Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine
1. September 2013
Intravitalmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Abbildung verschiedener biologischer Prozesse in lebenden Tieren ermöglicht. In diesem Artikel stellen wir eine detaillierte Methode zur Abbildung der Dynamik der subzellulären Strukturen, wie den sekretorischen Granula, in den Speicheldrüsen von lebenden Mäusen.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, subzelluläre Strukturen in murinen Speicheldrüsen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem die Speicheldrüsen zunächst chirurgisch, ohne sie zu beschädigen, freigelegt werden. Im zweiten Schritt wird das anästhetisierte Tier auf dem Mikroskoptisch fixiert.
Anschließend werden die Speicheldrüsen sorgfältig positioniert, um ihre Funktion im letzten Schritt nicht zu beeinträchtigen. Die Maus wird mit einer speziellen Halterung stabilisiert, um Bewegungsartefakte aufgrund des Herzschlags oder der Atmung des Tieres zu minimieren. Letztendlich können die Dynamiken der subzellulären Strukturen mittels intravitalem Mikroskopieren abgebildet werden.
Vor der Anästhesie wiegen Sie die Mäuse, um die korrekte Dosis des Anästhetikums zu bestimmen. Anschließend induzieren Sie die Präanästhesie durch Inhalation von Isofluran. Sobald die Tiere bewusstlos sind, überprüfen Sie die Sedierung alle 15 Minuten mittels Zehenzwicktest und halten die Mäuse während der gesamten Dauer des Eingriffs unter einer Wärmelampe.
Überwachen Sie die Körpertemperatur der Tiere mit einem rektalen Proben-Thermometer. Rasieren Sie nun den Nacken der Maus mit einem elektrischen Haarschneider und wischen Sie anschließend die ventrale Seite des Nackens mit einem mit Ethanol getränkten Gazetupfer ab, wobei Sie den überschüssigen Alkohol mit einem Kim-Tuch abtrocknen. Heben Sie danach mit einem Paar stumpfer, gekrümmter Pinzette ein kleines Hautstück am unteren Ende der Musculus-masseter-Seite an und führen Sie einen kleinen Schnitt durch.
Führen Sie die Schere in den Einschnitt ein, wobei die Spitzen nach oben zur Unterseite der Haut zeigen, und öffnen Sie die Klingen mehrmals, bis sich die Haut vom darunterliegenden Gewebe gelöst hat. Beginnen Sie dann in der Nähe der Basis der Speicheldrüsen, wo der Nervenkanal und die Blutgefäße die Drüse mit dem übrigen Körper verbinden. Schneiden Sie mit der Schere einen drei Millimeter breiten und zehn Millimeter langen Streifen der gelockerten Haut ab.
Nach der Reinigung des Wundbereichs weist die resultierende Öffnung eine ovale Form auf und misst ungefähr acht mal zwölf Millimeter. Beide Speicheldrüsen sind sichtbar. Verwenden Sie eine Spritze, um optisches Kopplungsgel in die Mitte des Schnitts aufzutragen, und wischen Sie das Gel anschließend mit frischen Stücken steriler Gaze nach außen, bis das gesamte Blut und lose Haare entfernt sind.
Verwenden Sie nun eine Pinzette der Größe sieben, um die Spitze der rechten Speicheldrüse zu finden, und greifen Sie das Bindegewebe einige Millimeter oberhalb der Drüse. Reißen Sie anschließend das Bindegewebe um die Drüse herum, ohne das Parenchym zu verletzen. Sobald die Drüse freigelegt ist, trennen Sie vorsichtig das Bindegewebe von der Drüse und spülen Sie eventuelle Blutungen mit Kochsalzlösung weg.
Stellen Sie sicher, dass alle Bindegewebe getrennt sind und die Drüse vollständig freigelegt ist. Bevor das Tier zum Mikroskop gebracht wird, legen Sie ein dickes Stück Mullbinde und eine Wärmeflasche auf den Mikroskoptisch, wobei die Oberseite der Wärmeflasche ebenfalls mit einem dünnen Stück Mullbinde bedeckt wird. Legen Sie einen Deckgläser über die Mitte des Objekttisches.
