Name: Permeabilisierung der anhaftenden Zellen mit einem Inertgas Jet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Permeabilisierung anhaftender Zellen mit einem Inertgas-Jet für die Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht den effizienten Transfer von Biomolekülen in Säugetierzellen.

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Die Autoren möchten die folgenden Finanzierungsquellen haben: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), der Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC).

1. Entwicklung von LabVIEW-Programm <ol><li> Ein Massendurchflussregler (MKS M100B Masse-Flo-Controller) mit dem Heliumgasleitung angebracht, um eine präzise Gasflussrate zu gewährleisten. Diese Einheit wird von einer Eingangsspannung gesteuert wird, die zwischen 0 und 5 V. Eine Steuerschleife in der LabVIEW-Programm bestimmt die erforderliche Spannung zu einem bestimmten Zeitpunkt. Schnittstelle zwischen dem Computer und der Mengendurchflusssteuerung wird durch eine Datenerfassungseinrichtung (NI USB-6009) durchgeführt und eine 12-V-Stromversorgung versorgt den Massendurchflussregler. </li><li> Zwei Positionierungslinearführungen werden verwendet, um die Bewegung der Platte mit 6 Vertiefungen, einer für jede Richtung zu steuern. Jede Einheit besteht aus einer MA15-Serie Velmex Unislide Versammlung gekoppelt mit einem Schrittmotor und die beiden Baugruppen werden von einem einzigen Velmex VXM Schrittmotor-Controller gesteuert. Der Controller ermöglicht die manuelle Joggen jedes Motors oder akzeptiert eine Reihe von externen seriellen Befehle, deren Kombination ermöglicht gezielte Bewegung patterns. Mehrere Muster können in die LabView-Programm programmiert werden, dass der Benutzer nur die gewünschte Brennergeschwindigkeit sowie die Pfad Abmessungen liefern. </li></ol> 2. Vorbereitung der Ausrüstung <ol><li> Öffnen Sie sowohl die Helium-Flasche und Atemregler. </li><li> Schalten Sie den Motor-Controller. </li><li> Öffnen Sie das LabView Programm und alle Bedingungen zu überprüfen. </li><li> Achten Sie darauf, die Plattform zentriert ist. Um zu überprüfen, sehen sich an Motorstufe und sicherstellen, dass jeder Wagen ist entweder nicht in der Nähe der Bühne Ende. Entweder haben das Programm Mitte die Wagen oder manuell, indem Sie die Jogging-Bedienelemente auf der Vorderseite der Motorsteuerung anpassen. </li><li> Wenn dies der erste Lauf des Tages, ist es empfehlenswert, das Programm einmal ohne Zellen laufen, um sicherzustellen, das Setup richtig funktioniert. </li></ol> 3. Herstellung des Gasstrahls Kapillardüse Höhe <ol><li> Entfernen Sie die Kapillare aus der Halterung und die Höhe Null Zifferblatt. </li><li> Legen Sie die 6-Well-Platte on die Plattform. </li><li> Ersetzen und senken den Gasstrahl Kapillare auf den Grund des Brunnens, bis es das Deckglas trifft. Sichern Sie die Kapillare in die Halterung. </li><li> Über die Höhe Zifferblatt, erhöhen die Kapillare 3 mm. Markieren Sie diese Höhe auf der Kapillare Basis. </li><li> Heben Sie die Kapillare auf eine sichere Höhe und dann die 6-Well-Platte. </li></ol> 4. Zellpermeabilisierung Protokoll <ol><li> Kultur adhärenten Zelllinie, auf Glasabdeckung Konfluenz rutscht in einer 6-Well-Platte mit Standard-Kulturtechniken. Für HeLa-Zellen, Samen Platten mit 6 Vertiefungen mit 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung und Inkubation für 48 h vor der Behandlung. </li><li> Bereiten Sie entsprechende Volumen der Lösung, die das gewünschte Vektor. Für hrGFPII-1, eine Konzentration von 50 ng / ul in 1x PBS bietet eine starke Fluoreszenzsignal in HeLa-Zellen 24 Stunden nach der Transfektion. Für Dextran Studien wird 80 pg / ml 10 kDa grün fluoreszierenden Dextran empfohlen. Von nun an wird diese Lösung zu einer bezeichnets &quot;Vektor-Lösung.