Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mikroskalige Pankreasinseln mit minutenbasiertem intermittierendem Hypoxie-Reiz zu behandeln, um Präkonditionierungseffekte zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein multimodales mikrofluidisches Gerät mit einer dünnen gasdurchlässigen Membran hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, ein computergestütztes Sauerstoffmodulationssystem zu erstellen.

Die nächsten Augenlöcher werden vorsichtig in das Gerät eingebracht, anschließend werden die flüssigkeits- und sauerstoffbasierten Mikrofluidiksysteme angeschlossen. Der letzte Schritt besteht darin, die Mikroskopie mit der multimodalen Mikrofluidik zu synchronisieren, um diejenigen Augenloch-Parameter sichtbar zu machen, die sich während der Sauerstoffmodulation verändern. Letztendlich wird die Augenloch-Methode mit intermittierender Hypoxie verwendet, um zu zeigen, dass die Glukosereaktion unter Hypoxie deutlich beeinträchtigt ist.

Während zeitliche Modulationen von Hypoxie Augenlider darin trainieren können, mit geringerer Beeinträchtigung zu reagieren, liegt der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Messung des gelösten Sauerstoffs oder der Verwendung einer hypoxischen Kammer darin, dass eine genaue Sauerstoffkonzentration in raschen, winzigen Zeitintervallen an die Augenlider abgegeben werden kann, ohne dass mechanischer Stress durch komplizierte Strömungen entsteht.

Es ermöglicht zudem die Echtzeitüberwachung mittels Boden- und Mikroskopie. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Alli-Transplantation zu beantworten, beispielsweise die Definition hypoxischer Beeinträchtigungen an Transplantationsstellen oder Präkonditionierungsregime zur Verbesserung der Transplantationsergebnisse. So kann diese Methode Einblicke in die Alli-Hypoxie vermitteln.

Es kann auch auf andere Gewebe und Systeme wie das zentrale Nervensystem, Herzgewebe, die Niere und andere Transplantationsorgane angewendet werden. Eine Videodemonstration dieser Methode ist entscheidend, da viele der Geräteherstellung und der Handhabung der Öse betreffen. Die Schritte sind aufgrund des neuartigen interdisziplinären Charakters der Technik schwer zu erlernen, aber inhärent herausfordernd oder vertraut. Beginnen Sie mit der Herstellung der Deckschicht des mikrofluidischen Geräts.

Um dies zu erreichen, geben Sie die vorgemischten DGAs in Form von PDMS in eine leere Petrischale bis zu einer Höhe von 1,5 Millimetern und härten sie bei 80 Grad Celsius zwei Stunden lang aus. Danach stellen Sie die mikrofluidische Glukoseschicht mit der Profusionskammer-Form her, indem Sie zwei Schichten des Materials SU-8 2150 mit einer Dicke von jeweils 350 Mikrometern durch Aufdrehen auf einen vier Zoll großen Siliziumwafer auftragen, um eine einzelne Schicht von 700 Mikrometern Dicke zu erzeugen. Anschließend belichten Sie diese unter Verwendung einer Fotomaske für die mikrofluidische Glukoseschicht mit UV-Licht, um das Mikrokanalmuster auf die SU-8-Schicht zu übertragen.

Spülen Sie den nicht belichteten Bereich mit SU-Entwicklerlösung aus. Danach geben Sie das vorgemischte PDMS der DGAs auf das MA bis zu einer Höhe von drei Millimetern und härten es bei 80 Grad Celsius für zwei Stunden aus. Nach der Aushärtung schneiden Sie die mikrofluidische Glucoseschicht auf die gewünschte Form zu und verwenden einen 2-Millimeter-Stanzer, um die Einlass- und Auslassöffnungen sowie einen 8-Millimeter-Durchmesser-Stanzer für die Hauptkammer zu erzeugen.

Als Nächstes fertigen Sie den Mikroformabdruck für die Fixierung des Augenlids an, indem Sie eine 100 µm dicke Schicht aus SU 8 2100 durch Schleudelbeschichtung auf eine saubere vier Zoll große Siliziumscheibe auftragen und anschließend mittels UV-Lithografie das Mikroformmuster auf diese Schicht übertragen. Nach Fertigstellung des Mikroformabdrucks werden die nicht belichteten Bereiche mit Entwicklerlösung ausgewaschen. Fügen Sie zwei 100 µm dicke Schichten aus PDMS hinzu, indem Sie jeweils 30 Sekunden bei 900 U/min schleudeln und anschließend 10 Minuten bei 80 °C aushärten, um jede Schicht herzustellen.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, stanzen Sie die Einlass- und Auslassöffnungen mit einem Durchmesser von zwei Millimetern aus. Stellen Sie anschließend den Gasmikrofluidik-Prototypen her, indem Sie SU 8 2100 wie in der vorherigen Schicht auf eine Dicke von 100 Mikrometern aufspinnen und erneut mittels UV-Lithografie die Muster für die Gasmikrofluidik übertragen. Spülen Sie die nicht belichteten Bereiche mit Entwicklerlösung aus.

