Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die räumliche Organisation spezifischer genomischer Loci in einzelnen Zellen auf robuste Weise zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszenzmarkierte Sonden erzeugt werden, die letztendlich an den interessierenden genomischen Bereich binden und diesen hervorheben. Die nächsten Schritte bestehen darin, die Zellen von Interesse auf einem Objektträger anzubringen, zu fixieren und permeabilisieren, um den Sonden den Zugang zu ermöglichen.

Danach erfolgt eine simultane Hitzedenaturierung der Sonde und der zellulären DNA, gefolgt von Übernacht-Hybridisierungsschritten der Sonde und Waschschritten zur Entfernung unspezifisch gebundener Sonde sowie der Kontrastierung mit dpi. Zur Visualisierung des Zellkerns liefern die mit Fluoreszenzmikroskopie erhaltenen Ergebnisse letztendlich Aufschluss über die nukleare Position, die durch spezifische genomische Regionen besetzt wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der nuklearen Organisation zu beantworten, beispielsweise die Bestimmung funktioneller Interaktionen zwischen Genen.

Der Hauptvorteil dieses speziellen DNA-FISH-Protokolls liegt in seiner Schnelligkeit, Robustheit und Vielseitigkeit. Obwohl wir diese Methode an E Es-Zellen demonstrieren, kann sie ebenfalls auf zahlreiche andere Zelltypen angewendet werden. Direkt markierte Sonden, hergestellt aus Stücken von 100 bis 250 Kilobasen, erzeugen konstant helle Signale, falls kleinere Sonden benötigt werden.

Verwenden Sie 40 bis 50 Kilobasen große smid oder sogar Plasmide mit Inserten von fünf bis zehn Kilobasen. Identifizieren Sie die Back- oder smid-Klone, die bestimmten Genen entsprechen, mithilfe der Ensemble- oder UCSC-Genombrowser. Zur Herstellung von hochwertiger Back-DNA verwenden Sie entweder wiederholte Präzipitation oder ein im Handel erhältliches Kit; die Reinheit der Präparation steht in direktem Verhältnis zum erforderlichen Sondenvolumen.

Führen Sie die Markierung in zwei Schritten durch. Zuerst verwenden Sie die NIC-Translation, um das Aminoallel DUTP einzuführen. Danach verwenden Sie eine chemische Kopplung, um einen AM-reaktiven Farbstoff anzubinden.

Es lohnt sich, Zeit in die Herstellung heller Sonden zu investieren, da diese für starke FISH-Signale entscheidend sind. Dieses Verfahren kann parallel zur Behandlung der Zellen durchgeführt werden und muss nicht zu Beginn des Tages erfolgen. Zunächst werden 10 bis 20 Nanogramm direkt markierter Sonde mit sechs Mikrolitern CO 1D NA für sechs Mikrogramm vermischt.

Fügen Sie dann ein Mikroliter einsträngige DNA aus Lachstestes für 9,7 Mikrogramm hinzu. Stellen Sie das Volumen der Mischung mit Wasser auf 100 Mikroliter ein. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter dreimolares Natriumacetat und 275 Mikroliter Ethanol hinzu und mischen Sie durch Vortexen.

Lassen Sie das Gemisch mindestens eine Stunde bei minus 20 Grad Celsius ausfallen. Zentrifugieren Sie danach das Präzipitat in einer Mikrozentrifuge 30 Minuten bei maximaler Drehzahl und vier Grad Celsius. Waschen Sie anschließend das Pellet mit 70 % Ethanol und zentrifugieren Sie erneut fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Trocknen Sie das Pellet anschließend an der Luft. Dann resuspendieren Sie es in fünf Mikrolitern deionisiertem Formamid.

Amid bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 1000 U/min, dabei mit Folie abdecken, um Lichtschutz zu gewährleisten. Nach 30 Minuten fünf Mikroliter Dextrinsulfat-Mix hinzufügen und die Inkubation unter Rühren weitere 10 Minuten fortsetzen. Die Neigung der Zellen, an einem Objektträger zu haften, variiert stark je nach Zelltyp.