&quot; </li><li> Entfernen von Zellkulturmedien von gut und spülen dreimal mit 1x PBS. </li><li> Pipettieren 1370 ul Vektor Lösung in Schritt 4.2 in gut vorbereitet. Dies sollte in einer Flüssigkeitstiefe von ca. 1,3 mm führen. </li><li> Zeigen die auch den Vektor enthaltenden Lösung in der Mitte der Plattform. Senken Sie den Gasstrahl Düse auf die zuvor markierten Ebene einen Düsenhöhe von 3 mm über der Folie angezeigt wird. </li><li> Stellen Helium Strömungsgeschwindigkeit in der LabView-Programm und wählen Sie die gewünschte Bewegungsmuster verwendet werden. Wählen Sie &quot;Ausführen&quot;, wenn Sie bereit sind, um die Permeabilisierung Protokoll beginnen. Es wird eine anfängliche Verzögerungszeit, während der die Massenstrom-Steuer bereitet die notwendige Strömungsgeschwindigkeit bereitzustellen. Sobald die entsprechende Durchflussmenge erreicht ist, wird der LabView-Programm die Schrittmotoren zu aktivieren, die auch in der gewünschten Permeabilisierung Muster zu bewegen. Sobald die Plattform angehalten hat, warten Sie etwa 30 Sekunden und entfernen Sie den Vektor-Lösung.Hinweis: Optimale Permeabilisierung erfolgt an einem Staudruck von 100 bis 200 Pa am Düsenaustritt je nach Durchmesser der Kapillare. </li><li> Gut mit 1x PBS waschen dreimal. </li><li> Füllen gut mit frischem Kulturmedium. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 4,3 bis 4,6 für die gewünschte Anzahl von Experimenten. Hinweis: Achten Sie darauf, Kontrollproben, die von Brunnen, die mit dem Vektor-Lösung ohne den Gasstrahl wird über sie laufen bestehen gefüllt sind. Die Lösung ist in den Kontrollvertiefungen für ca. 1 min dann zu den Schritten 4.5 und 4.6 gehen. </li><li> Arbeiten Sie mit einem hrGFP Transfektionsexperiment, kehren 6-Well-Platte für 24 Stunden Inkubator, damit transfizierten Material von den Zellen transkribiert werden. Wenn Sie mit einem Dextran Permeabilisierung Experiment zurück 6-Well-Platte für 15 min Inkubator. </li></ol> 5. Cell Imaging <ol><li> Wenn gewünscht, unmittelbar vor der Bildgebung, Kontrastfärbung mit entsprechenden Live / Dead-Färbung, um den Zelltod zu evaluieren. </li><li> Bild Zellen mit angemesriate Mikroskop der Transfektion / Permeabilisierung Wirksamkeit zu untersuchen. </li></ol>

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<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
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<li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li>
<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, sie haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Schutzgasstrahl Permeabilisierung ist eine nützliche Technik für adhärenten Zell Transfektion. Es bietet die Möglichkeit, Biomoleküle in Zellen unter Verwendung von mechanischen Kräften, die die Notwendigkeit einer potentiell schädlichen Chemikalien oder virale Vektoren beseitigt übertragen. Die Technik könnte möglicherweise geben Forscher und Kliniker eine effiziente und relativ einfache Möglichkeit, genau Transfektion von Zellen. Die Selektivität der Permeabilisierung ist auch einzigartig so dass die Forscher nur best...

