Quantitative und zeitliche Steuerung der Sauerstoff-Mikromilieu in der Einzel-Islet Niveau

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, minutenskalierte intermittierende Hypoxie auf mikroskalige Pankreasösen anzuwenden, um die Präkonditionierungseffekte zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein multimodales mikrofluidisches Gerät mit einer dünnen gasdurchlässigen Membran hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, ein computergestütztes Sauerstoffmodulationssystem zu erstellen.

Als nächstes werden vorsichtig Ösen in das Gerät geladen, und dann werden Flüssigkeits- und Sauerstoff-Mikrofluidik verbunden. Der letzte Schritt besteht darin, die Mikroskopie mit der multimodalen Mikrofluidik abzustimmen, um die Ösenparameter sichtbar zu machen, die sich während der Sauerstoffmodulation verändern. Letztendlich wird die Eyelet-Technik der intermittierenden Hypoxie verwendet, um zu zeigen, dass die Glukosereaktion bei Hypoxie deutlich beeinträchtigt ist.

Während zeitliche Modulationen der Hypoxie die Ösen trainieren können, mit weniger Beeinträchtigungen zu reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie gelöstem Sauerstoff oder der Verwendung einer hypoxischen Kammer besteht darin, dass sie genau ist. Die Sauerstoffkonzentration konnte in schnellen, winzigen Zeitintervallen an die Augenlider abgegeben werden, ohne dass es zu einer Belastung durch komplizierte Strömungen kam.

Es ermöglicht auch eine Echtzeitüberwachung mit Boden- und Mikroskopie. Dieser Master kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Alli-Transplantation zu beantworten, wie z. B. die Definition hypoxischer Beeinträchtigungen an Transplantationsstellen oder Präkonditionierungsschemata zur Verbesserung der Transplantationsergebnisse. Diese Methode kann also Aufschluss über die Alli-Hypoxie geben.

Es kann auch auf andere Gewebe und Systeme wie das zentrale Nervensystem, Herzgewebe, die Niere und andere Transplantationsorgane angewendet werden. Die Videodemonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da viele der Geräteherstellung und des Ösengriffs vorhanden sind. Die Schritte sind aufgrund des neuartigen interdisziplinären Charakters der Technik schwer zu erlernen, aber es besteht eine inhärente Herausforderung oder Vertrautheit mit der Herstellung der Deckschicht des mikrofluidischen Geräts.

Gießen Sie dazu vorgemischtes PDMS von DGA bis zu einer Höhe von 1,5 Millimetern in eine leere Petrischale und härten Sie es zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius aus. Stellen Sie als Nächstes die mikrofluidische Glukoseschicht mit dem Profusionskammer-Master her, indem Sie zwei 350 Mikrometer dicke Schichten aus SU 8 21 50 schleudern, um eine einzelne 700-Mikron-Schicht auf einem vier Zoll großen Silikonwafer zu bilden. Setzen Sie es dann mit der Fotomaske der mikrofluidischen Glukoseschicht UV-Licht aus, um das Mikrokanalmuster auf die achte SU-Schicht zu übertragen.

Spülen Sie die nicht belichtete Stelle mit dem Entwickler SU eight ab. Gießen Sie anschließend vorgemischtes PDMS von DGAs bis zu einer Höhe von drei Millimetern auf den MA und härten Sie zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius aus. Schneiden Sie nach dem Aushärten die mikrofluidische Glukoseschicht in Form und verwenden Sie einen zwei Millimeter Stempel, um die Einlass- und Auslassöffnungen zu formen, sowie einen Stempel mit acht Millimetern Durchmesser für die Hauptkammer.

Als nächstes stellen Sie den Micro-Well-Master für die Immobilisierung der Augenlider her, indem Sie eine 100 Mikrometer dicke Schicht SU 8 2100 auf einen sauberen vier Zoll großen Siliziumwafer schleudern und dann mit UV-Lithographie das Micro-Well-Muster auf diese Schicht übertragen. Spülen Sie die nicht belichteten Bereiche mit dem Entwickler ab, wenn der Mikrotiter-Master fertig ist. Fügen Sie zwei 100-Mikron-Schichten PDMS hinzu, indem Sie 30 Sekunden lang bei 900 U/min schleudern und dann 10 Minuten lang bei 80 Grad Celsius aushärten, um jede Schicht herzustellen.

Wenn Sie fertig sind, stanzen Sie den Einlass mit einem Durchmesser von zwei Millimetern in die Auslassöffnungen. Zum Schluss wird der gasmikrofluidische Master hergestellt, indem SU 8 mit einer Dicke von 2100 bis 100 Mikrometern wie in der vorherigen Schicht gedreht wird, und die gasmikrofluidischen Muster erneut mit UV-Lithographie übertragen werden. Spülen Sie die nicht belichtete Stelle mit dem Entwickler ab.

Gießen Sie anschließend eine 1,5 Millimeter dicke Schicht PDMS auf den Gasmikrofluidik-Master und härten Sie zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius aus. Schneide dann das PDMS mit der Rasierklinge in Form. Stanzen Sie dann Einlass- und Auslassöffnungen mit einem Durchmesser von zwei Millimetern in die Deckschicht, so dass sie mit der Stelle übereinstimmen, an der sie sich auf den anderen Schichten befinden, um die mehreren Schichten miteinander zu verbinden.