Positionieren Sie dann die Maus auf ihrer rechten Seite auf dem Mulltuch und sichern Sie das Tier mit einem Stück Klebeband an der ventralen Seite der rechten Vorderpfote sowie mit einer Seidennaht, die um die Schneidezähne gehakt ist. Erzeugen Sie eine leichte Spannung zwischen der Naht und der Pfote und befestigen Sie beide am Objektträger. Mit weiterem Klebeband sollte die Speicheldrüse natürlich aufliegen.
In der Mitte des Deckgläschens. Verwenden Sie Kunststoffkeile, die an den Mikroskoptisch gekoppelt sind, um den Kopf und den Thorax der Maus weiter zu stabilisieren. Legen Sie anschließend ein kleines Stück Linsenreinigungspapier über die Drüse.
Dehnen Sie die Drüse leicht und legen Sie einen maßgeschneiderten Halter über die Drüse. Befestigen Sie dann den Stabilisator mit einer Metallklemme und Klebeband fest am Objekttisch. Bedecken Sie das Tier mit Mull und einer Wärmeauflage und überwachen Sie die Temperatur der exponierten Drüse mit einem flexiblen, thermisch gekoppelten Sonden-Thermometer. Unmittelbar nach der Stabilisierung des Tieres verwenden Sie Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung, um auf die Oberfläche der Drüse zu fokussieren.
Beurteilen Sie den Blutfluss in den Kapillaren und die Gesamtmorphologie des Gewebes. Um das GFP-Gen anzuregen, verwenden Sie einen 488 Nanometer Laser. Stellen Sie die Spitzenleistung auf 0,5 Milliwatt ein, um eine Photobleiche des Tandem-Tomato-Proteins zu vermeiden.
Verwenden Sie einen 561 Nanometer Laser und stellen Sie die Spitzenleistung auf einen Milliwatt ein. Bewerten Sie nun die Stabilität des Gewebes, indem Sie den ausgewählten Bereich vorab scannen. Falls die Präparation nicht stabil ist, passen Sie das Tier entsprechend an, um die geeignete Fokusebene zu finden.
Im Vormodus. Bewegen Sie das Objektiv allmählich in Richtung der Deckglasabdeckung, bis die Sekretionsgranula, die Sekretionsstrukturen und die Plasmamembran deutlich sichtbar werden. Verwenden Sie anschließend eine Scan-Geschwindigkeit von 0,5 bis zwei Sekunden pro Bild und eine Auflösung von 256 mal 256 Pixeln mit einer räumlichen Skalierung von 0,2 Mikrometer pro Pixel, um die Dynamik der Sekretionsgranula abzubilden.
Um die Granula und die Plasmamembran optimal darzustellen, stellen Sie die optische Dicke zwischen 0,9 und 1,2 Mikrometer ein. Nehmen Sie anschließend ein Bild des Sichtfelds auf, das als Referenzpunkt verwendet werden soll. Schließlich induzieren Sie die Exozytose durch subkutane Injektion von 0,1 Milligramm pro Kilogramm frisch zubereiteten Isoproterenol in Kochsalzlösung.
Ein Minute nach der Injektion. Die Fusion der sekretorischen Granula mit der Plasmamembran wird durch eine Zunahme der GFP-Fluoreszenz um die Granula herum und die Diffusion des tandem-Tomato-Peptids in ihre Begrenzungsmembranen nachgewiesen. In der GFPM-Tomato-Maus erscheinen die Azinuszellen als deutlich unterscheidbare Strukturen, die zytosolisches GFP und membranzielgerichtetes tandem-Tomato-Peptid exprimieren, wie durch die gestrichelten Linien angezeigt.
In einzelnen asininen Aser-Zellen werden diese durch das Tandem-Tomato-Peptid abgegrenzt, wie durch die Pfeile angezeigt. GFP wird ebenfalls in den Kernen nachgewiesen, die deutlich innerhalb der Aser-Zellen sichtbar sind. Zytosolisches GFP, das durch den Pfeil angezeigt wird, ist von den Sekretgranula ausgeschlossen, die als dunkle, kreisförmige Vesikel mit einem Durchmesser von etwa 1 bis 1,5 Mikrometern erscheinen.
