Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine nanometrologische Methode zur Überwachung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme von Kohlenstoffnanoröhren in einer statistisch relevanten Anzahl von Zellen bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst mit wasserdispergierbaren Kohlenstoff-Nanoröhrchen behandelt werden, die konzentrationsabhängig in die Zellen gelangen. Diese Kohlenstoffnanoröhren werden schließlich mit einem fluoreszierenden Marker markiert.

Nach der Fixierung wird jede Zelle in den Hellfeld-, Dunkelfeld- und Fluoreszenzkanälen eines multispektralen Bildgebungsflusses abgebildet. Zytometer. Um die Verteilung der Kohlenstoffnanoröhren und den Grad der Lichtabsorption, des Streulichts und der Fluoreszenz zu visualisieren, induziert die Nanoröhrenmarkierung in jeder Zelle Pixel für Pixel. Letztendlich ermöglicht die intrinsische Lichtabsorption und -streuung innerhalb der Zellen die Lokalisierung und Quantifizierung der Kohlenstoffnanoröhren.

Diese Methode kann also dazu beitragen, neue Fragen in den Bereichen Nanotoxikologie und Nanomedizin zu beantworten, wie z. B. die Auswirkungen und das Schicksal von kohlenstoffbasierten Materialien in lebenden Zellen und auch das Topfpotenzial von Kohlenstoffnanoröhren als Wirkstoffabgabesystem. Beginnen Sie mit der Dispergierung der Kohlenstoffnanoröhren, die schließlich an eine Fluoreszenzmarkierung in Zellkulturwasser gekoppelt sind. Dann beschallen Sie die Nanoröhren in einem Badewasser und beschallen Sie es 20 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Als nächstes verdünnen Sie die Nanoröhren bei Konzentrationen von 0, 10, 20 und 50 Mikrogramm pro Milliliter in vollständigem Medium und inkubieren Sie dann zwei Milliliter jeder Verdünnung mit den interessierenden Zellen in einer 1 25 Quadratzentimeter großen Platte pro Verdünnung bei 37 Grad Celsius nach 20 Stunden, entfernen Sie das Inkubationsmedium von jeder Platte und spülen Sie die mit Kohlenstoffnanoröhren markierten Zellen mit PBS.

Nach dem Waschen beäugt Trypsin die Zellen auf jeder Platte und resuspendiert sie dann in vollständigem DMEM-Medium. Als nächstes wird jede Probe in einzelne 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführt und die Zellen dann fünf Minuten lang bei 200-facher G-Temperatur und Raumtemperatur heruntergeschleudert. Jedes Pellet wird eine Stunde lang in 4%para Formaldehyd bei vier Grad Celsius resuspendiert.

Nach der Fixierung schleudern Sie die Zellen wieder herunter und resuspendieren Sie jede pelletierte Probe im Verhältnis 15 mal 10 zu den fünften Zellen in 150 Mikrolitern PBS. Filtern Sie dann die Proben durch einzelne 50-Mikron-Maschensiebe, um Bilder der Zellen mit einem Bildstrom aufzunehmen. Multispektrales bildgebendes Durchflusszytometer.

Wählen Sie zunächst eine angepasste Vergrößerung aus und dann Bildbeispiele von Interesse. Verwenden Sie einen 685-Nanometer-Laser, um das Dunkelfeld abzubilden, und stellen Sie das Durchflusszytometer ein. Nummer sechs Kanal zur Erfassung der Dunkelfeldemission bei einem Bandpass von 745 bis 800 Nanometern.

Bilden Sie die Proben in den Hellfeldkanälen Nummer eins und Nummer sechs für die Bildanalyse ab. Erstellen Sie zunächst ein parametrisches Punktdiagramm mit einem Seitenverhältnis von Breite zu Höhe gegenüber der Zellenfläche. Dies ermöglicht die Unterscheidung der einzelnen Zellen, die eine Standardfläche und ein Aspektverhältnis nahe dem eines von den mehrzelligen Ereignissen haben, die eine große Fläche und ein kleines Aspektverhältnis aufweisen, und den Trümmern, die eine extrem kleine Fläche aufweisen.

Nachdem Sie anhand der Zellbilder überprüft haben, ob die einzelnen Zellen korrekt ausgewählt wurden, richten Sie ein biparametrisches Punktdiagramm für stark kontrastreiche Zellen mit Kohlenstoffnanoröhren ein, indem Sie den Kontrast gegen den Gradienten des mittleren Quadrats darstellen, um den Ausschluss der unfokussierten Zellen mit geringer Wurzel, des mittleren quadratischen Gradienten und des geringen Kontrasts und die Auswahl der Zellen in der fokussierten Ebene zu ermöglichen. Verwenden Sie als Nächstes das Werkzeug Bestes Feature suchen, um den Parameter zu bestimmen, der die beste statistische Trennung zwischen den beschrifteten und nicht beschrifteten Zellen bietet. Für dieses repräsentative Experiment ist z. B. das mittlere Pixelobjektmerkmal am besten geeignet.

