Name: Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Erfahren Sie die mikrofluidische Sauerstoffmodulation zur Untersuchung intermittierender Hypoxie in pankreatischen Inseln. Diese Methode ermöglicht präzise, dynamische Steuerung und Echtzeitüberwachung für verbesserte Einblicke in die Islet-Physiologie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von den National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416 (DTE) und dem Chicago Diabetes Project.

1. Vorbereiten der Mausinseln
<ol>
	<li>Desezieren Sie C57BL/6-Mäuse und isolieren Sie Inselzellen durch Kollagenaseverdau und Ficoll-Dichtegradiententrennung. (Siehe die in2,3 genannten JOVÈ-Artikel).</li>
	<li>Inkubieren Sie Inselzellen in RPMI-1640-Medium, das 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 20 mM HEPES enthält, in Petrischalen (37 °C, 5 % CO2). Nach der Isolierung werden die Inselzellen 24 Stunden lang kultiviert, bevor sie in Experimenten verwendet werden. Verwenden Sie die Inseln innerhalb von 1-2 Tagen, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.</li>
</ol>
2. Erstellen der mikrofluidischen Plattform
<ol>
	<li>Generieren Sie die Mikrostrukturgeometrien auf Transparenz-Fotomasken für jede Geräteschicht: 1) Einlass und Auslass, 2) Glukose-Mikrofluidikschicht mit Perifusionskammer (8 mm Durchmesser x 3 mm, 150 μl), 3) 200 μm Membran mit Mikrowells (500 μm Durchmesser, 100 μm Tiefe) und 4) Gasmikrofluidikschichten.</li>
	<li>Zur Herstellung der Einlass- und Auslassschicht entgastes, vorgemischtes PDMS bis zu einer Höhe von 1,5 mm in eine leere Petrischale gießen und 2 Stunden lang bei 80 °C aushärten. Stanzen Sie die Ein-/Ausgänge mit einem Durchmesser von 2 mm.</li>
	<li>Um die mikrofluidische Glukoseschicht herzustellen, drehen Sie zwei 350-μm-Schichten aus SU8-2150 zu einer einzigen 700-μm-Schicht auf einem 4-Zoll-Siliziumwafer.
	<ol>
		<li>Belichten Sie UV-Licht durch die entsprechende Fotomaske, um das Mikrokanalmuster nach der Entwicklung auf den SU8 zu übertragen, wodurch ein 700 μm hoher Master entsteht.</li>
		<li>Gießen Sie entgastes, vorgemischtes PDMS auf eine Höhe von 3 mm und härten Sie es bei 80 °C für 2 Std. Schneiden Sie dieses PDMS mit einer Rasierklinge in Form.</li>
		<li>Stanzen Sie die Ein-/Ausgangsanschlüsse mit einem Durchmesser von 2 mm sowie die Kammer mit einem Durchmesser von 8 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um die 200-μm-Membran mit Mikrowells herzustellen, drehen Sie SU8-2100 auf 100 μm. Wenden Sie die gleiche UV-Lithographie an, um Mikrotitermuster auf diesen 100 μm hohen Master zu übertragen.
	<ol>
		<li>Schleudern Sie entgastes, vorgemischtes PDMS bei 900 U/min für 30 Sekunden auf diesen Master und härten Sie 10 Minuten lang bei 80 °C aus. Schleudern Sie unter den gleichen Bedingungen eine zweite Schicht auf die erste, wodurch eine 200 μm PDMS-Membran mit Mikrotitermustern entsteht.</li>
