Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die räumliche Organisation spezifischer genomischer Loci in einzelnen Zellen auf robuste Weise zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszenzmarkierte Sonden erzeugt werden, um schließlich die genomische Region von Interesse zu binden und hervorzuheben. Die nächsten Schritte bestehen darin, die interessierenden Zellen auf einem Objektträger zu kleben, zu fixieren und zu permatieren, um den Zugang zur Sonde zu ermöglichen.

Dann folgt auf eine gleichzeitige Hitzedenaturierung der Sonde und der zellulären DNA eine Waschung der Sondenhybridisierung über Nacht, um unspezifisch gebundene Sonden zu entfernen und mit dpi gegenzustehen. Um den Zellkern sichtbar zu machen, werden die mit der Fluoreszenzmikroskopie gewonnenen Ergebnisse letztendlich die Position des Kerns aufzeigen, die bestimmte genomische Regionen einnehmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Kernorganisation zu beantworten, wie z.B. die Bestimmung funktioneller Wechselwirkungen zwischen Genen.

Der Hauptvorteil dieses speziellen DNA-FISH-Protokolls besteht darin, dass es schnell, robust und vielseitig ist. Obwohl wir diese Methode mit E-Es-Zellen demonstrieren, kann sie auch auf zahlreiche andere Zelltypen angewendet werden, direkt markierte Sonden aus Rückseiten von 100 bis 250. Kilobasen erzeugen durchweg helle Signale, wenn kleinere Sonden benötigt werden.

Verwenden Sie Smid mit 40 bis 50 Kilobasen oder sogar Plasmide mit fünf bis 10 Kilobasen-Insertionen. Identifizieren Sie die Back- oder Smid-Klone, die bestimmten Genen entsprechen, mit dem Ensemble- oder UCSC-Genombrowser. Um eine qualitativ hochwertige Rück-DNA herzustellen, verwenden Sie entweder wiederholte Fällung oder ein kommerziell erhältliches Kit, wobei die Sauberkeit der Präparation proportional zum erforderlichen Sondenvolumen ist.

Führen Sie die Beschriftung in zwei Schritten durch. Verwenden Sie zunächst die NIC-Translation, um das Aminoallel DUTP einzuführen. Zweitens, verwenden Sie die chemische Kopplung, um einen AM-Mittelwert-Reaktivfarbstoff zu binden.

Es lohnt sich, Zeit in die Herstellung heller Sonden zu investieren, da diese für starke Fischsignale entscheidend sind. Dieser Eingriff kann parallel zur Behandlung der Zellen durchgeführt werden und muss nicht zu Beginn des Tages durchgeführt werden. Zuerst wurden 10 bis 20 Nanogramm der direkt markierten Sonde mit sechs Mikrolitern CO 1D NA für sechs Mikrogramm gemischt.

Fügen Sie dann einen Mikroliter einzelsträngige DNA aus Lachshoden für 9,7 Mikrogramm hinzu. Stellen Sie das Volumen der Mischung mit Wasser auf 100 Mikroliter ein. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter drei molare Natriumacetate und 275 Mikroliter Ethanol hinzu und mischen durch Vortexen.

Lassen Sie die Mischung mindestens eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius ausfällen. Als nächstes schleudern Sie den Niederschlag in einer Mikrofuge 30 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius. Dann waschen Sie das Pellet mit 70%Ethanol und schleudern es wieder fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius herunter.

Trocknen Sie anschließend das Pellet an der Luft. Dann Reanimation. Suspendieren Sie es in fünf Mikrolitern entionisierter Form.

Amid bei 37 Grad Celsius beim Schütteln bei 1000 U/min folgierst du, um es vor Licht zu schützen. Nach 30 Minuten fügen Sie fünf Mikroliter Dextrinsulfatmischung hinzu und setzen Sie die Inkubation unter Rühren fort. Für weitere 10 Minuten variiert die Neigung der Zellen, sich an den Objektträger zu halten, stark mit dem Zelltyp.