Anschließend wird eine 1,5 Millimeter dicke Schicht aus PDMS auf die Gasmikrofluidik-Masterform gegossen und zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius ausgehärtet. Danach wird das PDMS mit der Rasierklinge zurechtgeschnitten. Anschließend werden zwei Millimeter durchmessende Einlass- und Auslassöffnungen in die Deckschicht gestanzt, die mit den entsprechenden Öffnungen auf den anderen Schichten ausgerichtet werden, um die mehreren Schichten miteinander zu verbinden.

Zunächst bereiten Sie diese vor, indem Sie die Oberflächen mit Klebeband reinigen, ihnen einem Corona-Lichtbogen aussetzen und anschließend die Schichten manuell in der folgenden Reihenfolge ausrichten. Befestigen Sie zuerst die Membran auf der unteren Gasschicht, wobei die Mikrogefäße nach oben zeigen. Danach befestigen Sie die mikrofluidische Glukoseschicht auf der Mikrogefäße-Membran.

Schließlich die Einlass- und Auslassschicht ganz oben aufbringen, wodurch die gesamte Anordnung umschlossen wird. Um eine feste Verbindung zu fördern, ein ein Kilogramm schweres Gewicht auf die Anordnung legen und diese drei Stunden lang bei 100 Grad Celsius aushärten lassen. Danach auf Dichtheit prüfen.

Prüfen Sie das Gerät, indem Sie Wasser in die wässrige Schicht füllen, das Gerät untertauchen und mit der Spritze Luft durch die Gasschicht strömen lassen, während Sie auf Leckagen achten. Sterilisieren Sie abschließend die leckagefreien Geräte, indem Sie 70 % Ethanol ein bis zwei Minuten lang durch die wässrige Schicht leiten. Richten Sie die Mikrodispenser ein, indem Sie zunächst die Steuerleitungen der Mikrodispenser mit den beiliegenden Treibereinheiten verbinden.

Verbinden Sie anschließend die Treiber mit der digitalen IO-Platine an den Anschlüssen, die den Lab-View-Steuerungen entsprechen. Danach schließen Sie eine 5-Volt- und eine 20-Volt-Gleichstromversorgung an die entsprechenden Kontakte der Antriebseinheiten an und verbinden die digitale IO-Platine mit einem Laptop, um die Lab-View-Codes zur Gassteuerung auszuführen, wie im Anhang des begleitenden Textprotokolls beschrieben. Schließen Sie dann einen Mikrodosierer an Stickstoff und den anderen an Druckluft an, wobei beide Gase 5 % Kohlendioxid enthalten, und stellen Sie beide Gase auf 2 PS.I ein. Bringen Sie die Ausgänge der Dosierer vor dem Eintritt in die mikrofluidische Vorrichtung in einer T-Verbindung zusammen.

Als Nächstes montieren Sie das Gerät auf der beheizten Stufe eines umgekehrten Mikroskops mit 0 % und 21 % Sauerstoff, die mit dem Gerät verbunden sind. Platzieren Sie dann einen faseroptischen Sauerstoffsensor am Flüssigkeitsausgang des Geräts, um den gelösten Sauerstoff im Ausfluss in Echtzeit zu messen. Anschließend schließen Sie das Gerät an eine peristaltische Pumpe an und beginnen, Wasser mit einer Geschwindigkeit von 250 µL pro Minute durch das Gerät zu leiten.

Charakterisieren Sie die transiente Antwort der Sauerstoffmodulation, indem Sie die Mikrodispenser zwischen fünf und 21 % Sauerstoff zyklisieren. Schließen Sie eine peristaltische Pumpe an das mikrofluidische Gerät an und positionieren Sie den Schlauch über einer 37 °C-Heizplatte, um die Flüssigkeit vor dem Eintritt in das mikrofluidische Gerät zu erwärmen. Verbinden Sie außerdem den Auslass des Glukose-mikrofluidischen Systems mit einem Fraktionssammler, um mit der Präparation von C57BL/6-Mäusen zu beginnen, und isolieren Sie die Pankreasinseln durch Kollagenase-Digestion und Dichtegradientenzentrifugation nach C, wie in den folgenden, über JoVE verfügbaren Videos beschrieben, sobald die Isolierung erfolgt ist.

Inkubieren Sie die Augenringe in RPMI 1640-Medium, das 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 20 Millimolar HEPES enthält, in Petrischalen für 24 bis 48 Stunden. Verwenden Sie die Augenringe innerhalb von zwei Tagen, um konsistente Ergebnisse sicherzustellen. Bereiten Sie anschließend frische Krebs-Ringer-Bikarbonat-Puffer wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben vor, wobei eine Lösung zwei Millimolar Glukose und eine andere 14 Millimolar Glukose enthält.