		<li>Stanzen Sie Ein-/Ausgangsanschlüsse mit einem Durchmesser von 2 mm durch diese Membran</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um die gasmikrofluidische Schicht herzustellen, drehen Sie SU8-2100 auf 100 μm. Wenden Sie die gleiche UV-Lithographie an, um gasmikrofluidische Muster auf diesen 100 μm hohen Master zu übertragen.
	<ol>
		<li>Gießen Sie entgastes, vorgemischtes PDMS auf eine Höhe von 1,5 mm und härten Sie es bei 80 °C für 2 Std. Schneiden Sie das PDMS mit einer Rasierklinge in Form.</li>
		<li>Stanzen Sie Ein-/Ausgangsanschlüsse mit einem Durchmesser von 2 mm durch diese Schicht</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um die mehreren Schichten zu verbinden, bereiten Sie sie vor, indem Sie sie mit Klebeband reinigen, dem Koronalichtbogen aussetzen und dann von Hand in der folgenden Reihenfolge ausrichten.
	<ol>
		<li>Kleben Sie die Membran mit den Mikrowells nach oben mit der unteren Gasschicht zusammen.</li>
		<li>Kleben Sie die Glukose-Mikrofluidik auf die Mikrotitermembran.</li>
		<li>Verkleben Sie die Ein- und Auslassschicht ganz oben und kapseln Sie die gesamte Baugruppe.</li>
		<li>Verstärken Sie die Verklebung, indem Sie 1 kg Gewicht darauf geben und 3 Stunden lang bei 100 °C backen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Führen Sie einen Dichtheitstest des fertigen Geräts durch, indem Sie Wasser in die wässrige Schicht laden und dann das gesamte Gerät unter Wasser tauchen. Lassen Sie dann mit einer leeren Spritze Luft durch die Gasschicht strömen.</li>
	<li>Sterilisieren Sie auslaufsichere Geräte mit 70 % Ethanol durch die wässrige Schicht und spülen Sie sie dann mit PBS-Puffer, in dem das Gerät bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert wird.</li>
</ol>
3. Aufbau des Mikrodispensers
<ol>
	<li>Besorgen Sie sich 2 Mikrodispenser, 5-V- und 20-V-Gleichstromnetzteile und eine digitale I/O-Platine, um das Setup für die Sauerstoffmischung und -abgabe zu konstruieren.
	<ol>
		<li>Verbinden Sie die Steuerleitungen der Mikrodispenser mit den mitgelieferten Treibereinheiten.</li>
		<li>Schließen Sie die Treiber an die digitale I/O-Karte an Anschlüssen an, die den Labview-Steuerungen entsprechen.</li>
		<li>Verbinden Sie die 5-V- und 20-V-Netzteile mit entsprechenden Kontakten an den Antrieben.</li>
		<li>Schließen Sie die digitale I/O an einen Laptop an, um Labview-Codes für die Gasregelung auszuführen (Anhang).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schließen Sie einen Mikrodispenser an Stickstoff und einen anderen an Druckluft an, beide mit 5 % CO2. Stellen Sie beide Gase auf 2 psi ein. Schließen Sie die Ausgänge der Dispenser an eine T-Überschneidung an, bevor Sie in das mikrofluidische Gerät gelangen.</li>
	<li>Bestimmen Sie mit einem dichtheitsgeprüften Gerät das transiente Verhalten der Sauerstoffmodulation, indem Sie die Mikrodispenser zwischen 5 und 21 % Sauerstoff wechseln, während Sie den gelösten Sauerstoff im Wasser mit einem faseroptischen Sauerstoffsensor messen (siehe Geräteliste und repräsentative Ergebnisse).</li>
