Name: Genetische Manipulation in Δku80 Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse Toxoplasma gondii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Lernen Sie die gezielte Genmanipulation in Toxoplasma gondii mit Δku80-Stämmen für funktionelle Genomanalyse. Diese Methode ermöglicht präzise Gen-Knockouts und markierte Gene durch homologe Rekombination.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH DJB (AI041930, AI073142, AI075931 und AI091461) unterstützt.

<ol><li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li>
<li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li>
<li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5%27-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li>
<li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+the+model+apicomplexan%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li>
<li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToxoDB%3A+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+research%22%5BJournal%5D)">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma%3A+the+next+100+years%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection+%2F+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li>
<li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).</li>
<li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3%2C+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li>
<li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li>
<li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li>
<li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Pathog%22%5BJournal%5D)">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007(2011).</li>
<li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li>
<li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+tagging%2C+cloning%2C+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii%3A+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li>
<li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li>
<li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li>
<li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+%27intracellular%27+buffer+increases+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902(1992).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li>
<li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+%28TgAMA1%29+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Hier bieten wir ein Protokoll für einen effizienten Gen-Targeting in Δ Ku80 Parasitenstämme um die effiziente Gewinnung von genetisch manipulierten Nachkommen, die gezielte Deletionen, Genaustausche und / oder markierten Gene besitzen können. Die sequentielle Ausführung dieser Verfahren stellt eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Mutanten Parasiten, die einzelne oder mehrere gezielte genetische Manipulationen 1-3 enthalten. Während die Erzeugung eines gezielten Löschung hängt von mehreren Faktoren ab, die Verwendung der Δ Ku80 Stamm mit der vorgestellten Strategie und Protokoll erhöht die Effizienz und Leichtigkeit der Herstellung genau definierte Mutanten von T. gondii zur funktionellen Genom-Studien. Das Genom von T. gondii während asexuellen Stadien ist haploid. So eine Überlegung zu machen bei der Planung, um ein Gen zu löschen ist, dass das Gen darf nicht wesentlich in vitro. Dennoch ist die Effizienz der targeting Gen-Knockouts in Δ Ku80 Stämme ist sehr hoch, und dies ermöglicht die Isolierung von Mutanten mit deutlich eingeschränkter Replikationsraten. Wenn eine gezielte Gen ist wichtig, Parasiten oft nicht mehr bei der Auswahl zu replizieren. Ein weiterer kritischer Faktor bei der gezielten genetischen Manipulation ist, dass perfekte Homologie mit mindestens 620 bp der genomischen Targeting Flanke wird benötigt, um nachweisbar zu erhalten gezielte Integrationen 2. Längere Homologieregionen erzeugen höhere Wirkungsgrade von Targeting und mit Targeting-DNA Flanken von ca. 1.000 bp ist ein zuverlässiges und effizientes Konzept 1-4. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass genomische Targeting Flanken aus dem gleichen Stamm von T. erzeugt gondii (RH, Pru) als Stamm, ist genetisch manipuliert wird. Mangel an ausreichender Homologie häufig in der gezielten Integration eines genomische Targeting Flanke führen, aber nicht die anderen. Unvollständige Integration bzw. gegen eine Knockout ma erhalteny auch aufgrund episomalen Beharrlichkeit. Unmittelbar nach der Transfektion werden alle Zielmoleküle Episome nicht integrierten und manchmal Targeting-Moleküle können als Episomen viele Generationen bestehen. Mit Ziel-DNA-Flanken von ~ 1 Kbp und Weiterbildung, um Parasiten unter Selektion vor Re-Subklonierung passieren häufig behebt Probleme mit episomalen Persistenz verbunden. Sobald ein Knockout wird validiert und die HXGPRT Markierung entfernt wird, kann das Gen-Targeting-Strategie auf einer zweiten GOI mehrere Deletionen in einem einzigen Parasiten Stamm 1-3 erzeugen wiederholt werden. Die Erzeugung von Deletionen, Ersatz oder markierten Gene können auch durch die Verwendung verschiedener Selektionsmarker (Bleomycin, CAT, Pyrimethamin resistent DHFR, etc.) erreicht werden. Obwohl die CAT Selektionsmarker derzeit in der Typ-II-Δ Ku80 Pru Genoms 1 kann diese Markierung entfernt werden unter Verwendung des HXGPRT </em&gt; Auswahl hier beschriebene Protokoll. In unseren Händen ist HXGPRT Auswahl die sicherste und effizienteste Marker mit der höchsten Effizienz Targeting wo ein single-copy gezielte Einsetzen ist ausreichend für robuste Auswahl MPA + X Medium. HXGPRT bietet auch die einzige derzeit nützlicher Ansatz für gezielte Löschen eines Selektionsmarker (Abbildung 3) mit 6-Thioxanthin (6TX) 2,3 Auswahl. Dabei dient dieses Protokoll bietet die einzige derzeitige Ansatz für die Entwicklung definiert Mutanten mit mehreren gezielten genetischen Manipulationen. Dieses Protokoll bietet eine wertvolle und effiziente Methode zur gezielten genetischen Manipulation in Δ Ku80 Stämme von Toxoplasma gondii und ist auf die Analyse eines einzelnen Gens, einer Familie von Genen, oder Genom-weiten funktionalen genomischen Studien. Vor der Verfügbarkeit von Δ Ku80 Stämme 1,2 waren diese Ansätze nicht allgemein möglich aufgrund der inefficiency dieser Methoden. Folglich ist dieses Protokoll weit für gezielte genetische Manipulation von Toxoplasma gondii und ist zugänglich für alle Ermittler bei der Bewältigung einer Reihe von Fragen auf Parasiten Biologie, Host-Reaktion und der funktionellen Genomik interessiert.