Erwärmen Sie die Lösungen in 50-Milliliter-Kegelröhrchen, indem Sie diese in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad stellen. Bereiten Sie anschließend die Färbung für die isolierten Augen vor, indem Sie fünf µM 4:02 AM und DMSO sowie 2,5 µM RH 123 und 100 % Ethanol zu zwei Milliliter Pufferlösung vom Typ Krebs mit zwei mM Glukose hinzufügen. Danach heben Sie die Augen mit einer 10-µL-Mikropipette auf und inkubieren sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in der Färbungslösung.

Nach der Färbung etwa 20 Augen in das Gerät über den Glucose-Mikrokanal-Einlass geben. Leiten Sie die Augen in die Kammer, indem Sie Puffer von der Auslassöffnung zurück zum Einlass leiten. Anschließend die Augen und den Puffer 10 Minuten lang durchströmen, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen.

Zunächst zwei Millimolar Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer fünf Minuten lang durch das System leiten, um eine normale Pulsbasislinie zu etablieren. Danach die Kammer 15 Minuten lang mit dem 14 Millimolar Glukose-Puffer stimulieren, gefolgt von einer 15-minütigen Spülung mit dem zwei Millimolar Glukose-Puffer. Während dieses Vorgangs die Emission bei 510 Nanometer aufzeichnen, indem man bei 340 und 380 Nanometer anregt.

Notieren Sie außerdem die Emission bei 530 nm von RH 1 23 durch Anregung des Farbstoffs bei 480 Nanometern. Um konvektive Störungen während der Sauerstoffmodulation zu minimieren, leiten Sie Pufferfluss während der Stimulations- und Spülschritte ein und stellen Sie sicher, dass der Fluss in den anderen Schritten während der Messung gestoppt wird. Sammeln Sie die Abläufe aus dem Glukoseauslass in Ein-Minuten-Abständen für zusätzliche Analysen. Mithilfe des in diesem Video gezeigten mikrofluidischen Ansatzes ist es möglich, den Prozentsatz des Sauerstoffs, der rasch an der dünnen PDMS-Membran vorbeifließt, mittels computerisierter Mikroinjektoren zu regulieren.

Hier ist ein Beispiel dieser Modulation, die von einer Minute bis sechs Minuten reicht. Es ist ebenfalls möglich, quantitative Modulationen unter einer Minute durchzuführen, bei denen der Sauerstoffgehalt zwischen zwei und 8,5 Teilen pro Million variiert wird, indem Sauerstoff zwischen 5 und 21 % zugeführt wird. Die blaue Linie zeigt den Prozentsatz des zugeführten Sauerstoffs, die grüne Linie die resultierende gelöste Sauerstoffkonzentration in Teilen pro Million. Wenn dieser zyklische Wechsel angewendet wird, um intermittierende Hypoxie an den Öffnungen zu erzeugen, können die Vorteile einer Hypoxie-Vorbehandlung dieser Öffnungen im Vergleich zu unregelmäßigen normoxischen Impulsen beobachtet werden, und zwar anhand des verbesserten For-Verhältnisses nach der Behandlung. Die Wirkungen von Hypoxie und intermittierender Hypoxie zeigen sich in der Überschwingung und der Dämpfung der Oszillationen von Calcium-Transienten. Die blaue Linie hier zeigt die normoxische Antwort.

In Rot ist die Hypoxieantwort dargestellt, und die grüne Linie zeigt die konditionierte Hypoxieantwort. Hier werden die Messungen von Kalzium, mitochondrialem Potential und Insulin gezeigt. Es handelt sich um Ergebnisse der Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie und eines Off-Chip-ELISA-Assays unter Verwendung des mikrofluidischen Effluents aus dem System. Zusammen liefern diese Daten eine multimodale Darstellung der Glukose-Insulin-Antwort unter hypoxischen transienten Bedingungen.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden: ein Tag für die Herstellung des Geräts und die Isolierung der Augenlidzellen sowie ein Tag für die eigentlichen Augenlidexperimente. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die zugeführte Sauerstoffkonzentration zu überprüfen, indem das Gas nach der Entwicklung des Geräts kalibriert wird. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der fetalen Entwicklung und anderer mikrophysiologischer Gewebe den Weg, um zu untersuchen, wie Hypoxie und vorübergehende Sauerstoffmuster Krankheiten wie Diabetes, kardiovaskuläre und neurologische Erkrankungen beeinflussen können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Sauerstoffmodulation steuert, Mikrogewebe manipuliert und mit multimodalen mikrofluidischen Vorrichtungen reproduzierbare, aussagekräftige Messungen der Gewebehypoxie erzeugt.