbung fortfahren, nachdem sie in eine Blütenblattform abgeflacht wurde. Beginnen Sie damit, das Methanol vorsichtig von den Netzhäuten abzupipettieren.
Spülen Sie die Netzhäute dann schnell und sanft in einem Mal PBS ab. Entfernen Sie das PBS und bedecken Sie die Netzhaut mit 100 Mikrolitern Dauerwellenblocklösung mit 5% des entsprechenden Serums. Stellen Sie die Netzhaut so ein, dass sie eine Stunde lang leicht schüttelt.
Entfernen Sie die Perm-Blocklösung mit einer Pipette und ersetzen Sie sie durch 100 Mikroliter Perm-Blocklösung, die den primären Antikörper oder das zuvor ausgewählte Antikörper enthält. Stellen Sie dann die Netzhaut so ein, dass sie über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert und am nächsten Morgen geschaukelt wird. Waschen Sie die Netzhaut viermal 10 Minuten lang pro Waschgang in PBS TX.
Wenden Sie während aller Waschschritte ein sanftes Schaukeln an. Wenn der Primärantikörper nicht konjugiert ist, fügen Sie 100 Mikroliter des entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörpers hinzu, verdünnt auf 200 in PBS tx. Inkubieren Sie die Netzhaut über Nacht bei vier Grad Celsius oder vier Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren, um den Sekundärantikörper zu entfernen.
Waschen Sie die Netzhaut viermal in PBS TX mit leichtem Schaukeln für 15 Minuten pro Waschgang. Fahren Sie nun mit der Montage fort. Übertragen Sie die Netzhaut mit einer Kunststoffpipette mit breiter Öffnung auf Objektträger und entfernen Sie überschüssiges P-B-S-T-X mit einem Taschentuch.
Montieren Sie dann die Netzhäute in 50 Mikroliter verlängertes Gold und decken Sie die Lösung vorsichtig mit einem Deckglas ab. Um das längere Aushärten des Goldes zu ermöglichen, kühlen Sie die Dias über Nacht bei vier Grad Celsius, am Folgetag lichtgeschützt. Fahren Sie mit der Bildgebung der Netzhaut nach der Dissektion fort.
Die Netzhaut sollte mit ISO selectin B four Alexa 4 88 wie eine flache Blume aussehen. Die Endothelzellen wurden angefärbt und erscheinen grün. Unterstützende vaskuläre Muskelzellen wurden mit Antifa glatte Muskulatur sichtbar gemacht, Aktin in der Low-Power-Ansicht mit einem Fünffach-Objektiv ermöglichte einen Überblick über die Gefäßorganisation der Netzhaut unter Verwendung einer anderen Kombination von Antikörpern.
Endothelzellen können mit Hilfe einer Anti-CD-31-Immunfärbung beobachtet werden, wobei Parasiten mit einem Antikörper gegen NG zwei sichtbar gemacht wurden. Alternativ wurden die unterstützenden Parasiten mit Anti-Desmin gefärbt. Die Anti-Desmin-Färbung visualisiert die fingerartigen Prozesse der Parasiten und hilft festzustellen, ob sie eng mit den Endothelzellen verbunden sind.
Im Gegensatz dazu umreißt die Anti-NG-Färbung die Zellkerne jedes Parasiten, was bei der Quantifizierung der Anzahl der Parasitenzellen im Gefäßsystem nützlich ist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Netzhautoberfläche nicht mit Ihren Sezierwerkzeugen zu berühren und zu beschädigen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die BD-Färbung durchgeführt werden, um die Proliferation bestimmter Zellen zu untersuchen.
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Überblick
Dieses Verfahren untersucht die Angiogenese in der neonatalen Mausretina, einem gut charakterisierten Modell zur Untersuchung der vaskulären Entwicklung. Es umfasst eine sorgfältige Dissektion und Färbung des retinalen Gefäßsystems zur Visualisierung der Angiogenese in vivo.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Angiogenese
- Retinale Entwicklung
Hintergrund
- Die neonatale murine Retina ist ein etabliertes Modell für Angiogenese-Studien.