Dann stellen Sie diesen Parameter gegen die normierte Frequenz dar, um ein Histogramm zur Quantifizierung der Nanoröhren zu erhalten, die von den Zellen bei jeder experimentellen Konzentration aufgenommen werden. Zeichnen Sie nun ein bi-parametrisches Diagramm für das mittlere Pixelobjekt im Hellfeld im Vergleich zur Intensität im Dunkelfeld. Um die Korrelation zwischen diesen beiden Parametern zu überprüfen, wird die Quantifizierung der Nanoröhren auch bewertet, indem auf den Zellbildern Bilder erstellt werden, da die Kohlenstoffnanoröhren als intensive dunkle Flecken erscheinen. Wählen Sie im Hellfeldkanal einen eingeschränkten Bereich von Pixeln mit geringer Intensität aus, z. B. zwischen null und 533, um die Schwellenmaske zu erstellen. Eine, die genau zu den dunklen Nanoröhren passt, um eine zweite Maske zu erzeugen, bezeichnete Maske zwei zur Visualisierung der Nanoröhren, die im Dunkelfeldkanal hell erscheinen.

Wählen Sie einen Bereich von Pixeln mit hoher Intensität aus. Für dieses Experiment wurde beispielsweise ein Bereich von 150 bis 4.095 gewählt. Erstellen Sie dann unter Verwendung der Fläche aus der ersten oder der zweiten Dunkelfeldmaske ein Punktdiagramm, um die relative Internalisierung der Nanoröhren zu quantifizieren.

Plotten Sie z. B. den Bereich auf Kanal sechs, der dem Dunkelfeld mit Maske zwei entspricht, gegen den Bereich auf Kanal eins, der dem Hellfeld mit Maske eins entspricht. Nachdem Sie die lineare Korrelation zwischen Maske eins und Maske zwei bestimmt haben, visualisieren Sie die Nanoröhren im Zytoplasma, indem Sie zuerst eine Maske der gesamten Zelle erstellen und dann die Maske erodieren. Nun wird M 0 1 7 um sieben Pixel erodiert, um das Innere der Zelle zu betrachten.

Um die Kohlenstoff-Nanoröhren innerhalb der Zellmembran sichtbar zu machen, verwenden Sie die Boolesche Gleichung M null eins und erodieren Sie M 0 1 7 nicht. Das ist die Maske der gesamten Zelle, die vom Inneren der Zelle subtrahiert wird, um eine Maske der Membran zu erzeugen, nur um die dunklen Pixel auf der Membran auszuwerten. Tragen Sie die Hellfeldmaske eins auf die Membranmaske auf.

Wenden Sie alle diese Masken auf mehrere Zellen gleichzeitig an, um die Unterscheidung zwischen den markierten und den unbeschrifteten Proben zu bestätigen. Wählen Sie dann die schwarzen Pixel auf der Membran mit dem Feature-Area-Werkzeug aus, um die Kohlenstoffnanoröhren auf der Zellmembran zu quantifizieren. Schließlich geht es darum, die Kohlenstoffnanoröhren, die internalisiert wurden, von denen zu unterscheiden, die an der Membran absorbiert wurden.

Plotten Sie den schwarzen Bereich der Membran gegen den schwarzen Bereich der gesamten Zelle. Nachdem alle Diagramme für eine experimentelle Bedingung erstellt wurden, erstellen Sie eine Vorlage für einen statistischen Bericht. Speichern Sie die Vorlage als A ST-Datei, und führen Sie einen Batch für alle Datendateien aus.

Das Bildstromgerät erzeugt mehrere hochauflösende Bilder jeder Zelle im Durchflusszytometer, einschließlich Hellfeld-, Dunkelfeld- und Fluoreszenzkanälen, wie hier mit drei verschiedenen Nanoröhren-markierten Zellen demonstriert. Die Overlays dieser Kanäle werden ebenfalls angezeigt. Das Vorhandensein von Kohlenstoffnanoröhren führt zu Veränderungen sowohl des Kontrasts als auch des Gradienten von markierten Zellen im Vergleich zu unmarkierten Zellen.