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazelluläre gemeinsamen einzelligen Parasiten, die häufig chronisch infiziert und eine breite Palette von Tieren und Menschen 5. Es wird geschätzt, dass mehr als 1 Milliarde Menschen derzeit chronisch infizierten und von diesem Erreger. Neben der Bedeutung von Krankheiten verursacht durch T. gondii-Infektion, die zunehmende Verfügbarkeit von experimentellen Tools, leistungsstarke Genomik Ressourcen 6, einfache in vitro Wachstum und eine hervorragende Maus-Modellen gemacht haben T. gondii ein führender Modellsystem für die Untersuchung der intrazellulären breiteren eukaryotischen Krankheitserreger und andere bedeutende Apicomplexa die verheerende Krankheiten wie Malaria (Plasmodium sp.) und Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7 verursachen. Eine erhebliche Einschränkung der Toxoplasma gondii als Modellorganismus ist die ineffiziente Verwertung von Nachkommen, die gezielte genetische Manipulationen zu tragen. Diese problem in der Gen-Targeting ist aufgrund einer niedrigen Frequenz der homologen Rekombination relativ zu der sehr hohen Frequenz-homologe Rekombination in Wildtyp-Stämme von T. gondii, auch wenn umfangreiche DNA-Homologie wird in Ziel-DNA-Moleküle in genetischen Studien 2 verwendet wird. Wir haben kürzlich die genetisch Hauptweg der homologen Rekombination in der Aktivität blockiert I und Typ II-Stämme von Toxoplasma gondii durch Deletion des Gens kodierend für das Protein KU80 1,2. Die resultierende Typ I und Typ II Δ Ku80 Stämme weisen normale Wachstumsraten, Größe und Verhalten sowohl in vitro als auch in vivo während Tachyzoiten und bradyzoite Stadien in vitro und in vivo, jedoch weisen diese Stämme im Wesentlichen eine 100% Frequenz der homologen Rekombination und diese Phänotyp erhöht die Wahrscheinlichkeit rasch Isolieren gewünschten Nachkommen der gezielten genetischen Manipulation von mehreren hundert bis zu mehreren Thousand-fach 1,2,4. Aktuelle EU-weite Verwendung von Typ I und Typ II Δ Ku80 Stämme hat deutlich hochgefahren das Tempo, die Vielfalt sowie die Erfolgsquote der gezielte genetische Ansätze in T. gondii 1-4,8-13. Hier beschreiben wir ein umfassendes Protokoll zur gezielten Gen-Deletion, Gen-Ersatz, und Gen-Tagging in Δ Ku80 Stämme von T. gondii. Wir zeigen, wie zu entwerfen und zuverlässig gezielt genetische Manipulationen, bestimmte Gene oder genetische Loci in Δ Ku80 Stämme von Toxoplasma gondii.

<table><tbody><tr><td>Overlap Primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>4 nmol Ultramer DNA-Oligos</td></tr><tr><td>Validierung Primer Integrated</td><td>DNA Technologies</td><td></td><td>100 nmol DNA Oligo</td></tr><tr><td>Hefestamm #90845</td><td>ATCC</td><td></td><td>Bezeichnung FY834</td></tr><tr><td>Shuttle Vector pRS416</td><td>ATCC</td><td>87521</td><td></td></tr><tr><td>DH10B E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>12033-015</td><td>SOC-Bouillon im Kit mit E. coli</td></tr><tr><td>Resuspension Buffer</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-BG05</td><td>0,5 mm säuregewaschen</td></tr><tr><td>Qiacube Automatisierter Roboterarbeitsplatz</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td></td></tr><tr><td>BTX600 Elektroporator</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>25 cm2</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>150 cm2 Canted Neck Plug Seal Fask</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>Humane Vorhaut-Fibroblasten (HFF)-Zellen</td><td>ATCC</td><td>SCRC1041</td><td></td></tr><tr><td>Swin-lok Filterhalter</td><td>Whatman</td><td>420200</td> Membran mit <td>25 mm Durchmesser</td></tr><tr><td></td><td>Whatman</td><td>110612</td><td>Nucleopore Spurgeätzte Membran 3 mm Porengröße, 25 mm</td></tr> Durchmesser <tr><td>Mycophenolsäure (MPA)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xanthin (X)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturtablett</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturtablett</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle Media</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>12-611F</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-Antimykotisch (Anti-Anti)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Spin Column</td><td>Primm Labs</td><td>PAE-100</td><td>Easy Clean DNA-Extraktions-Spin-Kit</td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Thioxanthin</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebe-DNA-Minikit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>QIAamp DNA-Blut-Mini-Kit</td></tr><tr><td>Zellkultur-Gefrier-/Wiederherstellungsmedien</td><td>Gibco</td><td>126-48-010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepuffertes</td><td>Kochsalz-Hyklon</td><td>SH30028,02</td><td>minus Kalzium, minus Magensium</td></tr></tbody></table>