Bestimmen Sie für jeden Zelltyp empirisch die optimale Eingewöhnungszeit und Zelldichte. Für konsistente Ergebnisse sollten sich die Zellen in einer Einzelzellsuspension befinden Um ES-Zellen der Maus auf einem Objektträger zu haften. Beginnen Sie damit, den Bereich auf der Folie zu umkreisen, in dem die Zellen zu sehen sein werden.

Mit einem hydrophoben Pen wurde eine Suspension von 20 bis 50.000 Zellen pro 80 bis 100 Mikroliter in normalem Kulturmedium hergestellt, die Zellsuspension in den Kreis gegeben und die Zellen etwa drei Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator anheften lassen. Fixieren Sie die Zellen nach der Befestigung des Objektträgers, indem Sie den Objektträger 10 Minuten lang vorsichtig in 4 % PFA tauchen. Die Folie sollte flach in einem Tablett wie einer Trinkgeldbox liegen.

Verwendung von Reagenzien bei Raumtemperatur in Coplan-Gläsern. Zuerst die Zellen 10 Minuten lang mit Trischlorid abschrecken. Zweitens permease Sie die Zellen mit einer Mischung aus Sapin und Triton X 100 für 10 Minuten.

Waschen Sie nun die Zellen zweimal pro Waschgang fünf Minuten lang in PBS. Nach den Waschgängen inkubieren Sie die Zellen mindestens 20 Minuten lang in 20%igem Glycerin. Zu diesem Zeitpunkt können die Objektträger in 50%igem Glycerin bei minus 20 Grad Celsius für mehrere Wochen gelagert werden.

Die Speicherung für einen Tag oder länger sollte die Signalstärke erhöhen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Zellen auf Raumtemperatur in 20% Glycerin in PBS äquilibrieren, bevor Sie fortfahren. Frieren Sie nun den Objektträger ein und tauen Sie ihn dreimal mit flüssigem Stickstoff auf.

Eine Rutsche nach der anderen, wenn das Knistern aufhört. Nehmen Sie den Objektträger nach einigen Sekunden zum Auftauen auf ein Papiertuch und warten Sie, bis das undurchsichtige gefrorene Glycerin verschwunden ist, bevor Sie den Objektträger wieder einfrieren. Bis zu 15 Objektträger können bequem abwechselnd für drei Gefrier-Auftau-Zyklen durchgeführt werden. Waschen Sie nun die Objektträger zweimal pro Waschgang fünf Minuten lang in PBS.

Anschließend werden die Objektträger 30 Minuten lang in 0,1 molarer Salzsäure inkubiert. Nach der Salzsäurebehandlung mit weiteren fünf Minuten in PBS waschen. Permeisieren Sie nun die Zellen erneut mit einem stärkeren Sapin und Triton X 100 Mix für 30 Minuten, um die Tenside von den Objektträgern zu waschen, verwenden Sie zwei fünfminütige PBS-Wäschen.

Die Objektträger sind nun bereit, in 50%iger Form in XSSC zu äquilibrieren. Dies sollte mindestens 10 Minuten dauern, während die Sonde äquilibriert wurde, einige Male auf und ab pipettiert und dann 10 Mikroliter pro Zellspot auf ein Deckglas der entsprechenden Größe übertragen. Nehmen Sie einen Objektträger aus dem Formamid und trocknen Sie überschüssige Flüssigkeit um die Zellen herum mit einem Papiertuch ab, aber lassen Sie den Zellfleck nicht austrocknen.

Drehen Sie nun die Abdeckung um. Schlüpfen Sie auf den Objektträger über die Zellen. Versiegeln Sie den Deckglas mit Gummizement auf dem Objektträger.

Lassen Sie den Zement vollständig trocknen und schützen Sie den Objektträger vor Licht. Anschließend erhitzen Sie die Objektträger auf einer heißen Platte genau zwei Minuten lang auf 78 Grad Celsius. Dies ist entscheidend für eine ordnungsgemäße Leistung.