Mit der Entwicklung der Biomedizin und das Verständnis der Zellmechanik, die Lieferung von Biomolekülen in Zellen ist unerlässlich geworden, um viele Forschungsfelder und medizinische Therapien. Verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Fremdmolekülen durch die Plasmamembran und in das Zell-Cytosol einzuführen. Virale, chemische oder mechanische Techniken: Diese können in der Regel entweder als klassifiziert werden. Viral Techniken genetisches Material wie DNA und RNA mittels viraler Vektoren 1 transfizieren. Viral-Techniken sind in der Regel hohe Wirkungsgrade in bestimmten Zelllinien haben, aber sie haben das Potenzial für Immun-und Entzündungsreaktionen 2. Allgemeine chemische Transfektion Methoden gehören Fällung mit Calciumphosphat 3, bakterielle Exotoxine 4 und 5 Lipofektion. Diese Techniken haben sich als wirksam erwiesen, jedoch ergeben sich gewisse Probleme wie Zelltoxizität und Nicht-Spezifität. Weiterhin Techniken wie Calciumphosphate Niederschlag gefunden Transfektion Wirkungsgrade bis zu 70%, aber nur in bestimmten Zelllinien, primären Zellen selten in 6. Dies ist bemerkenswert, da zunehmende Forschungsanstrengungen werden in primären Zellen, insbesondere bei der Gestaltung verschiedene Behandlungen für die klinische Anwendung und die Untersuchung der DNA-Funktion setzen. Zeitliche Unterbrechung der Zellmembran durch mechanische Reize ist eine Alternative zur Einführung von Fremdmolekülen in die Zellen. Techniken umfassen: Mikroinjektion von Molekülen 7, Elektroporation unter Verwendung eines elektrischen Feldes, um die Membran 8,9 stören Sonoporation mit Ultraschallwellen, um die Zellmembran 10-12, Partikelbeschuss stören, wie durch das &quot;Gen-Kanone&quot;, die Teilchen gebunden schießt nachgewiesen Gene in der Zelle 13, und in jüngster Zeit die Anwendung von Schubspannung, die gezeigt worden ist, zeitlich permeabilisiert Säugerzellen 14,15. Obwohl Mechanikeral Methoden vermeiden einige der oben genannten Probleme, werden sie in der Regel durch geringere Wirkungsgrade und sehr komplexen und spezialisierten Setups begleitet. Ein Atmosphärendruck-Glimmentladung Brenner (APGD-t) wurde an der McGill mit dem anfänglichen Ziel der Funktionalisierung von Oberflächen-und Abnahme adhärenten Zellen in vitro 16 entwickelt. Serendipitously wurde entdeckt, dass eine lebend / tot-Färbung verwendet wurde, irgendwie in die von Zellen ohne Permeabilisierung Mittel versetzt entnommen. Außerdem schien dies nur in eingeschränkten Bereichen der Vertiefungen, die mit der Fackel Pfad übereinstimmen passiert aufgetreten. Untersuchung der Permeabilisierung Fähigkeiten des APGD-t fortgesetzt und in Kontrollstudien wurde festgestellt, daß die Träger inerten Gasstrahl des Plasma ohne Anregung war auch in der Lage, Zellen zu permeabilisieren. Dies wider die anfängliche Hypothese, dass die durch den Plasmastrahl reaktiven Spezies vorübergehend das Membranfunktion beeinträchtigt und schlug vor, einfach die mechanischeschen Kräfte waren ausreichend, um Zellpermeabilisierung verursachen. Von hier, in unserem Labor weiter Studien zu versuchen und zu quantifizieren und charakterisieren die Permeabilisierung Effizienz eines inerten Gasstrahl sowie Blick auf seine Fähigkeiten Transfektion 16. Durch diese Untersuchungen wurde gefunden, dass Mikroporen in der Tat in Form der Plasmamembran, und diese Poren neigen dazu, innerhalb von etwa 5 Sekunden 15 verschließen. Wir haben Nützlichkeit der Technik der in vitro und in vivo in der Chorioallantoismembran eines Hühnerembryos zeigten.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>Grün fluoreszierendes Protein für Transfektionsexperimente an HeLa-Zellen</td></tr><tr><td>Dextran, AlexaFluor 488; 10.000 MW, anionisch, fixierbar</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>D22910</td><td>Dextran für Permeabilisierungsexperimente</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>L3224</td><td>zur Gegenfärbung von Säugetierzellen</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>zum Einbetten von Objektträgern bei der Bildgebung</td></tr> von <tr><td>ultrahochreinem Helium</td><td>Praxair Canada Inc.