genetische manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; die stämme für funktionelle genomanalyse<em&gt; toxoplasma gondii</em

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Gezielte genetische Manipulation mit homologen Rekombination ist die Methode der Wahl für die funktionelle Genomanalyse, um eine detaillierte Ansicht der Genfunktion und Phänotyp (s) zu erhalten. Die Entwicklung von Mutanten mit gezielter Deletionen, gezielte Mutationen, ergänzt Genfunktion und / oder markierten Gene liefert leistungsfähige Strategien zur Genfunktion zu befassen, insbesondere, wenn diese genetische Manipulationen effizient mit dem Gen-Locus von Interesse unter Verwendung vermittelte Integration durch gezielte Doppel überqueren homologe Rekombination. Aufgrund der sehr hohen homologen Rekombination funktionelle Genomanalyse von Toxoplasma gondii wurde zuvor durch das Fehlen effizienter Methoden zur gezielten Deletionen und Genaustausche bestimmten genetischen Loci begrenzt. Vor kurzem abgeschafft wir den Hauptweg von homologe Rekombination in Typ I und Typ II Stämme von T. gondii durch Löschen des Gens encoding der KU80 Protein 1,2. Die Stämme Δku80 normales Verhalten während Tachyzoiten (akute) und bradyzoite (chronische) Stufen in vitro und in vivo und weisen im Wesentlichen eine 100% Häufigkeit der homologen Rekombination. Die Δ Ku80 Stämme machen funktionellen Genomstudien möglich auf dem Gen als auch auf dem Genom Skala 1-4. Hier berichten wir über Methoden für die Verwendung von Typ I und Typ II Δku80Δhxgprt Stämme Gen-Targeting-Ansätze in T. voranbringen gondii. Wir skizzieren effiziente Methoden zur Erzeugung von Deletionen, Gen-Ersatz, und markierten Gene durch gezielte Insertion oder Deletion des Hypoxanthin-Xanthin-Guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) Selektionsmarker. Die beschriebene Gen-Targeting-Protokoll kann in einer Vielzahl von Weisen in Δku80 Stämme verwendet werden, um funktionelle Analyse des Parasitengenom voranzutreiben und einzelnen Stämme, die Durchführung zu entwickelnmehrere gezielte genetische Manipulationen. Die Anwendung dieser genetischen Verfahren und anschließende phänotypische Assays wird zeigen, grundlegende und einzigartige Aspekte der Biologie von T. gondii und damit verbundene erhebliche personelle Erreger der Malaria (Plasmodium sp.) und cryptosporidiosis (Cryptosporidium) verursachen.

Eine detaillierte Vorlage zum Aufbauen eines Targeting-Plasmid, ein Gen zu löschen, einschließlich der Platzierung von Restriktionsenzymstellen und Erzeugung der Primer, die genetische Targeting und Validierung von Gen-Targeting, sowie Plasmidkonstruktion Erleichterung für den nachfolgenden Löschung HXGPRT in einer dafür vorgesehenen Einstufiges Verfahren (1A-C, 2A, 3A). Ein allgemeines Schema für die Herstellung einer gezielten Gen-Deletion (2A), die Primer-Paare verwendet werden, um die Löschung eines Knockout validieren, zum Beispiel dargestellt, sind Typ I ROP18 (2B) und repräsentative Ergebnisse des PCR-Validierung gezeigt (Abbildung 2C). Diese repräsentatives Ergebnis ist gezeigt, um die Streuung der Ergebnisse, die auf genetischer Loci, die relativ schwer sind Ziel erreicht werden kann, darzustellen. Eine erfolgreich gezielte Gen-Deletion in der Abwesenheit des Gens in FolgeInteresse PCR-Produkt (PCR 1), das Vorhandensein des 3&#39;das genomische Targeting Flanke (PCR2) und die Gegenwart des selektierbaren Markers HXGPRT richtig zwischen 5 integriert und 3&#39;das genomische Targeting Flanken, die die Löschung definieren (PCR3 und PCR4) . Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 und 11 sind gezielte Deletionen (Knockouts), wo HXGPRT die indische Regierung (Abbildung 2C) ersetzt wurde validiert. Ein Klon, der keine einen Gendeletion kann durch eine Vielzahl von Bandenmuster dargestellt werden. Typischerweise wird ein Klon ohne Gen-Deletion die elterliche Stamm (elterlichen Muster) mit Bands für PCR1 und PCR2 beobachtet spiegeln, aber nicht für PCR3 oder PCR4 wie Klone 1 und 2 (Abbildung 2C) gesehen. Diese &quot;elterliche Muster&quot; ergibt sich aus ein paar mögliche Mechanismen. Gelegentlich tragen MPA beständig ausgewählt Parasiten nicht integrierten persistierenden Episomen der pΔGOI Targeting-Plasmid, und wir beachten, dass fortgesetzte Zuchtwahl oft zwingt diese Episomenzu integrieren. Wir beobachten einige seltene Hintergrund in der Typ-I-Δ Ku80 Kräften durch unbeabsichtigte Integration der pΔGOI Targeting Plasmid, das enthält eine HXGPRT cDNA über DHFR 5 &#39;und 3&#39; Promotorelemente, entweder in die DHFR-Locus oder in den teilweise gelöschten HXGPRT ausgedrückt Locus 14. Während dieses seltene Ereignis ist eine gezielte Integration, war es nicht die beabsichtigte Integration und dient als wichtiger Punkt bei der Gestaltung eines Gen-Ersatz-Strategie erinnern. DNA-Homologie größer als 120 bp auf Ihrem pΔGOI durchgeführt Targeting Plasmid kann eine Alternative für die Rekombination in Δ Ku80 Stämme 2, die zurück geben könnte einen unerwünschten Hintergrund. In der Typ-II-Pru Δ Ku80 Stamm diesem Hintergrund wird reduziert oder gar nicht im Vergleich zu Typ I, da die HXGPRT Selektionsmarker auf Typ-I-Sequenzen, die Nukleotid-Polymorphismen haben, wenn sie mit Typ-II-DNA im Vergleich basiert diereduziert diese seltene Hintergrund in Experimenten unter Verwendung der Typ-II-Pru Δ Ku80 Stamm 1. Wenn ein Gen-Locus wesentlich ist (kann nicht gelöscht werden), oder hat einen extrem niedrigen Gen-Targeting-Frequenz an der Stelle, oder wenn persistierende [nicht integrierten] Episomen nicht einfach über Wachstum und Selektion eliminiert, diese elterliche Muster wird das Muster in MPA beobachtet dominieren resistenten Klone. Alternativ wird das Targeting-DNA-Molekül beobachtet, manchmal nur an der 5 &#39;oder 3&#39;-genomische Targeting Flanke und eine Band ist entweder PCR3 oder PCR4 beobachtet (aber nicht beide) zusammen mit PCR1 und PCR2 als für Klon 10 zu sehen (5 integrieren &#39;Integration) und Klon 7 (3&#39; Integration) (Abbildung 2C). Diese Muster deuten die seltenen Auftreten einer einzigen Cross-Over-Integration des Targeting-Plasmid an der Stelle, die HXGPRT integriert aber diese gezielte Integration löscht nicht das Gen von Interesse. Dieses Muster (Spuren 7 &amp; 10 in 2C) emzeigersinn die Notwendigkeit, die PCR-Daten zu berichten, um zu überprüfen, dass die gezielte Integration stattgefunden anstelle eines einzigen homologen überqueren und eine zweite homologe Integration des Zielmoleküls. Selten, beobachten wir eine genetische Mischung von Klon 12 (2C), die sowohl eine elterliche Muster und einen gezielten Löschung Muster stellt vertreten. Dieses Muster wahrscheinlich entsteht gelegentlich von zwei Genotypen, Parasiten an derselben Stelle in einem Klonierungsvektor gut. Ein allgemeines Schema für die Entfernung von HXGPRT von Δ ku80Δgoi :: HXGPRT zu HXGPRT aus dem Stamm löschen dargestellt (Abbildung 3A). Die Primer-Paar verwendet, um das Entfernen von HXGPRT Δ Δ Ku80 GRA2 :: HXGPRT (3B) zu validieren verstärkt eine einzigartige ~ 1,2 kbp Band in PCR5 nach Klone 4, 7, 9, 11 und 12 (Fig. 3C) gesehen. Wenn HXGPRT nicht von dem Ort, a ~ 3 entfernt.4 Kbp Band beobachtet wird (Klone 1, 2, 3, 6, 8, 10, und die elterliche Kontrolle). Mehrere Mechanismen handeln, um die Entfernung von HXGPRT (6TX Auswahl) schwieriger und weniger effizient als die Integration von HXGPRT (MPA + X Auswahl). MPA Auswahl ist einfach effizienter als 6TX Auswahl 14,16. Außerdem werden höhere HXGPRT Ausdruck für 6TX Auswahl als MPA Auswahl 16,24 erforderlich. Folglich können Mutationen, die HXGPRT Enzymaktivität oder Mutationen oder epigenetischen Veränderungen, die die Expression von HXGPRT am Locus eines Gens reduzieren reduzieren kann möglicherweise die Abschaffung der Wirksamkeit 6TX Auswahl. Selbst mit