</ol>
4. Einrichten an der Mikroskopie
<ol>
	<li>Montieren Sie das Gerät auf dem beheizten Tisch am inversen Mikroskop.</li>
	<li>0% und 21% O2 -Gase an das Gerät anschließen und mit dem Sauerstoffsensor kalibrieren.</li>
	<li>Verbinden Sie den Ausgangsanschluss der Glukose-Mikrofluidik mit einem Fraktionssammler</li>.
	<li>Bereiten Sie den Krebs Ringer Bicarbonat-Puffer (KRB) vor: 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2,2H 2O, 1,2 mM MgSO4,7H 2O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40, 2 mM Basalglukose und 5 % FBS.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei Pufferlösungen mit 2 mM bzw. 14 mM Glukose in konischen 50-ml-Röhrchen vor, die in einem 37 °C warmen Wasserbad gebadet sind.</li>
	<li>Schließen Sie eine Peristaltikpumpe an, um Puffer mit 250 μl/min in den Schlauch zu ziehen. Leiten Sie den Schlauch über eine 37 °C heiße Platte, bevor Sie in das mikrofluidische Gerät gelangen.</li>
	<li>Um die Inseln zu färben, fügen Sie Fura-2 AM in DMSO und Rh123 in 100 % Ethanol zu 2 ml KRB hinzu, um endgültige Farbstoffkonzentrationen von 5 μM bzw. 2,5 μM zu erreichen.</li>
	<li>Die Inselzellen mit einer 10 μl Pipette aufnehmen und 30 min bei 37 °C in Farbstoffen inkubieren.</li>
	<li>Laden Sie ca. 20 Inselzellen über den Glukose-Mikrokanal-Einlass in das Gerät. Leiten Sie die Inselzellen in die Kammer, indem Sie den Puffer vom Auslass zurück in den Einlass anfüllen.</li>
	<li>Perfundieren Sie die Inselzellen 10 Minuten lang mit Puffer, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen.</li>
</ol>
5. Gleichzeitige Sauerstoff- und Glukosestimulation durchführen
<ol>
	<li>Geben Sie einen Glukosestimulationsimpuls mit 5 Minuten Ausgangswert ab, der von KRB2 festgelegt wurde, gefolgt von 15 Minuten 14 mM-Stimulation, dann waschen Sie sich 15 Minuten lang in KRB2.</li>
	<li>Aufzeichnung einer Anregungswellenlänge von 340/380 nm für Fura-2 und einer 534-Emission für Rh123.</li>
	<li>Führen Sie vor jedem Experiment Messungen eines normalen Pulses (14 mM Normoxik) durch.</li>
	<li>Bei der Sauerstoffmodulation (Hypoxie/intermittierende Hypoxie) wird nur während der Stimulations- und Waschschritte ein Pufferfluss und in den anderen Schritten kein Fluss angewendet, um konvektive Störungen zu minimieren.</li>
	<li>Sammeln Sie die Abwässer aus dem Glukoseauslass in Abständen von 1 Minute für den ELISA-Insulintest.</li>
</ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die verschiedenen Modalitäten, die in dieser Inselhypoxie-Technik integriert sind, stellen hier mehrere Punkte zur Fehlerbehebung dar. Zunächst werden die isolierten Inseln in Kultur durch Verdauungsenzyme aus Azinuszellen weiter abgebaut und zerfallen. Die Standardisierung von Experimenten auf 1-2 Tage nach der Isolierung der Inselzellen ist daher entscheidend, um konsistente Ergebnisse zu erhalten. Zweitens wurde die wässrige Strömung während der Hypoxie und der intermittierenden Hypoxie gestoppt, um eine konvektive Cl...