Bestimmen Sie für jeden Zelltyp die optimale Sedimentationszeit und Zelldichte empirisch. Für konsistente Ergebnisse sollten die Zellen in einer Einzelzell-Suspension vorliegen, um Maus-ES-Zellen auf einem Objektträger anzubringen. Beginnen Sie damit, den Bereich auf dem Objektträger einzukreisen, auf den die Zellen aufgetragen werden sollen.

Mit einem hydrophoben Stift ein Kreis gezogen; eine Suspension von 20 bis 50.000 Zellen pro 80 bis 100 Mikroliter in normalem Kulturmedium hergestellt; die Zellsuspension in den Kreis gegeben und die Zellen etwa drei Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator anheften lassen. Nach der Anheftung der Zellen auf dem Objektträger diese durch vorsichtiges Eintauchen des Objektträgers in 4 % PFA für 10 Minuten fixieren. Der Objektträger sollte flach in einer Schale, wie beispielsweise einer Pipettenspitzenbox, liegen.

Verwendung von Reagenzien bei Raumtemperatur in Coplan-Gefäßen. Zuerst die Zellen mit Tris-Chlorid 10 Minuten lang abpuffern. Danach die Zellen mit einer Mischung aus Sapin und Triton X-100 für 10 Minuten permeabilisieren.

Waschen Sie die Zellen nun zweimal mit PBS, wobei jeder Waschschritt fünf Minuten dauert. Nach den Waschungen inkubieren Sie die Zellen mindestens 20 Minuten in 20 % Glycerol. An diesem Punkt können die Objektträger mehrere Wochen lang in 50 % Glycerol bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Die Lagerung für einen Tag oder länger sollte die Signalstärke erhöhen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vor dem Fortfahren in 20 % Glycerol in PBS auf Raumtemperatur gebracht werden. Gefrieren und tauen Sie den Objektträger nun dreimal mit flüssigem Stickstoff ab.

Eine Folie nach der anderen, sobald das Knistern aufhört. Nach einigen Sekunden die Folie auf ein Papiertuch legen, um sie aufzutauen; warten Sie, bis das trübe gefrorene Glycerin verschwunden ist, bevor Sie die Folie erneut einfrieren. Bequem können bis zu 15 Folien im Wechsel für drei Gefrier-Tau-Zyklen bearbeitet werden. Waschen Sie die Folien nun zweimal in PBS, wobei jede Waschung fünf Minuten dauert.

Danach die Objektträger 30 Minuten lang in 0,1 molarer Salzsäure inkubieren. Anschließend eine weitere fünfminütige Waschung in PBS durchführen. Nun die Zellen erneut mit einer stärkeren Saponin- und Triton X-100-Mischung 30 Minuten lang permeabilisieren; zum Entfernen der Tenside von den Objektträgern zwei fünfundzwanzigminütige PBS-Waschungen verwenden.

Die Objektträger sind nun bereit, in 50 % Formamid in XSSC zu equilibrieren. Dieser Schritt sollte mindestens 10 Minuten dauern. Während des Equilibrierens entnehmen Sie die Sonde, pipettieren sie mehrmals auf und ab und übertragen anschließend 10 µL pro Zellpunkt auf ein Deckglas der entsprechenden Größe. Entnehmen Sie einen Objektträger aus dem Formamid und trocknen Sie überschüssige Flüssigkeit um die Zellen herum vorsichtig mit einem Papiertuch ab, lassen Sie jedoch den Zellpunkt nicht austrocknen.

Drehen Sie nun die Deckglasplatte um. Setzen Sie sie auf den Objektträger über die Zellen. Versiegeln Sie das Deckglas mit Kautschukkleber am Objektträger.

Lassen Sie den Klebstoff vollständig trocknen und schützen Sie den Objektträger vor Licht. Erhitzen Sie anschließend die Objektträger genau zwei Minuten lang auf einer Heizplatte auf 78 Grad Celsius. Dieser Schritt ist entscheidend und muss korrekt durchgeführt werden.

