Genetische Manipulation in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist ein effizienter und zuverlässiger Genaustausch unter Verwendung von Typ-eins- und Typ-zwei-Delta-zwei-80-Stämmen von Toxoplasmic ndii. Dies wird erreicht, indem zunächst ein gezielter DNA-Molekül konstruiert wird, der den HX GPRT-auswählbaren Marker in vorwärtsgerichteter Orientierung zwischen unterschiedlichen fünf- und drei-prime-genetischen Ziel-DNA-Flanken fusioniert. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das gezielte DNA-Molekül in einen Toxoplasma-DYI-Stamm vom Typ eins oder Typ zwei zu transfizieren.

Der dritte Schritt besteht darin, geduldig Doppel-Crossover-Ereignisse der homologen Rekombination auszuwählen und einzelne Klone zu isolieren. Der letzte Schritt ist die Validierung des Vorhandenseins des Gen-Targeting-Ereignisses in den isolierten Mutantenklonen. Letztendlich können die Ergebnisse dieses Verfahrens die Funktion von Parasitengenen durch die Analyse gezielter Gen-Knockouts, Gen-Ersetzungen und Tag-Genen mittels einer Vielzahl nachgeschalteter Anwendungen aufzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden mit Wildtyp-Stämmen dieses Parasiten liegt darin, dass die Hintergründe des Typ eins und Typ zwei delta zwei 80 Parasiten nun eine äußerst zuverlässige Selektion gezielter Doppel-Crossover-Homolog-Rekombinationsereignisse ermöglichen, um präzise genetisch definierte Stämme herzustellen. Diese Technik wird die Entdeckung neuer Zielstrukturen für Antitoxin-Plasma-Medikamententherapien sowie die Entwicklung sicherer und wirksamer abgeschwächter Impfstammvarianten erheblich beschleunigen, insbesondere in Kombination mit den gut durchdachten genomischen Ressourcen, die online unter @toxodb.org verfügbar sind. Personen, die neu in dieser Methode sind, haben im Allgemeinen Schwierigkeiten bei der Konstruktion gezielter DNA-Moleküle oder genetischer Modifikationen mit Toxoplasma gondii.

Jedoch werden die klinische Anwendung und die Entwicklung zuverlässiger Targeting-Moleküle den Erfolg sicherstellen. Beginnen Sie das Protokoll mit der PCR-Amplifikation der fünf- und dreiprime genomischen Targeting-Flanken für das Gen der Wahl aus genomischer DNA. Amplifizieren Sie anschließend den HX GPRT selektierbaren Marker mit seinen fünf- und dreiprime DHFR-Flanken aus der HX GPRT CD NA Minigen-Kassette per PCR.

Verwenden Sie die Hefe-Rekombination oder eine ähnliche Methode, um die 3D-NA-Moleküle in ihrer korrekten 5'-zu-3'-Orientierung mit dem Plasmid PRS vier 16 zu verbinden, wodurch das Plasmid p delta GOI entsteht, das die Deletion am Gen der Interesse richtet. Bereiten Sie anschließend eine 100-Mikroliter-Probe mit 15 bis 30 Mikrogramm linearisiertem Targeting-Plasmid zur Transfektion in T gia 68 bis 72 Stunden nach der Inokulation eines 25-Quadratzentimeter-Flasks mit konfluenten HFF-Zellen vor. Überprüfen Sie das Vorhandensein frisch lysierter Parasiten, indem Sie visuell bestätigen, dass 90 bis 95 % der HFF-Zellen lysiert wurden; lebensfähige Parasiten sind für das Gen-Targeting unerlässlich.

Schütteln Sie das geschlossene Gefäß kräftig, um die lebensfähigen Parasiten in Lösung zu bringen, wobei verhindert werden muss, dass Flüssigkeit an den Innenseiten des Deckels oder des Flaschenhalses angesammelt wird. Gewinnen Sie die Parasiten aus dem Gefäß und bereiten Sie sie wie im Textprotokoll beschrieben für die Transfektion vor. Elektroporieren Sie das Targeting-Plasmid in den Delta-CO-80-Toxoplasma-Stamm.