diesen Herausforderungen 6TX Auswahl, ist die Erfolgsquote von 6TX Auswahl Δ Ku80 Stämme mehr als 90% beim ersten Versuch 1-3. Ein allgemeines Schema für die direkte C-terminale Markierung von Protein-kodierenden Gene dargestellt (Abbildung 4). DieseSchema verwendet die direkte Integration über Doppelkreuz über homologe Rekombination HXGPRT 3 &#39;des Gens markiert und auch beschäftigt Validierung ähnliche Strategien wie die oben beschriebenen. Wenn ein Gen, das im Verdacht steht, ein essentielles Gen der Nachweis erbracht, unter Verwendung eines zweiten Transfektion mit einem unabhängig isoliert zielende DNS-Plasmid werden kann. Alternative Methoden, wie z. B. Systeme für regulierte Genexpression, zur weiteren Überprüfung, ob ein Gen ist wichtig 25 verfügbar. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Abbildung 1. Überblick über die Konstruktion eines Targeting-DNA-Plasmid. A. Schema für die Gestaltung überlappen Primer zur PCR zu amplifizieren den 5 &#39;und 3&#39;-Ziel-Flanken mit 33 bp Überlappungen der Shuttle-Vektor pRS416 und HXGPRT Minigen Kassette. Grundierungen im Schaltplan dargestellt warenverwendet, um die 5 &#39;und 3&#39;-Ziel Flanken pΔROP18 10. B. Allgemeine Strategie zur Konstruktion eines Targeting-DNA-Molekül zu erzeugen. Das Rückgrat ist die pΔGOI pRS416 Shuttle-Vektor enthaltenden Uracil (URA) und Ampicillin (AMP) Selektionsmarker. Eingefügt in pRS416 ist a ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-Target-Flanke aus genomischer DNA mit Überlappungen zum HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit den F1 und R1 amplifiziert, a ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-Target-Flanke aus genomischer DNA mit Überlappungen für verstärkte die HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit den F2 und R2 Primer und die HXGPRT Minigen Kassette. Die folgenden einzigartigen Restriktionsenzymverdau Seiten mit den Primern hinzugefügt: RE.X (Restriktionsenzym Schnitt X site) in der F1-Primer an die Plasmid-am 5&#39;-Ende der 5&#39;-DNA-Target-Flanke zu schneiden, in der R2 RE.Y Primer, um das Plasmid an das 3&#39;-Ende der 3&#39;-Ziel-DNA flankieren und RE.Z Schnitt in der R1 und F2 Primer Verbrauchsteuerpflichtige die HXGPRT minigene Kassette. C. Primer-Sequenzen verwendet, um das Targeting-Konstrukt für die Löschung der ROP18 erzeugen. Die fett Regionen T. entsprechen gondii genomische Sequenz und die nonbold Bereiche den Restriktionsenzymstellen und Sequenzen, die mit pRS416 und HXGPRT Minigen Kassette überlappen entsprechen. Die HX_F und HX_R Primerpaar verstärkt das HXGPRT Minigen Kassette 14. Primer lesen von 5 &#39;nach 3&#39;. Tabelle aus Fentress et al 10 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Abbildung 2. Überblick über das Protokoll für die Löschung eines Gens mit HXGPRT. A. Disruption einer indischen Regierung in der Δ ku80Δhxgprt Belastung durch einen Doppel-Crossover homologe Rekombination Veranstaltung mit einem ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-Target Flanke und ein ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-Target-Flanke auf dem Plasmid pΔGOI. Ein PCR-Strategie mit PCR1, PCR2, PCR3 und PCR4 (nicht maßstabsgetreu) wird gezeigt, dass Genotyp Überprüfung ermöglicht, um Klone mit gezielten Integration von HXGPRT und Löschung der indischen Regierung Locus validieren. B. Repräsentative Primerpaare entworfen, um die Löschung der ROP18 validieren . ROP18_DF und ROP18_DR verstärken PCR1, ROP18_ExF und ROP18_CxR verstärken PCR2, ROP18_CxF und DHFR_CxR verstärken PCR3 und DHFR_CxF und ROP18_CxR verstärken PCR4 (siehe Abbildung 2A). Primer lesen von 5 &#39;nach 3&#39;. Tabelle aus Fentress et al 10. C. Repräsentative Ergebnisse der Validierung einer gezielten Gen-Deletion (ROP18) mit HXGPRT angepasst. Nach der Transfektion von Plasmid pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt und Selektion in MPA +X, X + MPA-resistente Klone wurden für die Löschung der ROP18 getestet. Die Elternstammes Kontrolle ist für die PCR-1 (~ 400 bp) und PCR 2 (~ 650 bp) Produkt positiv und negativ für die PCR-3 (~ 1.200 bp) und PCR 4 (~ 1.300 bp) Produkt. Eine gezielte GOI Knockout ist positiv für die PCR2, PCR3 und PCR4 Produkte und ist für die PCR 1 Produkt negativ (siehe Abbildung 2A). Dargestellt sind repräsentative Platten der Ergebnisse PCR1 und PCR2 (oben), PCR3 (Mitte), und PCR4 (unten). Klone, 3, 4, 5, 6, 8, 9 und 11 zeigen die richtige Bandenmuster PCR 1, PCR2, PCR3 und PCR4 die ein Zielgen Lösch-Ereignis in dem Klon definiert. Klone 1, 2, 7, 10 und 12 sind nicht Deletionen und entsprechen andere potenzielle repräsentative Ergebnisse. (C = elterliche Kontrolle Stamm Δ ku80Δhxgprt, M = Größe Marker). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Abbildung 3. Übersicht des Protokolls für Re-Targeting das Gen von Interesse HXGPRT löschen. A. Strategie zur Entfernung des HXGPRT Selektionsmarker durch eine doppelte Crossover-Ereignis der homologen Rekombination in dem Stamm Δ ku80Δgoi :: HXGPRT eine ~ 1 kbp 5 &#39;Ziel-DNA flankieren und ein ~ 1 kbp 3&#39; DNA-Target-Flanke auf dem Plasmid pΔGOIc. Die PCR-Strategie für Genotyp Überprüfung dargestellt unter Verwendung eines Primer-Paares, um Assays für eine PCR-Produkt (PCR5), die die Löschung umfasst (nicht maßstabsgetreu). B. Eine repräsentative Primerpaar konstruiert, um das Entfernen des HXGPRT Selektionsmarker vom GRA2 validieren Locus in Stamm Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Grundierungen GRA2 _CLF und GRA2_CxR verstärken PCR5. Grundierungen<html> Lesen von 5 &#39;nach 3&#39;. C. repräsentativen Auswahl von 6TX-resistenten Klone, die nach Transfektion von Plasmid pΔGOIc erhalten in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT und Auswahl werden kann 6TX. Klone, 4, 7, 9, 11 und 12 zeigen die richtige Bandenmuster PCR5 die gezielte Deletion der HXGPRT Marker (~ 1,2 kbp-Produkt, das umfasst das 3&#39;-Flanke mit geringfügige Überlappung mit dem 5&#39;-Flanke und außerhalb der 3 &#39;entspricht Flanke). Klone 1, 2, 3, 6, 8 und 10 (diese Band Licht) stellen die erwarteten Bandenmuster um ~ 3,4 kbp, die dem elterlichen Klon Genotyp entspricht, auch wenn diese Klone eine gewisse Resistenz zeigten an, die zulässige 6TX ihre Auswahl (dieser Phänotyp kann gelegentlich spontan entstehen durch Abschalten HXGPRT Ausdruck (siehe Hinweis im Protokoll 2.1 (Schritt 8) und Repräsentative Ergebnisse Abschnitt). (C = elterliche Kontrolle Stamm Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = Größe Marker).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Abbildung 4. Konstruktion eines Targeting-DNA-Molekül, um die C-terminalen Ende des Proteins kennzeichnen. Die Strategie beruht auf der Fähigkeit des HXGPRT Marker auch als 3&#39;-regulatorische Region stromabwärts funktionieren basiert. Das Rückgrat ist die pΔGOItag pRS416 Shuttle-Vektor mit Uracil (URA) und Ampicillin (AMP) Selektionsmarker. Eingefügt in pRS416 ist a ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-Target-Flanke aus genomischer DNA mit Überlappungen zum HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit dem Fgoi und RTAG Primer, a ~ 1 Kbp 3 verstärkt&#39; Ziel-DNA Flanke von genomischer DNA mit Überlappungen für verstärkte die HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit der F2 und R2Primer und die HXGPRT Minigen Kassette. Die 5&#39;-DNA-Target Flanke ersetzt die Terminationscodon mit dem Tag (HA, Myc, His, etc.) von einem Ersatz Terminationscodon gefolgt. MPA + X Auswahl integriert die C-terminalen Tags und einer stromabwärts HXGPRT und bewegt das 3&#39;-UTR zu einer Position nach der HXGPRT Marker. Die folgenden einzigartigen Restriktionsenzymverdau Seiten mit den Primern hinzugefügt: RE.X (Restriktionsenzym Schnitt X site) im Fgoi Primer, um das Plasmid an das 5&#39;-Ende der 5&#39;-DNA-Target Flanke geschnitten und in die RE.Y R2-Primer, um das Plasmid am 3&#39;-Ende des 3&#39;-DNA-Target Flanke und RE.Z im RTAG und F2 Primer geschnitten, um die Verbrauchsteuern HXGPRT Minigen Kassette zur Verwendung für Plasmidkonstruktion wieder gezielt das markierte Genlocus löschen die HXGPRT Marker, der die Platzierung der 3 &#39;UTR wiederherzustellen.

Hier berichten wir ein Verfahren zur Verwendung von Typ I und Typ II<em&gt; Δku80</em&gt; Stämme<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Effizient zu erzeugen gezielte Deletionen und Gen-Ersatz für die funktionelle Genomanalyse.