Dynamische Hypoxie ist wichtig in der Biologie, speziell für Inseltransplantate
Dynamische Hypoxie ist ein wichtiger physiologischer sowie pathophysiologischer Parameter in vielen biologischen Geweben. Die Veränderung des Sauerstoffs zum Beispiel ist ein starkes Entwicklungssignal bei der Angiogenese. Darüber hinaus modulieren räumliche und zeitliche Muster bei Hypoxie HIF1-alpha und spielen eine Rolle bei Erkrankungen wie Bauchspeicheldrüsenkrebs. Hypoxie ist auch ein Störfaktor, der die Ergebnisse von Inseltransplantationen beeinflusst. In jüngster Zeit haben zeitlich oszillierende Oszillationen der Hypoxie oder intermittierende Hypoxie (IH) Vorteile bei der "Präkonditionierung" von Inselzellengezeigt 1. Sowohl die statischen als auch die transienten Hypoxieeffekte auf die Physiologie der Inselzellen sind jedoch noch nicht gut verstanden oder untersucht, was vor allem auf den Mangel an geeigneten Werkzeugen zur Kontrolle der Mikroumgebung der Inselzellen zurückzuführen ist.
Inselchen sind in vivo gut vaskularisiert
Pankreasinseln sind 50-400 μm große kugelförmige Aggregate endokriner Zellen, einschließlich Beta-Zellen und Alpha-Zellen, die für die Glukosehomöostase verantwortlich sind. Wenn Inselzellen stimulierender Glukose im Blut ausgesetzt sind, führen Aufnahme und Glykolyse zur ATP-Produktion, die ATP-empfindliche Kaliumkanäle (KATP) öffnet und zu einem Kalziumeinstrom führt, der die Exozytose von Insulingranula auslöst. Sauerstoff ist wichtig, um diesen stark metabolischen Prozess anzutreiben, und die Insulinsekretion wird neben den Glukosegradienten auch maßgeblich von der Dynamik des Blutflusses und der Sauerstoffversorgung beeinflusst. Inselzellen führen diese Glukose-Insulin-Reaktion in vivo leicht durch, da sie in der Bauchspeicheldrüse stark durchblutet sind, jede innerhalb einer Zelllänge von einem Kapillargefäß entfernt. Das dichte Netzwerk der Intraislet-Kapillaren wird jedoch während der Inselisolierung durch Kollagenase entfernt2,3. Folglich sind sowohl die Sauerstoff- als auch die Nährstoffversorgung aufgrund von Diffusionsbeschränkungen auf einen Umfang von 100 μm beschränkt.
Aktuelle Techniken haben nur begrenzten Erfolg bei der Nachbildung der Mikroumgebung der Inselzellen
Die Nachbildung der nativen Sauerstoff- und Glukosedynamik der Insel, die für die Modellierung physiologischer und pathophysiologischer Bedingungen von entscheidender Bedeutung ist, ist mit standardmäßigen hypoxischen Kammern, die eine aufwendige Strömung erfordern und die kontinuierliche Überwachung der Inselfunktionen fehlen, schwer zu erreichen. Darüber hinaus setzen Transplantationstherapien für Typ-I-Diabetes isolierte Inselzellen einer Hypoxie im hepatischen Pfortadersystem4 aus, das im Vergleich zur physiologischen Bauchspeicheldrüse (5,6 %, 40 mmHg) einen viel niedrigeren pO2 (<2%, 5-15 mmHg) aufweist. Nach der Transplantation dauert es zwei Wochen oder länger, bis die Inseltransplantate revaskularisiert werden. Es wurde gezeigt, dass hypoxische Exposition den Glukose-Insulin-Kopplungsmechanismus der Inselzellen beeinträchtigt. Unter den Stimulus-Sekretions-Kopplungsfaktoren können die Kalziumsignalgebung, die mitochondrialen Potentiale und die Insulinkinetik mit Hilfe der Mikrofluidik leicht überwacht werden. Unsere bisherige mikrofluidische Technik demonstrierte diese Echtzeitüberwachung mit präziser Modulation der wässrigen Mikroumgebung um die einzelne Insel5,6. Die Quantifizierung der hypoxischen Beeinträchtigung der Inselzellen wird jedoch durch das Fehlen gleichzeitiger Stimulations- und Überwachungstechniken behindert. Daher kann die Kombination von mikrofluidischer Kontrolle von Sauerstoff und Inselüberwachung die Hypoxie-Studien der Inselzellen verbessern.
Mikrofluidik kann die wässrige und sauerstoffhaltige Mikroumgebung nachbilden und modulieren
Die Standardtechnik für Gewebe- und Kultur-Hypoxie-Studien basiert auf hypoxischen Kammern. Im Allgemeinen liefern die hypoxischen Kammern einzelne Sauerstoffkonzentrationen mit Äquilibrierungszeiten von ~10-30 min, was mit einer minutenskalierten dynamischen Hypoxie unvereinbar ist. In zwei neueren Studien wurden kleine benutzerdefinierte Kammern für die intermittierende Hypoxie-Exposition an ganzen Mäusen verwendet, mit widersprüchlichen Ergebnissen zur Glukose-induzierten Insulinreaktion7,8. Beachten Sie, dass auf der Ebene des gesamten Tieres der eingeatmete Sauerstoff aufgrund von Kontrollen im Atmungssystem nicht direkt in die Inselkapillaren pO2 übersetzt wird. Darüber hinaus verfügen diese Studien weder über standardisierte Sauerstoffgehalte noch liefern sie Echtzeitmessungen auf Gewebeebene von Inselzellen.