Um exozytotische Ereignisse zu visualisieren, wird ein repräsentativer Bereich der Plasmamembran gezeigt, der – wie durch den Stern angegeben – angereichert an Sekretgranula ist, nach Injektion von Isoproterenol. Eine Zunahme der GFP-Fluoreszenzintensität, markiert durch grüne Pfeile, ist um einige der Sekretgranula herum erkennbar, die sich in unmittelbarer Nähe zur Plasmamembran befinden. Zusätzlich diffundiert das Tandem-Tomato-Peptid nach Fusion mit der Plasmamembran in die Begrenzungsmembranen der Sekretgranula ein, wie durch die roten Pfeile hervorgehoben.
Nach 30 bis 40 Sekunden kollabieren die Sekretgranula allmählich, und ihre Begrenzungsmembranen werden in die apikale Plasmamembran integriert. Die hier vorgestellte Methode stellt einen bedeutenden Durchbruch in der Zellbiologie dar, da sie die Abbildung der Dynamik eines spezifischen Membrantransportprozesses in lebenden Mäusen ermöglicht.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine detaillierte Methode zur Visualisierung subzellulärer Strukturen in murinen Speicheldrüsen mittels intravitale Mikroskopie vorgestellt. Das Verfahren umfasst die chirurgische Exposition der Drüsen, die Immobilisierung des Tieres und eine sorgfältige Positionierung, um Bewegungsartefakte zu minimieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Intravitale Mikroskopie ermöglicht die Echtzeit-Bildgebung biologischer Prozesse.
- Sie ist besonders nützlich zur Untersuchung dynamischer zellulärer Strukturen.
- Speicheldrüsen dienen als Modell zur Beobachtung subzellulärer Dynamiken.
- Das Verständnis dieser Dynamiken kann Einblicke in verschiedene physiologische Prozesse liefern.
Zweck der Studie
- Die Dynamik subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen sichtbar machen.
- Eine zuverlässige Methode zur Abbildung von Sekretgranula entwickeln.
- Das Verständnis zellulärer Funktionen in Speicheldrüsen verbessern.
Verwendete Methoden
- Chirurgische Exposition der Speicheldrüsen ohne Schädigung.
- Immobilisierung des anästhesierten Tieres auf dem Mikroskopständer.
- Sorgfältige Positionierung der Speicheldrüsen zur Erhaltung der Funktion.
- Verwendung einer speziellen Halterung zur Stabilisierung der Maus und Verringerung von Bewegungsartefakten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abbildung von subzellulären Strukturen in lebenden Speicheldrüsen.
- Nachweis der Dynamik sekretorischer Granula.
- Validierung der Methode für zukünftige Untersuchungen an lebenden Tiermodellen.
- Erkenntnisse über die physiologischen Funktionen dieser Strukturen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung subzellulärer Dynamiken.
- Die intravitale Mikroskopie kann auf verschiedene Bereiche der biologischen Forschung angewendet werden.
- Diese Technik verbessert unser Verständnis zellulärer Prozesse in vivo.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die intravitale Mikroskopie ermöglicht die Echtzeitvisualisierung subzellulärer Dynamiken in lebenden Tiermodellen und liefert entscheidende mechanistische Einblicke für die Zielvalidierung und Pfadanalyse. Durch die Abbildung der exozytotischen Freisetzung sekretorischer Granula und des Membrantrafficks in Speicheldrüsen unterstützt dieses Verfahren die präklinische Risikominderung von GPCR-vermittelten Signalwegen, die für metabolische und sekretorische Erkrankungen relevant sind. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem molekulare Störungen mit funktionellen subzellulären Effekten in einem physiologisch relevanten Kontext verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Beobachtung der beta-adrenergen Rezeptor-stimulierten Fusion sekretorischer Granula und unterstützt so die funktionelle Validierung von GPCR-Zielen in lebendem Gewebe.
- Operativer Wert: Bietet eine reproduzierbare Plattform, um Kinasen-, Phosphatasen- oder zytoskelettale Regulatoren der Exozytose mithilfe fluoreszierender Biosensoren zu untersuchen.