Überführen Sie das elektroporierte Gemisch in einen 150 cm²-Flasche mit konfluenten HFF-Zellen und 30 ml Infektionsmedium. Inkubieren Sie die infizierte Kultur über Nacht bei 37 °C etwa 20 Stunden nach der Transfektion. Ersetzen Sie das Medium durch MPA plus X Selektionsmedium.

Lassen Sie die Parasiten nun ungefähr acht Tage lang ungestört bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald Plaques sichtbar sind, schütteln Sie den Kolben, um extrazelluläre Parasiten von der Monoschicht zu lösen und eine Parasitenlösung zu erzeugen. Übertragen Sie etwa ein halbes Milliliter der Parasitenlösung auf einen neuen 25-Quadratzentimeter-Kolben mit konfluierenden HFF-Zellen, der fünf Milliliter MPA plus X-Selektionsmedium enthält.

Bezeichnen Sie diese Kultur etwa drei Tage später als PAs one A. Wiederholen Sie die Übertragung von einem halben Milliliter der Parasitenlösung aus dem ursprünglichen Kolben in einen weiteren Kolben mit HFF-Zellen, der das gleiche Selektionsmedium enthält. Bezeichnen Sie diese Kultur in den folgenden fünf Tagen als PAs one B.

Überwachen Sie die Durchgänge A und B für pfu. Wählen Sie entweder Durchgang A oder B für das Subklonieren basierend auf einer ausreichenden Anzahl von mehr als 25 Infektionszonen aus. Sobald die Parasiten die HFF-Zellen lysieren, überführen Sie die Kultur drei Wochen nach der Transfektion in einen neuen 25 cm²-Flasche mit konfluenten HFF-Zellen und Selektionsmedium. Subklonieren Sie frisch infizierte Parasiten, indem Sie die Parasiten auf die geeignete Konzentration in MPA plus X-Medium verdünnen und die Parasitenlösung gleichmäßig auf eine 96-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen verteilen.

Bereiten Sie eine Platte mit einer Konzentration von einem Parasiten pro Vertiefung vor und bereiten Sie eine zweite Platte mit einer Konzentration von zwei Parasiten pro Vertiefung vor. Inkubieren Sie beide Platten ab dem ursprünglichen Transfektionsdatum bei 37 Grad Celsius. Subklonieren Sie die Parasiten nicht vor Tag 20 bei Typ-1-Parasiten oder vor Tag 25 bei Typ-2-Parasiten.

Führen Sie das Passagieren der 25-Zentimeter-Flasche wöchentlich wie im Online-Text beschrieben fort, bis der Knockout-Stamm validiert wurde. Bewerten Sie nach etwa einer Woche die 96-Well-Platten bei einer 40- bis 60-fachen Vergrößerung. Wählen Sie nur die Wells aus, die einen einzelnen PFU enthalten, der als einzelne Infektionszone identifiziert wurde, unter Verwendung einer Pipette, die auf 50 Mikroliter eingestellt ist.

Mischen Sie den Inhalt dieser Vertiefungen, indem Sie den Flüssigkeitsstrom über die PFU lenken, um die Parasiten in der Vertiefung zu verteilen. Vier bis fünf Tage nach dem Mischen der ausgewählten Vertiefungen wählen Sie ein Dutzend Klone mit lysierten Zellen aus. Übertragen Sie 12 Klone von der 96-Loch-Platte auf 12 Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, indem Sie mit der Pipettenspitze über den Boden der Vertiefung kratzen und sechs Mikroliter aufziehen.