Eine Abdeckung muss die Zellen während dieses Schritts vor Licht schützen, um die Kernmorphologie so weit wie möglich zu erhalten. Es ist wichtig, die Zellen nicht austrocknen zu lassen und sicherzustellen, dass der Wärmepunkt die richtige Temperatur hat. Legen Sie dann die Objektträger in eine leichte, dichte Schachtel mit feuchten Papiertüchern, um sie mit Feuchtigkeit zu versorgen, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie den Gummizement um die Deckgläser herum abziehen. Legen Sie dann jede Folie in X überschüssige SC, bis sich die Abdeckung löst und abrutscht. Als nächstes waschst du die Objektträger in 50%iger Form Amid in zwei x überschüssigem SC für 15 Minuten bei 45 Grad Celsius.

Halten Sie einen Deckel auf dem Wasserbad, um sie vor Licht zu schützen. Waschen Sie die Objektträger dann in 0,2 XSSC für 15 Minuten bei 63 Grad Celsius. Dann zwei XSSC für fünf Minuten bei 45 Grad Celsius und schließlich fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu überschüssigem SE.

Die restlichen Schritte erfolgen alle bei Raumtemperatur, beginnend mit einer fünfminütigen Wäsche, und PBS färbt die Objektträger nun zwei Minuten lang mit Dappy und hält die Objektträger dann fünf Minuten lang mit PBS zurück. Um das Deckglas zu montieren, tragen Sie 10 Mikroliter Eindeckmedium pro Zellenfleck auf das Deckglas in der richtigen Größe auf. Trocknen Sie dann das überschüssige PBS um den Zellfleck herum, ohne die Zellen austrocknen zu lassen.

Drehen Sie die Abdeckung um, schieben Sie sie auf einen Objektträger und versiegeln Sie sie mit Nagellack unter Verwendung des Vorbereitungsprotokolls für Fischsonden. Nach der NIC-Translation sollte ein DNA-Abstrich sichtbar sein, wobei der Großteil der Fragmente zwischen 150 und 700 Basenpaare aufweist. Nach der chemischen Kopplung kann der Einbau des Fluoreszenzfarbstoffs durch spektroskopische Analyse der durchlaufenden Sonde gemessen werden.

Diese Qualitätskontrollschritte zur Beurteilung der Sondenqualität sind bei der Verwendung einer solchen Sonde von entscheidender Bedeutung. Eine automatisierte Bildgebung mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop war möglich. Dies erfordert scharfe, leicht erkennbare Fischsignale mit wenig Hintergrund.

Dies ist ein rohes Bild mit dem Sichtfeld. Die folgenden Bilder zeigen Zellkerne, die automatisch identifiziert und analysiert wurden. Verschiedene Abstände zwischen allelischen und inter locus sind oben rechts und zu beiden Seiten unter jedem Kern dargestellt.

In dieser Vergrößerung stellen weiße Flecken die identifizierten Kerne pro Sichtfeld dar. Diese Histogramme zeigen maximale interallelische Abstände zwischen grünen Signalen oben und roten Signalen unten. Alle Daten stammen von P20-Keimzellen mit Sonden, die sich auf verschiedenen Chromosomen befinden und die HBB- und HBA-Gene sowie einen Histon-Cluster abdecken.

Dies sind Beispiele für fetale Leberkerne, die mit Rücksonden gefärbt wurden, die die Gene mic und KC und Q1 abdecken. Aus diesen Bildern können Kernkoordinaten von Fischsignalen gewonnen und räumliche Beziehungen von Genomregionen berechnet werden. Interallelische Abstände werden als Bruchteil des Kernradius aufgetragen.

Rote Sonden waren in diesen Daten deutlich näher beieinander als grüne Sonden. Auch die konfokale Mikroskopie, die intensivere Signale benötigt, war möglich. Bildstapel wurden für die 3D-Modellierung von Fischsignalen innerhalb ihrer Chromosomengebiete verwendet.

Diese beiden Sonden in Rot und Weiß befinden sich nahe an beiden Enden des Mauschromosoms sieben, die Farbe des gesamten Chromosoms ist grün dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man DNA-Fische durchführt, um die räumliche Positionierung spezifischer genomischer Loci in einzelnen Zellen zu untersuchen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jede Behandlung die Kernarchitektur beeinträchtigen kann, und es ist wichtig, geeignete Nach diesem Verfahren zu berücksichtigen.

Andere Methoden wie Immuno-Fische können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie räumliche Beziehungen zwischen Genen und Proteinen zu beantworten.