- Therapeutischer Wert: Erleichtert die mechanistische Entschärfung von Wirkstoffen, die auf cAMP/PKA-Signalwege abzielen, durch die Quantifizierung der kinetischen Vorgänge der subzellulären Translokation in Echtzeit.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Die stabilisierte Speicheldrübenpräparation ermöglicht eine konsistente Basisabbildung der GFP- und tandem-Tomato-Signale für die Bibliotheksscreening von Verbindungen.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die Messung der Granulinfusionsfrequenz, der Membran-Diffusionsraten und der Kollapskinetik als funktionelle Endpunkte zur Modulation von Signalwegen.
- Skalierbarkeit: Der chirurgische Stabilisierungs- und Abbildungsablauf kann an Mehrfachtierstudien mit standardisierter Temperatur- und Bewegungssteuerung angepasst werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert die regulierte Sekretion in exokrinen Geweben und ist anwendbar auf Studien zu Pankreatitis, dem Sjögren-Syndrom oder Funktionsstörungen des cystischen Fibrose-Transmembranregulators (CFTR).
- Biomarker-Kontinuität: Fluoreszierende Reporter für Granulamembranen und Zytoplasma ermöglichen die Korrelation bildgebender Endpunkte mit biochemischen Assays der Sekretion.
- Präklinische Risikominimierung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie eine Verbindung zwischen Targetbindung und funktionellen subzellulären Ergebnissen herstellt, bevor phänotypische Analysen auf Organebene erfolgen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein, wobei Echtzeit-Aufnahmen auf subzellulärer Ebene Aufschluss über den Wirkmechanismus und die Wegwahlselektivität geben.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von GPCR-Effektorwegen durch Visualisierung der Rekrutierung nachgeschalteter Effektoren und der Membrandynamik in intaktem Gewebe.
- Screening: Ermöglicht assaysichere Präparationen zur Bewertung der Wirkstoffeffekte auf die Kinetik der Exozytose mit räumlicher und zeitlicher Auflösung.
- Analytik: Erzeugt quantitative Daten zu Verschiebungen der Fluoreszenzintensität, Diffusionsraten und dem Zeitpunkt des Vesikelzerfalls, um experimentelle Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulares Targeting mit funktioneller Sekretion in einem krankheitsrelevanten exokrinen Modell und unterstützt die Übertragung auf die menschliche Pathophysiologie.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Stabilisierungs- und Bildgebungsplattform kann mit minimaler Neubewertung für verschiedene fluoreszierende Reporter und Krankheitsmodelle wiederverwendet werden.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen in der Signaltransduktion, indem direkte Visualisierung von Effektor-Translokation und Membranintegration ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Standardisierte Immobilisierung und Bildgebungsprotokolle verbessern die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren und über verschiedene Studienzeiträume hinweg.
- Strategischer Wert: Ermöglicht eine frühere Identifizierung von falsch-positiven Treffern, indem funktionelle subzelluläre Aktivität über Bindungs- oder bulk-biochemische Assays hinaus bestätigt wird.
- Portfolio-Wirkung: Steigert das Vertrauen in die Zielstrukturauswahl, indem die Beteiligung von Signalwegen in einer physiologisch intakten, dynamischen zellulären Umgebung validiert wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in muriner Chirurgie, Anästhesie und dem Aufbau der intravitale Mikroskopie.
- Benötigt ein konfokales Mikroskop mit 488-nm- und 561-nm-Laserlinien, einer temperierbaren Probebühne und Hardware zur Bewegungsstabilisierung.
- Setzt standardisierte Protokolle zur Tierpräparation voraus, um die Zugänglichkeit der Drüse und eine funktionelle Stabilität über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen.
- Die Übertragung auf andere Gewebe kann angepasste Stabilisierungsverfahren erfordern, bedingt durch Unterschiede in der Organmobilität und -zugänglichkeit.
- Aufgrund der Begrenzungen durch Photobleichen ist eine sorgfältige Kalibrierung der Laserleistung und eine geeignete Auswahl der Bildrate für Langzeitbeobachtungen erforderlich.