- Das Verständnis der Rollen von Genen und Medikamenten bei der Angiogenese ist entscheidend für die therapeutische Entwicklung.
- Die Immunfluoreszenz-Färbung ist wesentlich für die Visualisierung des Gefäßplexus.
- Dieses Modell ermöglicht In-vivo-Untersuchungen der vaskulären Modulation.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Mechanismen der Angiogenese in der neonatalen Mausretina.
- Visualisierung der retinalen Vaskulatur mittels Fluoreszenz-Färbetechniken.
- Demonstration des Verfahrens für zukünftige Forschungsanwendungen.
Verwendete Methoden
- Nukleierung postnataler Augen von Mausjungtieren.
- Anwenden eines Fixativs zur Erhaltung der Gewebestruktur.
- Dissektion der Retina in eine Blütenblattform für optimale Färbung.
- Verwendung der konfokalen Mikroskopie zur Visualisierung des gefärbten Gefäßsystems.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung des retinalen Gefäßplexus.
- Demonstration des angiogenesen Prozesses in einer kontrollierten Umgebung.
- Einblicke in die Modulation der Angiogenese durch verschiedene Faktoren.
- Etablierung einer zuverlässigen Methode für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Die neonatale Mausretina dient als effektives Modell für die Angiogeneseforschung.
- Fluoreszierende Färbung und konfokale Mikroskopie sind für die Visualisierung vaskulärer Strukturen unerlässlich.
- Dieses Verfahren kann dazu beitragen, die genetischen und pharmakologischen Einflüsse auf die Angiogenese zu verstehen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
The neonatal mouse retina model enables mechanistic interrogation of angiogenic pathways critical for target validation in vascular disease research. Fluorescent staining of vascular structures provides quantitative, reproducible readouts that support preclinical de-risking of anti-angiogenic candidates. This approach bridges discovery biology with translational decision-making by visualizing vascular plexus formation in a disease-relevant, 2D-confined system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of angiogenic targets through direct visualization of endothelial and perivascular cell dynamics.
- Operational Value: Standardized whole-mount preparation supports consistent vascular plexus quantification across experimental conditions.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological modulation to vascular sprouting phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent isolectin and antibody staining generates standardized, multiplexable readouts for vascular density and branching analysis.
- Quantitative Output: Confocal imaging enables morphometric quantification of vascular plexus parameters essential for hit validation.
- Scalability: Whole-mount format allows parallel processing of multiple retinas for dose-response or time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathological angiogenesis relevant to ischemic retinopathy and tumor vascularization.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit validation to preclinical efficacy testing in vascular modulation studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of vascular readouts with downstream functional outcomes such as perfusion or leakage.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing angiogenic phenotype data that informs target selection and lead optimization prior to in vivo efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic regulators through direct visualization of vascular network formation.
- Screening: Generates standardized, imaging-based vascular metrics for compound effect assessment in angiogenesis-focused assays.
- Analytics: Delivers quantitative vascular parameters (density, branch points, vessel area) that enable inter-group comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects mechanistic angiogenesis data to preclinical models of vascular disease through conserved molecular pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis-inducing or -suppressing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, visual evidence of vascular modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissection, staining, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data that predicts later-stage efficacy in angiogenesis-dependent models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of angiogenic targets based on functional vascular outcomes in a physiologically relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal tissue dissection and whole-mount preparation to preserve retinal integrity.
- Dependent on confocal microscopy and fluorescent imaging infrastructure for high-resolution vascular visualization.
- Necessitates standardization of staining protocols and antibody validation across users and sites.
- Adaptation to alternative models may require optimization of dissociation and staining conditions due to retinal-specific architecture.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential antibody penetration challenges in thicker preparations.