Überführen Sie die Lösung in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte mit konfluenten HFF-Zellen in einem Milliliter MPA plus X-Selektion. Inkubieren Sie die 24-Loch-Platte bei 37 Grad Celsius und überwachen Sie die Lyse der HFF-Zellen. Passagieren Sie die Parasiten wöchentlich aus einer lysierten Vertiefung der 24-Loch-Platte.

Verwenden Sie die Kratz- und Zeichentechnik, um zwei Mikroliter der Parasitenlösung auf eine neue Platte mit MPA und X-Selektion zu übertragen. Nach dem Passieren sammeln Sie die Parasiten aus der ursprünglichen 24-Well-Platte und überführen Sie in kleine Röhrchen zur DNA-Gewinnung.

Verwenden Sie abschließend eine PCR, um die Deletion des Gens der Interesse zu überprüfen und somit die Integration der fünfprime und dreiprime Ziel-Sequenzen zu kontrollieren, sowie um den HX GPRT selektierbaren Marker nachzuweisen. Dieses Protokoll dient der Entfernung des HX GPRT Markers aus dem modifizierten delta Q 80 Stamm und ist im Online-Text beschrieben.

P delta GOYC zielt auf die Entfernung von HX GPRT aus dem Parasiten durch negative Selektion unter Verwendung von sechs TX-Medien ab. Anschließend wird mittels PCR die Verlustbestätigung von HX GPRT über eine 1,2 Kilobasenpaar große Bande nachgewiesen, wo HX GPRT nicht aus dem Locus entfernt wurde. Es ist eine 3,4 Kilobasenpaar große Bande vorhanden.

Der letzte Teil dieses Protokolls, das C-terminale Markieren von Proteinen, wird ebenfalls ausführlich im Online-Text beschrieben. Nach Durchführung des beschriebenen Protokolls zur gezielten Genlöschung wurde die Deletion eines Knockouts vom Typ eins R 18, einem generell schwer zu targetenden Gen, mittels PCR überprüft. PCR 1 zeigt das Fehlen des R 18-Gen-PCR-Produkts.

PCR zwei zeigt das Vorhandensein der drei-primär-R-18-genomischen Targeting-Flanke; PCR drei und PCR vier zeigen das Vorhandensein des selektierbaren Markers, der korrekt zwischen den fünf- und drei-primär-genomischen Targeting-Flanken integriert ist, was die R-18-Deletion definiert. Um den selektierbaren Marker für nachfolgende Deletionen in einem Stamm wiederverwenden zu können, muss das ursprüngliche HX-GPRT zunächst aus dem Locus entfernt werden. Nachdem das beschriebene Protokoll befolgt wurde.

HX GPRT wurde aus dem gelöschten GRA-Zwei-Lokus im Stamm delta zwei 80 delta GRA zwei HX.G-P-R-T entfernt. HX.G-P-R-T-P-C-R wurde verwendet, um den Verlust von HX GPRT nachzuweisen, der durch ein Band von 1,2 KILOBASE angezeigt wurde. Wenn H-X-G-P-R-T nicht entfernt wurde, war ein Band von 3,4 KILOBASE nach dem ersten Schritt der Genzielansteuerung vorhanden. Zusätzliche Methoden zur Genzielansteuerung können angewendet werden, um mehrfache Knockouts im selben Typ-eins- oder Typ-zwei-Stamm zu erzeugen oder um einen Mutantenstamm zu markieren oder zu komplementieren, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wo lokalisiert dieses Protein in der Zelle?

Oder welches ist die entscheidende Domäne oder Aktivität dieses Proteins oder Signalwegs, die seine biologische Funktion erklärt? Diese Technik ebnet Forschern auf diesem Gebiet den Weg, die Erforschung der Genfunktion von Parasiten im Modell des AP-Komplexes und des Parasiten Toxoplasma zu intensivieren. Gandhi Auge.

Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Toxoplasma gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Einhaltung aller BSL-2-Richtlinien während des gesamten Verfahrens beachtet werden sollten.