Auf der anderen Seite kann die Sauerstoff-Mikrofluidik diese Einschränkungen überwinden, indem sie Sauerstoff über Gaskanalnetzwerke steuert. Darüber hinaus ist die Mikrofluidik mit der Live-Bildgebung während der Sauerstoffmodulation kompatibel, eine Leistung, die derzeit mit standardmäßigen hypoxischen Kammern nicht möglich ist. Eine Reihe dieser neuartigen mikrofluidischen Ansätze nutzt die Gasdurchlässigkeit von Polydimethylsiloxan, um Sauerstoffkonzentrationen in Mikrokanälen aufzulösen, die Medien über die Zielzellen9-14 strömen. Diese Bausteine haben auch mehrere diskrete Sauerstoffkonzentrationen, fluoreszenzbasierte Sauerstoffsensoren und sogar chemische Sauerstofferzeugung auf dem Chip integriert.
Auf flüssiger Solvatation basierende Mikrofluidik hat es schwer, stabile, kontinuierliche Gradienten aufrechtzuerhalten, da sie auf konvektives Mischen angewiesen ist, das empfindlich auf Strömungsbedingungen reagiert. Im Vergleich dazu konzentriert sich die Technik, die wir hier verwenden, darauf, den Diffusionsweg der Sauerstoffzufuhr zu verringern. Die Gassolvatation und die Scherströmung werden eliminiert, indem Sauerstoff direkt über eine Membran diffundiert wird, die mit Zellen oder Inselgewebe besiedelt ist. Dadurch entfällt die zusätzliche Mikrofluidik, die zur Kontrolle der Solvatation erforderlich ist, und es werden unnötige Scherspannungen auf den Inseln vermieden, die selbst die Insulinfreisetzung auslösen können. Diese Plattform wurde verwendet, um die Hochregulierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowohl bei hyperoxischen als auch bei hypoxischen Extremen (2-97% O2) in Zellkulturen zu demonstrieren1,15. Aufgrund der direkten Abgabe von Sauerstoff und der Entfernung von Scherströmungen bietet unsere diffusionsbasierte Plattform die optimale mikrofluidische Lösung für die Untersuchung von Inselhypoxie.
Multimodale Stimulation und Überwachung
Diffusionsbasierte Mikrofluidik bringt auch zusätzliche Vorteile, wenn sie für das Studium der Mikrophysiologie von Inselzellen geeignet ist. Durch die Verwendung einer Membran als Diffusionsbarriere kann die Flüssigkeit von den Sauerstoffmodulationen isoliert werden, was eine Steuerung der wässrigen Glukosestimulation unabhängig von hypoxischen Stimulationen ermöglicht. Dadurch entsteht eine sandwichartige simultane Stimulation, die die Abgabe an die Inseln räumlich lokalisiert. Da das Gas über computergesteuerte Mikroinjektoren zeitlich moduliert wird, können wir außerdem die Sauerstoffkonzentration von 21-0% digital modulieren, wobei die Transientenzeit weniger als 60 Sekunden beträgt. Die dynamische Steuerung der Sauerstoff- und Glukosemikroumgebung am Mikroskop ermöglicht ein multimodales Echtzeitprotokoll, das mit Standard-hypoxischen Kammern nicht möglich oder außerordentlich umständlich wäre. Mit diesem Gerät wurden die Kalziumsignalgebung (Fura-AM), die mitochondrialen Potentiale (Rhodamin 123) und die Insulinkinetik (ELISA) überwacht, um ein vollständiges Bild der dynamischen Glukose-Insulin-Reaktion unter Hypoxie zu erhalten.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Reagenz/Material</td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8 MicroChem</td><td></td><td>SU8-2150/SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>Digital Hotplate</td><td>PMC Dataplate</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>UV-Härtungslampe</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>Dow Chemical</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Corona Wand</td><td>ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkammer</td><td>Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodispenser</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr><td>5 V und 20 V DC Power</td><td>Radio Shack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>National Instrument</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffsensor</td><td>Ocean Optics</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>Fraktionssammler</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konische Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 Fluoreszenzfarbstoff-Molekularsonden</td><td>, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin 123 Fluoreszenzfarbstoff-Molekularsonden</td><td>, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nährmedien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 Zoll Silikonschläuche</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 Zoll x 1/8 Zoll</td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-Anschlüsse</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 Zoll und 4 mm</td></tr><tr><td>Spritzenverbinder</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Luer-Buchse 1/16 Zoll</td></tr><tr><td>Gerade Verbinder</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 Zoll</td></tr><tr><td>Winkelverbinder</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 Zoll</td></tr></tbody></table>