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist ein effizienter und zuverlässiger Genaustausch unter Verwendung von Typ-eins- und Typ-zwei-Delta-zwei-80-Stämmen von Toxoplasmic ndii. Dies wird erreicht, indem zunächst ein gezielter DNA-Molekül konstruiert wird, der den HX GPRT-auswählbaren Marker in vorwärtsgerichteter Orientierung zwischen unterschiedlichen fünf- und drei-prime-genetischen Ziel-DNA-Flanken fusioniert. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das gezielte DNA-Molekül in einen Toxoplasma-DYI-Stamm vom Typ eins oder Typ zwei zu transfizieren.Der dritte Schritt besteht darin, geduldig Doppel-Crossover-Ereignisse der homologen Rekombination auszuwählen und einzelne Klone zu isolieren. Der letzte Schritt ist die Validierung des Vorhandenseins des Gen-Targeting-Ereignisses in den isolierten Mutantenklonen. Letztendlich können die Ergebnisse dieses Verfahrens die Funktion von Parasitengenen durch die Analyse gezielter Gen-Knockouts, Gen-Ersetzungen und Tag-Genen mittels einer Vielzahl nachgeschalteter Anwendungen aufzeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden mit Wildtyp-Stämmen dieses Parasiten liegt darin, dass die Hintergründe des Typ eins und Typ zwei delta zwei 80 Parasiten nun eine äußerst zuverlässige Selektion gezielter Doppel-Crossover-Homolog-Rekombinationsereignisse ermöglichen, um präzise genetisch definierte Stämme herzustellen. Diese Technik wird die Entdeckung neuer Zielstrukturen für Antitoxin-Plasma-Medikamententherapien sowie die Entwicklung sicherer und wirksamer abgeschwächter Impfstammvarianten erheblich beschleunigen, insbesondere in Kombination mit den gut durchdachten genomischen Ressourcen, die online unter @toxodb.org verfügbar sind. Personen, die neu in dieser Methode sind, haben im Allgemeinen Schwierigkeiten bei der Konstruktion gezielter DNA-Moleküle oder genetischer Modifikationen mit Toxoplasma gondii.Jedoch werden die klinische Anwendung und die Entwicklung zuverlässiger Targeting-Moleküle den Erfolg sicherstellen. Beginnen Sie das Protokoll mit der PCR-Amplifikation der fünf- und dreiprime genomischen Targeting-Flanken für das Gen der Wahl aus genomischer DNA. Amplifizieren Sie anschließend den HX GPRT selektierbaren Marker mit seinen fünf- und dreiprime DHFR-Flanken aus der HX GPRT CD NA Minigen-Kassette per PCR.Verwenden Sie die Hefe-Rekombination oder eine ähnliche Methode, um die 3D-NA-Moleküle in ihrer korrekten 5'-zu-3'-Orientierung mit dem Plasmid PRS vier 16 zu verbinden, wodurch das Plasmid p delta GOI entsteht, das die Deletion am Gen der Interesse richtet. Bereiten Sie anschließend eine 100-Mikroliter-Probe mit 15 bis 30 Mikrogramm linearisiertem Targeting-Plasmid zur Transfektion in T gia 68 bis 72 Stunden nach der Inokulation eines 25-Quadratzentimeter-Flasks mit konfluenten HFF-Zellen vor. Überprüfen Sie das Vorhandensein frisch lysierter Parasiten, indem Sie visuell bestätigen, dass 90 bis 95 % der HFF-Zellen lysiert wurden; lebensfähige Parasiten sind für das Gen-Targeting unerlässlich.Schütteln Sie das geschlossene Gefäß kräftig, um die lebensfähigen Parasiten in Lösung zu bringen, wobei verhindert werden muss, dass Flüssigkeit an den Innenseiten des Deckels oder des Flaschenhalses angesammelt wird. Gewinnen Sie die Parasiten aus dem Gefäß und bereiten Sie sie wie im Textprotokoll beschrieben für die Transfektion vor. Elektroporieren Sie das Targeting-Plasmid in den Delta-CO-80-Toxoplasma-Stamm.Überführen Sie das elektroporierte Gemisch in einen 150 cm²-Flasche mit konfluenten HFF-Zellen und 30 ml Infektionsmedium. Inkubieren Sie die infizierte Kultur über Nacht bei 37 °C etwa 20 Stunden nach der Transfektion. Ersetzen Sie das Medium durch MPA plus X Selektionsmedium.Lassen Sie die Parasiten nun ungefähr acht Tage lang ungestört bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald Plaques sichtbar sind, schütteln Sie den Kolben, um extrazelluläre Parasiten von der Monoschicht zu lösen und eine Parasitenlösung zu erzeugen. Übertragen Sie etwa ein halbes Milliliter der Parasitenlösung auf einen neuen 25-Quadratzentimeter-Kolben mit konfluierenden HFF-Zellen, der fünf Milliliter MPA plus X-Selektionsmedium enthält.Bezeichnen Sie diese Kultur etwa drei Tage später als PAs one A. Wiederholen Sie die Übertragung von einem halben Milliliter der Parasitenlösung aus dem ursprünglichen Kolben in einen weiteren Kolben mit HFF-Zellen, der das gleiche Selektionsmedium enthält. Bezeichnen Sie diese Kultur in den folgenden fünf Tagen als PAs one B.