</td><td>HE 5.0UH-T</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/Medien mit hohem Glukosegehalt - 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>für HeLa-Zellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Für DMEM-Medien</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, flüssiges</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Für DMEM-Medien</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>Hergestellt im Labor</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabelle 1. Liste der erforderlichen Reagenzien</td></tr><tr><td>6-Well Clear TC-behandelte Mikroplatten</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>#1 22 x 22 Deckgläser</td><td>Fisher</td><td>12-542B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>WPI Dimensionierungsinformationen</td></tr><tr><td>ID (mm): 1, 0,86, 0,68, 0,5 Bestellnummer #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masse-Flo-Regler</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>Massendurchflussregler, Serie M100B, erfordert ein externes 12-V-Netzteil</td></tr><tr><td>USB-6009 Datenerfassungsgerät</td><td>National Instruments</td><td>779026-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UniSlide-Baugruppe mit Schrittmotor und Steuerung</td><td>Velmex</td><td></td> Zwei <td>Serien MA15 UniSlide-Baugruppen, ausgestattet mit Vexta 1,8" Schrittmotoren von Velmex und gesteuert von einer VXM-Schrittmotorsteuerung</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabelle 2. Liste der benötigten Geräte</td></tr></tbody></table>

permeabilisierung der anhaftenden zellen mit einem inertgas jet

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Verschiedene Zell Transfektion Techniken existieren und diese können bis zu drei Kategorien unterteilt werden: Virus-, chemische und mechanische. Dieses Protokoll beschreibt ein mechanisches Verfahren zur zeitlich permeabilisiert adhärenten Zellen unter Verwendung eines inerten Gasstrahl, der die Übertragung von in der Regel nicht durchlässig Makromolekülen in Zellen erleichtern können. Wir glauben, dass diese Technik durch Verleihen von Scherkräften an der Plasmamembran von adhärenten Zellen, was die temporäre Bildung von Mikroporen. Wenn diese Poren erzeugt werden, werden die Zellen dann durchlässig genetische Material und anderen Biomolekülen. Die beteiligten mechanischen Kräfte nicht Gefahr laufen, dauerhaft beschädigen oder Ablösen Zellen von ihrem Substrat. Es ist daher ein enger Bereich des inerten Gasdynamik in denen die Technik effektiv ist. Eine inerte Gasstrahl hat bei permeabilisierenden verschiedenen adhärenten Zelllinien, einschließlich HeLa, HEK293 und menschlichen Bauchaorta-Endothelzellen effizient erwiesen. Dieses Protokoll für die p angemessenermeabilization von adhärenten Zellen in vitro und, wie wir gezeigt haben, in vivo, welche es für die Forschung und möglicherweise in zukünftige klinische Anwendungen verwendet werden. Es hat auch den Vorteil, permeabilisierenden Zellen in einem räumlich restriktiv, was beweisen könnte, um ein wertvolles Forschungsinstrument sein.

Permeabilisierung von HeLa-Zellen mit 10 kDa grün fluoreszierenden Dextran mit einem Heliumgasstrahl mit einem Innendurchmesser von 0,86 mm Kapillare ist in Fig. 1 gezeigt. Die Zellen wurden unmittelbar nach Permeabilisierung mit 2 ul / ml EthD-1-Lösung (LIVE / DEAD Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit), um den Zelltod zu visualisieren gegengefärbt. Unmittelbar nach Gegenfärbung wurden die Deckgläser angebracht und abgebildet. Diese Figur zeigt Ergebnisse der Ausführung des Heliumgasstrahl auf drei versc...

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die vorübergehende Permeabilisierung der adhärenten Zellen unter Verwendung eines inerten Gasstrahl. Diese Technik erleichtert die Übertragung von genetischem Material und Biomolekülen in adhärente Säugetierzellen durch die Verwendung von mechanischen Kräften, um die Plasmamembran zu stören.