quantitative und zeitliche steuerung der sauerstoff-mikromilieu in der einzel-islet niveau

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Gleichzeitige Sauerstoffversorgung und Überwachung der Glucosestimulus-Sekretion Kopplungsfaktoren in einer einzigen Technik ist entscheidend für die Modellierung von pathophysiologischen Zuständen von Insel Hypoxie, vor allem in der Transplantations-Umgebungen. Standard-hypoxischen Kammer Techniken können nicht beide Reize modulieren gleichzeitig noch eine Echtzeit-Überwachung des Glucosestimulus-Sekretion Kopplungsfaktoren. Um diese Schwierigkeiten zu begegnen, haben wir mit einer mehrschichtigen Mikrofluidtechnik, sowohl wässrige und Gasphasenmodulationen über eine Diffusionsmembran integrieren. Dies erzeugt einen Stimulations Sandwich um die mikroskalierte Inseln innerhalb des transparenten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Vorrichtung, um so die Überwachung der genannten Kopplungsfaktoren über Fluoreszenzmikroskopie. Zusätzlich wird die Gaszufuhr durch ein Paar von Mikrodispenser gesteuert wird, eine quantitative, Unter Minute Modulationen von Sauerstoff zwischen 0-21%. Diese intermittierende Hypoxie wird angewendet, um ein neues Phänomen der Insel zu untersuchent Präkonditionierung. Außerdem mit multimodalen Mikroskopie bewaffnet, waren wir in der Lage, auf detaillierte Kalzium und K ATP-Kanal Dynamik in diesen hypoxischen Ereignissen zu suchen. Wir haben die Vision mikrofluidischen Hypoxie, vor allem diese simultane Dualphasen Technik, die als ein wertvolles Instrument bei der Untersuchung Inseln sowie viele Ex-vivo-Gewebe.