Überwachen Sie die Durchgänge A und B für pfu. Wählen Sie entweder Durchgang A oder B für das Subklonieren basierend auf einer ausreichenden Anzahl von mehr als 25 Infektionszonen aus. Sobald die Parasiten die HFF-Zellen lysieren, überführen Sie die Kultur drei Wochen nach der Transfektion in einen neuen 25 cm²-Flasche mit konfluenten HFF-Zellen und Selektionsmedium. Subklonieren Sie frisch infizierte Parasiten, indem Sie die Parasiten auf die geeignete Konzentration in MPA plus X-Medium verdünnen und die Parasitenlösung gleichmäßig auf eine 96-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen verteilen.Bereiten Sie eine Platte mit einer Konzentration von einem Parasiten pro Vertiefung vor und bereiten Sie eine zweite Platte mit einer Konzentration von zwei Parasiten pro Vertiefung vor. Inkubieren Sie beide Platten ab dem ursprünglichen Transfektionsdatum bei 37 Grad Celsius. Subklonieren Sie die Parasiten nicht vor Tag 20 bei Typ-1-Parasiten oder vor Tag 25 bei Typ-2-Parasiten.Führen Sie das Passagieren der 25-Zentimeter-Flasche wöchentlich wie im Online-Text beschrieben fort, bis der Knockout-Stamm validiert wurde. Bewerten Sie nach etwa einer Woche die 96-Well-Platten bei einer 40- bis 60-fachen Vergrößerung. Wählen Sie nur die Wells aus, die einen einzelnen PFU enthalten, der als einzelne Infektionszone identifiziert wurde, unter Verwendung einer Pipette, die auf 50 Mikroliter eingestellt ist.Mischen Sie den Inhalt dieser Vertiefungen, indem Sie den Flüssigkeitsstrom über die PFU lenken, um die Parasiten in der Vertiefung zu verteilen. Vier bis fünf Tage nach dem Mischen der ausgewählten Vertiefungen wählen Sie ein Dutzend Klone mit lysierten Zellen aus. Übertragen Sie 12 Klone von der 96-Loch-Platte auf 12 Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, indem Sie mit der Pipettenspitze über den Boden der Vertiefung kratzen und sechs Mikroliter aufziehen.Überführen Sie die Lösung in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte mit konfluenten HFF-Zellen in einem Milliliter MPA plus X-Selektion. Inkubieren Sie die 24-Loch-Platte bei 37 Grad Celsius und überwachen Sie die Lyse der HFF-Zellen. Passagieren Sie die Parasiten wöchentlich aus einer lysierten Vertiefung der 24-Loch-Platte.Verwenden Sie die Kratz- und Zeichentechnik, um zwei Mikroliter der Parasitenlösung auf eine neue Platte mit MPA und X-Selektion zu übertragen. Nach dem Passieren sammeln Sie die Parasiten aus der ursprünglichen 24-Well-Platte und überführen Sie in kleine Röhrchen zur DNA-Gewinnung.Verwenden Sie abschließend eine PCR, um die Deletion des Gens der Interesse zu überprüfen und somit die Integration der fünfprime und dreiprime Ziel-Sequenzen zu kontrollieren, sowie um den HX GPRT selektierbaren Marker nachzuweisen. Dieses Protokoll dient der Entfernung des HX GPRT Markers aus dem modifizierten delta Q 80 Stamm und ist im Online-Text beschrieben.P delta GOYC zielt auf die Entfernung von HX GPRT aus dem Parasiten durch negative Selektion unter Verwendung von sechs TX-Medien ab. Anschließend wird mittels PCR die Verlustbestätigung von HX GPRT über eine 1,2 Kilobasenpaar große Bande nachgewiesen, wo HX GPRT nicht aus dem Locus entfernt wurde. Es ist eine 3,4 Kilobasenpaar große Bande vorhanden.Der letzte Teil dieses Protokolls, das C-terminale Markieren von Proteinen, wird ebenfalls ausführlich im Online-Text beschrieben. Nach Durchführung des beschriebenen Protokolls zur gezielten Genlöschung wurde die Deletion eines Knockouts vom Typ eins R 18, einem generell schwer zu targetenden Gen, mittels PCR überprüft. PCR 1 zeigt das Fehlen des R 18-Gen-PCR-Produkts.PCR zwei zeigt das Vorhandensein der drei-primär-R-18-genomischen Targeting-Flanke; PCR drei und PCR vier zeigen das Vorhandensein des selektierbaren Markers, der korrekt zwischen den fünf- und drei-primär-genomischen Targeting-Flanken integriert ist, was die R-18-Deletion definiert. Um den selektierbaren Marker für nachfolgende Deletionen in einem Stamm wiederverwenden zu können, muss das ursprüngliche HX-GPRT zunächst aus dem Locus entfernt werden. Nachdem das beschriebene Protokoll befolgt wurde.HX GPRT wurde aus dem gelöschten GRA-Zwei-Lokus im Stamm delta zwei 80 delta GRA zwei HX.G-P-R-T entfernt. HX.G-P-R-T-P-C-R wurde verwendet, um den Verlust von HX GPRT nachzuweisen, der durch ein Band von 1,2 KILOBASE angezeigt wurde. Wenn H-X-G-P-R-T nicht entfernt wurde, war ein Band von 3,4 KILOBASE nach dem ersten Schritt der Genzielansteuerung vorhanden. Zusätzliche Methoden zur Genzielansteuerung können angewendet werden, um mehrfache Knockouts im selben Typ-eins- oder Typ-zwei-Stamm zu erzeugen oder um einen Mutantenstamm zu markieren oder zu komplementieren, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wo lokalisiert dieses Protein in der Zelle?Oder welches ist die entscheidende Domäne oder Aktivität dieses Proteins oder Signalwegs, die seine biologische Funktion erklärt? Diese Technik ebnet Forschern auf diesem Gebiet den Weg, die Erforschung der Genfunktion von Parasiten im Modell des AP-Komplexes und des Parasiten Toxoplasma zu intensivieren. Gandhi Auge.Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Toxoplasma gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Einhaltung aller BSL-2-Richtlinien während des gesamten Verfahrens beachtet werden sollten.

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Research

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