Ein Deckel muss die Zellen während dieses Schritts vor Licht schützen, um die Kernmorphologie so weit wie möglich zu erhalten. Es ist entscheidend, dass die Zellen nicht austrocknen, und dass der Wärmespot die richtige Temperatur aufweist. Danach die Objektträger in eine lichtundurchlässige Box mit feuchten Papiertüchern zur Feuchtigkeitsversorgung geben und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Beginnen Sie dieses Verfahren damit, dass Sie den Gummizement von den Deckgläsern ablösen. Anschließend geben Sie jeden Objektträger in X-fachen Überschuss an SC, bis sich die Deckgläser lösen und abrutschen. Waschen Sie danach die Objektträger 15 Minuten lang bei 45 Grad Celsius in 50 % Formamid in zwei X-fachen Überschuss an SC.

Decken Sie das Wasserbad ab, um die Objektträger vor Licht zu schützen. Anschließend spülen Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei 63 Grad Celsius mit 0,2 XSSC aus. Danach zwei Minuten mit XSSC bei 45 Grad Celsius und schließlich überschüssig mit SE bei Raumtemperatur für fünf Minuten.

Die verbleibenden Schritte erfolgen alle bei Raumtemperatur, beginnend mit einer fünfminütigen Wäsche in PBS. Färben Sie die Objektträger anschließend zwei Minuten lang mit DAPI und waschen Sie die Objektträger danach fünf Minuten lang mit PBS. Zum Aufbringen des Deckgläschens geben Sie 10 Mikroliter Eindeckmedium pro Zellprobe auf ein passendes Deckglas. Danach entfernen Sie das überschüssige PBS um die Zellprobe herum, ohne dass die Zellen austrocknen.

Drehen Sie die Deckplatte um, schieben Sie sie auf einen Objektträger und versiegeln Sie sie mit Nagellack gemäß der Fischsonden-Präparationsanleitung. Nach der NIC-Übersetzung sollte ein DNA-Smear sichtbar sein, wobei der Großteil der Fragmente zwischen 150 und 700 Basenpaaren läuft. Nach der chemischen Kupplung kann die Einbindung des fluoreszierenden Farbstoffs durch spektroskopische Analyse des Sonden-Durchlaufs beurteilt werden.

Diese Schritte zur Qualitätskontrolle zur Beurteilung der Sondenqualität sind bei Verwendung einer solchen Sonde entscheidend. Die automatisierte Bildgebung mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop war durchführbar. Dies erfordert scharfe, leicht identifizierbare Fischsignale mit geringem Hintergrund.

Dies ist ein Rohbild des Sichtfelds. Die folgenden Bilder stellen Kerne dar, die automatisch identifiziert und analysiert wurden. Verschiedene interallele und interlokale Abstände sind oben rechts sowie seitlich unterhalb jedes Kerns dargestellt.

In dieser Vergrößerung stellen weiße Flecken die identifizierten Kerne pro Sichtfeld dar. Diese Histogramme zeigen die maximalen interallelen Abstände zwischen den grünen Signalen oben und den roten Signalen unten. Alle Daten stammen von P 20 Keimzellen mit Sonden an verschiedenen Chromosomen, die die HBB- und HBA-Gene sowie einen Histonen-Cluster abdecken.

Dies sind Beispiele für Fetalleberkerne, die mit Back-Proben markiert wurden, die die Gene mic, KC und Q1 abdecken. Aus diesen Bildern können die nuklearen Koordinaten der FISH-Signale gewonnen und die räumlichen Beziehungen genomischer Regionen berechnet werden. Die interallelen Abstände sind als Bruchteil des Kernradius dargestellt.

Rote Sonden lagen in diesen Daten signifikant näher beieinander als grüne Sonden. Die konfokale Mikroskopie, die intensivere Signale erfordert, war ebenfalls durchführbar. Bildstapel wurden zur 3D-Modellierung der Signale im Fisch innerhalb ihrer Chromosomenbereiche verwendet.

Diese beiden Sonden in Rot und Weiß befinden sich nahe entweder Ende des gesamten Maus-Chromosom sieben, das in Grün dargestellt ist. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man DNA-FISH durchführt, um die räumliche Positionierung spezifischer genomischer Loci in einzelnen Zellen zu untersuchen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass alle Behandlungen die nukleäre Architektur beeinflussen können, und es ist wichtig, geeignete Kontrollen gemäß diesem Verfahren einzuschließen.

Andere Methoden wie die Immuno-FISH können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der räumlichen Beziehungen zwischen Genen und Proteinen zu beantworten.