Zentraler Bestandteil dieser Inselzell-Hypoxie-Technik ist die Fähigkeit, wässrige und gasförmige Stimulationen in derselben mikrofluidischen Kammer mit transitorischen Vorgängen im Minutenbereich zu modulieren. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis der a) dualen Stimulationen und b) schnellen Modulationen, die innerhalb der Inselzellkammer gemessen wurden. Die wässrige Modulation, veranschaulicht durch die Zugabe von Fluorescein in die Kammer, erreicht nach drei bis vier Minuten Durchmischung d...

Die mikrofluidische Sauerstoffregelung bietet mehr als nur Komfort und Geschwindigkeit gegenüber hypoxischen Kammern für biologische Experimente. Insbesondere wenn er durch Diffusion durch eine Membran implementiert wird, kann mikrofluidischer Sauerstoff gleichzeitige Modulationen der Flüssig- und Gasphase auf der Mikroskala ermöglichen. Diese Technik ermöglicht dynamische, multiparametrische Experimente, die für die Untersuchung der Pathophysiologie der Inselzellen entscheidend sind.

Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mikroskalige Pankreasinseln mit minutenbasiertem intermittierendem Hypoxie-Reiz zu behandeln, um Präkonditionierungseffekte zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein multimodales mikrofluidisches Gerät mit einer dünnen gasdurchlässigen Membran hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, ein computergestütztes Sauerstoffmodulationssystem zu erstellen.Die nächsten Augenlöcher werden vorsichtig in das Gerät eingebracht, anschließend werden die flüssigkeits- und sauerstoffbasierten Mikrofluidiksysteme angeschlossen. Der letzte Schritt besteht darin, die Mikroskopie mit der multimodalen Mikrofluidik zu synchronisieren, um diejenigen Augenloch-Parameter sichtbar zu machen, die sich während der Sauerstoffmodulation verändern. Letztendlich wird die Augenloch-Methode mit intermittierender Hypoxie verwendet, um zu zeigen, dass die Glukosereaktion unter Hypoxie deutlich beeinträchtigt ist.Während zeitliche Modulationen von Hypoxie Augenlider darin trainieren können, mit geringerer Beeinträchtigung zu reagieren, liegt der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Messung des gelösten Sauerstof

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein mikrofluidischen Insel perifusion Gerät wurde für die Beurteilung der Dynamik der Insulinsekretion von mehreren Inselchen und gleichzeitige Fluoreszenz-Imaging von Calcium-Einstrom und die mitochondriale möglichen Veränderungen entwickelt.

Ein Multi-Parametric Islet Perifusion System innerhalb eines mikrofluidischen Perifusion Geräte

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Glukose-vermittelte Änderungen an mitochondrialen Atmung im Beisein von Naturstoffe auf intakt 832/13 Beta-Zellen mit Hilfe hochauflösender Respirometrie messen.

Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung hochwertiger, großflächiger Transkriptomdaten einzelner Zellen aus isolierten menschlichen Pankreasinseln unter Verwendung einer tropfenbasierten mikrofluidischen einzelligen RNA-Sequenzierungstechnologie vor.

Einzellige RNA-Sequenzierung und Analyse menschlicher Pankreas-Inseln

Dieses Protokoll demonstriert die genaue und reproduzierbare Messung des Sauerstoffverbrauchs in nichtmenschlichen Pankreasinseln. Die Beladetechniken der Isleten und die Beschichtung der Mikroplatte bieten einen Rahmen für eine effiziente Messung der Atmung in anderen Arten von kultivierten Sphäroiden.

Analyse des Sauerstoffverbrauchs der nichtmenschlichen Primaten-Pankreas-Islet

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur synchronen Erfassung und Co-Registrierung von intrazellulären Signalereignissen und der Sekretion von Insulin und Glukagon durch primäre humane Pseudoinseln unter Verwendung der adenoviralen Verabreichung eines zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensors, eines cAMP-Differenzdetektors in situ (cADDis) und eines Mikroperifusionssystems.

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Hier geben wir Details zur Durchführung der glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) durch Perfusion durch das Gefäßsystem von Mäusen mit intakter Bauchspeicheldrüse als zusätzliche Technik zur Beurteilung der endokrinen Pankreasfunktion mit Reduktion möglicher Störfaktoren.

Glukosestimulierte Insulinsekretion über Perfusion durch das Gefäßsystem der Maus mit intakter Bauchspeicheldrüse

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Herstellung eines doppelschichtigen mikrofluidischen Chips und zur Analyse des mikrobiellen Wachstums unter schnellen Sauerstoffoszillationen vor. Die Leistung des Geräts wurde durch Sauerstoffmessung in Flüssigkeitskanälen und mikrobielle Kultivierung validiert.

Erzeugung schneller Sauerstoffoszillationen in der mikrobiellen Einzelzellwachstumsanalyse mit einem mikrofluidischen Doppelschichtgerät

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Erfahren Sie die mikrofluidische Sauerstoffmodulation zur Untersuchung intermittierender Hypoxie in pankreatischen Inseln. Diese Methode ermöglicht präzise, dynamische Steuerung und Echtzeitüberwachung für verbesserte Einblicke in die Islet-Physiologie.

Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

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