Daher ist die Erstellung eines bi-parametrischen Punktdiagramms wichtig für die Auswahl der Fokuszellen. Unfokussierte Zellen in Gelb können durch ihren geringen Kontrast und ihren geringen mittleren quadratischen Gradienten unterschieden werden, unabhängig davon, ob eine Nanoröhrenmarkierung vorhanden ist oder nicht. Unmarkierte Fokuszellen weisen ebenfalls einen geringen Kontrast auf, zeigen jedoch einen hohen Wurzelgradienten, einen mittleren quadratischen Gradienten, wenn die Fokuszellen mit Nanoröhren markiert sind, jedoch zeigen die Zellen ein kontrastreiches, niedriges Wurzel- und mittleres quadratisches Gradientenprofil.

Internalisierte Kohlenstoff-Nanoröhren sind leicht zu unterscheiden, insbesondere im Hellfeldkanal, wo sie als intensive dunkle Flecken erscheinen, deren Bereiche mit der Konzentration der Nanoröhren zunehmen. Bei der Analyse der mittleren Pixelsignale der Hellfeldbilder kann eine relative Quantifizierung der Nanoröhrenaufnahme bestimmt werden. Zum Beispiel zeigen diese Histogramme die signifikante Zunahme der Nanoröhrenaufnahme, die mit jeder Erhöhung der Nanoröhren-Markierungskonzentration auftritt, wie gezeigt wurde. Die Quantifizierung von Kohlenstoffnanoröhren ist auch durch die Verwendung von Masken möglich, die entweder auf einen begrenzten Bereich dunkler Pixel innerhalb eines Hellfeldbildes oder innerhalb der hochintensiven Pixel innerhalb des Dunkelfeldes angewendet werden. entsprechend den Bereichen, in denen die Nanoröhren vorhanden sind.

Die Darstellung der Fläche dieser Masken ermöglicht dann eine weitere Quantifizierung der Aufnahme von Kohlenstoffnanoröhren. Zusätzlich kann die Korrelation zwischen den Flecken in den Hell- und Dunkelfeldbildern bewertet werden, indem die Intensität des Dunkelfelds im Vergleich zum mittleren Pixelsignal des Hellfeldes aufgetragen wird, oder indem der Bereich der Maske innerhalb des Hellfelds im Vergleich zum Bereich innerhalb des Dunkelfelds aufgetragen wird. In den nächsten beiden Abbildungen sind Analysen der Kohlenstoffnanoröhren zu sehen, die sich im Inneren der Zelle befinden.

Diese ersten Bilder zeigen die verschiedenen Masken, die erstellt wurden. Beachten Sie, dass die Robustheit der Lokalisierungsmasken, die auf der Erosion der Standardzellenmaske basiert, visuell an der Sammlung der beschrifteten und unbeschrifteten Zellen überprüft werden muss. Wie gerade in diesen Punktdiagrammen gezeigt, wurde die Gesamtfläche der schwarzen Flecken auf der Zellmembran im Vergleich zur gesamten Zelle aufgetragen, um den Internalisierungswert zu bestimmen.

Bei Zellen, die 20 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden, im Vergleich zu Zellen, die zwei Stunden bei vier Grad Celsius bei vier Grad Celsius inkubiert wurden, befinden sich die Kohlenstoffnanoröhren meist auf der Membran, während bei 37 Grad Celsius die Kohlenstoffnanoröhren in mehr als 90% der Zellen internalisiert werden. Die Fluoreszenz von Kohlenstoffnanoröhren ist kein guter Indikator für die Internalisierung von Kohlenstoffnanoröhren, da eine zu geringe Korrelation zwischen den Fluoreszenzflecken und den Flecken innerhalb der Hell- und Dunkelfeldkanäle besteht. Tatsächlich deutet die Korrelation zwischen der Fitzy-Intensität und dem mittleren Hellfeldpixel auf einen Pearson-Korrelationskoeffizienten von minus 0,2 hin.

Wie in diesen Bildern gezeigt, stimmt das Fluoreszenzsignal nicht zuverlässig mit den Hellfeld-Schwarzflecken, Kohlenstoffnanoröhren, dem Einschluss und der Aggregation innerhalb intrazellulärer Lysosomen überein, die das Fluoreszenzsignal teilweise gelöscht haben. Im Gegensatz dazu können dispergierte Nanoröhren nach ihrer Entwicklung ein zuverlässigeres Fluoreszenzsignal liefern. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Nanotechnologie und Nanomedizin den Weg, die Wechselwirkung lebender Zellen mit kohlenstoffbasierten Nanomaterialien oder anderen Nanomaterialien mit hoher Absorptions- und Lebensstreufähigkeit unter Verwendung einer statistischen Hochdurchsatz-Zytometriemethode zu untersuchen.