Permeabilisierung der anhaftenden Zellen mit einem Inertgas Jet

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, adhärente Zellen permeabilisierbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst experimentelle Zellen auf Deckgläsern in 6-Loch-Platten kultiviert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit 1× PBS zu waschen und sie mit der Lösung zu bedecken, die das in die Zelle zu übertragende Biomolekül enthält.Danach wird der Inertgasstrom darübergeleitet. Die Probe durchdringt die Zellen. Der letzte Schritt besteht gegebenenfalls in der Fixierung und Färbung der Zellen.Schließlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Permeations-Effizienz und Zellviabilität nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie Proliferations- oder Genkanonen-Verfahren liegt darin, dass sie einfach einzurichten ist und eine räumlich begrenzte Permeation von adhärenten Zellen ermöglicht. In einer Kultur haben Anfänger dieser Technik im Allgemeinen Schwierigkeiten, da es einige Zeit in Anspruch nehmen kann, bestimmte Parameter wie die Gasflussrate oder den Kapillardurchmesser für eine effiziente Permeation in ihren spezifischen Anwendungen zu optimieren.Der in diesem Verfahren verwendete Massendurchflussregler erfordert eine externe 12-Volt-Stromversorgung und ist an eine Heliumgasleitung angeschlossen, um eine präzise Gasdurchflussrate sicherzustellen. Die Schnittstelle zwischen dem Massendurchflussregler und dem Computer wird über ein Datenerfassungsgerät hergestellt. Diese Einheit wird durch eine Eingangsspannung im Bereich von null bis fünf Volt gesteuert. Eine Regelungsschleife im LabVIEW-Programm bestimmt jederzeit die erforderliche Spannung.Zwei Positionier-Linearschlitten werden verwendet, um die Bewegung der sechswelligen Platte in jede Richtung zu steuern. Jede Baugruppe besteht aus einer MA-15-Serie-Velm-X-uni-Schlittenbaugruppe, die mit einem Schrittmotor gekoppelt ist, und beide Baugruppen werden von einem einzigen VELM-XVXM-Schrittmotor-Controller gesteuert. Der Controller ermöglicht das manuelle Schrittweises Bewegen jedes Motors oder akzeptiert eine Reihe externer serieller Befehle.Die Kombination, die spezifische Bewegungsmuster ermöglicht. Mehrere Muster können in das Lab-View-Programm programmiert werden, wobei der Benutzer lediglich die gewünschte Brennergeschwindigkeit sowie die Pfadabmessungen angeben muss. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Ausrüstung, indem Sie sowohl die Heliumflasche als auch den Regler öffnen, und schalten Sie die Motorsteuerung ein.Öffnen Sie das Laboransicht-Programm und überprüfen Sie alle Bedingungen. Stellen Sie anschließend sicher, dass die Plattform zentriert ist, um eine Überprüfung durchzuführen. Sehen Sie sich jede Motoreinheit an und vergewissern Sie sich, dass sich jeder Schlitten nicht in der Nähe eines der beiden Enden der Einheit befindet, und lassen Sie dann das Programm die Schlitten zentrieren.Wenn dies der erste Versuch des Tages ist, wird empfohlen, das Programm einmal ohne Zellen laufen zu lassen, um sicherzustellen, dass der Aufbau korrekt funktioniert. Um die Höhe der Gas-Jett-Kapillardüse vorzubereiten, nehmen Sie die Kapillare aus dem Halter und stellen das Höhenskalenrad auf Null. Stellen Sie die sechswellige Platte auf die Plattform.Ersetzen Sie die Kapillare des Gasstrahls und senken Sie sie bis zum Boden der Vertiefung ab, bis sie die Deckglasunterlage berührt. Sichern Sie die Kapillare im Halter mithilfe des Höheneinstellrads. Heben Sie die Kapillare um drei Millimeter an und markieren Sie diese Höhe am Kapillarenfuß.Abschließend heben Sie die Kapillare auf eine sichere Höhe und nehmen dann die 6-Well-Platte heraus. Die adhärente Zelllinie für dieses Protokoll sollte bis zur Konfluenz auf Deckgläsern in einer 6-Well-Platte mittels standardmäßiger Kultivierungstechniken für Helo-Zellen kultiviert werden. Säen Sie 6-Well-Platten mit jeweils zwei mal 10 hoch 5 Zellen pro Vertiefung aus und inkubieren Sie diese 48 Stunden vor der Behandlung.Am Tag der Behandlung bereiten Sie ein geeignetes Volumen einer Lösung vor, die den gewünschten Vektor enthält. Für Dextrin-Studien wird 80 Mikrogramm pro Milliliter 10-Kilodalton-grün fluoreszierendes Dextrin empfohlen, wie zuvor angegeben. Diese Lösung wird als Vektorlösung bezeichnet.Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus einer Vertiefung und spülen Sie dreimal mit jeweils 1.370 Mikrolitern Vektorlösung nach. Dies sollte eine Flüssigkeitstiefe von etwa 1,3 Millimetern ergeben. Stellen Sie die Vertiefung mit der Vektorlösung in die Mitte der Plattform.Senken Sie die Gasstrahldüse auf die zuvor markierte Höhe, die einen Düsenabstand von drei Millimetern über dem Objektträger anzeigt. Stellen Sie die Heliumflussrate im LabView-Programm ein und wählen Sie das gewünschte Bewegungsmuster aus. Wählen Sie „Ausführen“.Wenn Sie bereit sind, mit dem Permeationsprotokoll zu beginnen, gibt es eine anfängliche Verzögerungsphase, während der der Massendurchflussregler den erforderlichen Durchfluss einstellt. Für den Erfolg dieses Protokolls ist es wichtig, die Strömungsbedingungen zu optimieren, um die Zelltiefe und Zellablösung zu minimieren. Sobald die geeignete Durchflussrate erreicht ist, aktiviert das Lab-View-Programm die Schrittmotoren, um die Vertiefung im gewünschten Permeationsmuster zu bewegen. Sobald die Plattform angehalten hat, nehmen Sie die sechswellige Platte von der Plattform. Warten Sie etwa 30 Sekunden und entfernen Sie dann die Vektorlösung. Waschen Sie die Vertiefung dreimal mit PBS. Nach dem dritten Waschschritt füllen Sie die Vertiefung mit frischem Kulturmedium.Wiederholen Sie das Permeationsprotokoll für die gewünschte Anzahl von Experimenten. Stellen Sie sicher, dass Kontrollproben enthalten sind, bei denen die Vertiefungen mit der Vektorlösung gefüllt werden, ohne dass der Gasstrahl darüber geleitet wird. Lassen Sie die Lösung in den Kontrollvertiefungen etwa eine Minute lang stehen, bevor Sie die Lösung entfernen.Die Zellen mit PBS waschen und die Vertiefung mit frischem Kulturmedium auffüllen. Die 6-Loch-Platte für den Fall der Inkubation zur Dextrin-Permeation für 15 Minuten in den Inkubator zurückstellen. Anschließend die Zellen mit dem geeigneten Mikroskop aufnehmen, um die Permeabilitätswirksamkeit zu untersuchen.Gezeigt sind hier die Ergebnisse der Permeabilisierung von Helo-Zellen mit 10 Kilodalton grün fluoreszierendem Dextrin unter Verwendung eines Helium-Gasstrahls mit einem inneren Durchmesser von 0,86 Millimetern. Die Kapillarpanele A, B und C zeigen die Ergebnisse bei Betrieb des Helium-Gasstrahls bei drei unterschiedlichen Auslassdrücken, während Panel D eine Kontrolle darstellt, bei der Dextrin zugesetzt wurde, die Zellen jedoch keiner Helium-Gasstrahl-Behandlung ausgesetzt waren. Die Zellen wurden unmittelbar nach der Permeabilisierung gegengefärbt, um Zelltod sichtbar zu machen. In diesen Aufnahmen fluoresziert Dextrin grün und tote Zellen fluoreszieren rot.Es wurde beobachtet, dass in den Abbildungen A und B die Breite und Effizienz der Permeationsbahnen mit steigendem dynamischem Druck zunahmen, wobei der Zelltod nur geringfügig anstieg. Sobald jedoch ein hoher dynamischer Druck erreicht war, wie in Abbildung C zu sehen, wurden HeLa-Zellen von den Deckgläsern abgelöst, und es trat mittels Rasterelektronenmikroskopie kaum eine periphere Permeation auf. Es wurden Mikroporen in der Zellmembran beobachtet.In diesem Beispiel wurde die Permeation von HeLa-Zellen mithilfe eines Helium-Gas-Jetts mit einer Kapillare mit einem inneren Durchmesser von 0,86 Millimetern und einem Auslassdruck von 300 Pascal durchgeführt. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen mit einer Vergrößerung von 50.000× wurden angefertigt. Abbildung A zeigt eine Kontrollprobe mit glatter Zelloberfläche, während Abbildung B die Oberfläche einer permeabilisierten Zelle zeigt, die einen Pore mit einem Durchmesser von 84 Nanometern aufweist. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, sollte sie bei korrekter Durchführung 15 bis 30 Minuten dauern. Im Anschluss an das Verfahren können Färbungen durchgeführt werden, um zusätzliche Parameter wie die Zellviabilität zu beurteilen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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