Bereiten Sie sie zunächst vor, indem Sie die Oberflächen mit Klebeband reinigen, sie einem Corona-Lichtbogen aussetzen und dann die Schichten von Hand in der folgenden Reihenfolge ausrichten. Verkleben Sie zunächst die Membran mit der unteren Gasschicht mit den Mikrovertiefungen nach oben. Kleben Sie dann die mikrofluidische Glukoseschicht auf die Mikrowell-Membran.

Zum Schluss verkleben Sie die Ein- und Auslassschicht ganz oben und kapseln die gesamte Baugruppe. Helfen Sie bei der Bildung einer festen Verbindung, indem Sie ein Kilogramm Gewicht auf die Baugruppe legen und sie drei Stunden lang bei 100 Grad Celsius backen. Dann lecken.

Testen Sie das Gerät, indem Sie Wasser in die wässrige Schicht füllen, das Gerät eintauchen und mit der Spritze Luft durch die Gasschicht strömen, während Sie nach Lecks suchen. Zum Schluss sterilisieren Sie die leckagefreien Geräte, indem Sie ein bis zwei Minuten lang 70 % Ethanol durch die wässrige Schicht leiten. Richten Sie die Mikrospender ein, indem Sie zuerst die Steuerkabel der Mikrospender an die mitgelieferten Treibereinheiten anschließen.

Verbinden Sie dann die Treiber mit der digitalen E/A-Platine an Ports, die ihren Steuerelementen in der Laboransicht entsprechen. Schließen Sie als Nächstes Fünf-Volt- und 20-Volt-Gleichstromnetzteile an die entsprechenden Kontakte an den Antriebseinheiten an und verbinden Sie das digitale IO mit einem Laptop, um Laboransichtscodes für die Gassteuerung auszuführen, wie im Anhang des begleitenden Textprotokolls beschrieben. Schließen Sie dann einen Mikrospender an Stickstoff und den anderen an Druckluft an, die beide 5 % Kohlendioxid enthalten, und stellen Sie beide Gase auf zwei PS ein. Ich schließe die Ausgänge des Dispensers in einen T-Übergang ein, bevor ich in das mikrofluidische Gerät eintrete.

Montieren Sie als Nächstes das Gerät auf dem beheizten Tisch eines inversen Mikroskops, an dem 0 % und 21 % Sauerstoff an das Gerät angeschlossen sind. Platzieren Sie anschließend einen faseroptischen Sauerstoffsensor am Flüssigkeitsausgang des Geräts, um den gelösten Sauerstoff innerhalb des Ausgangs in Echtzeit zu messen. Schließen Sie dann das Gerät an eine Schlauchpumpe an und beginnen Sie, Wasser mit 250 Mikrolitern pro Minute durch das Gerät zu fließen.

Charakterisieren Sie das Einschwingverhalten der Sauerstoffmodulation, indem Sie die Mikrodispenser zwischen fünf und 21 % Sauerstoff schalten. Schließen Sie eine Peristaltikpumpe an das mikrofluidische Gerät an und positionieren Sie den Schlauch über einer 37 Grad Celsius heißen Platte, um die Flüssigkeit zu erwärmen, bevor sie in das mikrofluidische Gerät eintritt. Verbinden Sie außerdem den Ausgangsanschluss der Glukose-Mikrofluidik mit einem Fraktionssammler, um mit der Präparierung von C 57 Black Six-Mäusen zu beginnen und Pankreasösen durch Kollagenase-Verdau und F-ccal-Dichtegradiententrennung zu isolieren, wie in den folgenden Videos beschrieben, die nach der Isolierung von JoVE verfügbar sind.

Inkubieren Sie die Ösen in RPMI 1640 Medium, das 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 20 Millimolar enthält, 24 bis 48 Stunden lang in Petrischale. Verwenden Sie die Ösen innerhalb von zwei Tagen, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Als nächstes bereiten Sie frischen Krebsringer-Bicarbonat-Puffer zu, wie im Begleittextprotokoll beschrieben, mit einer Lösung, die zwei Millimolare Glukose enthält, und einer anderen, die 14 Millimolare Glukose enthält.

Erwärmen Sie die Lösungen in konischen 50-Milliliter-Röhrchen, indem Sie sie in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad legen. Bereiten Sie dann den Fleck für die isolierten Ösen vor, indem Sie fünf Mikromolare von 4:02 AM und DMSO und 2,5 Mikromolare RH 1, 23 und 100 % Ethanol zu zwei Millilitern des Krebs-Puffers mit zwei Millimolaren Glukose hinzufügen. Nehmen Sie anschließend mit einer 10-Mikroliter-Pipette Ösen auf und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Beize.

Nach dem Färben laden Sie ca. 20 Ösen über den Glukose-Mikrokanal-Einlass in das Gerät. Richten Sie die Ösen in die Kammer, indem Sie den Puffer vom Auslass zurück in den Einlass grundieren. Dann die Ösen perfundieren und 10 Minuten puffern, um überschüssige Farbstoffe wegzuwaschen.

Zuerst ziehen Sie zwei millimolare Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer fünf Minuten lang durch das System, um eine normale Puls-Baseline zu etablieren. Stimulieren Sie dann die Kammer 15 Minuten lang mit dem 14 millimolaren Glukosepuffer, gefolgt von einer 15-minütigen Wäsche mit dem zwei millimolaren Glukosepuffer. Während dieses Prozesses wird die 510 Nanometer für zwei Emissionen aufgezeichnet, indem die Nahrung um 340 Nanometer und 380 Nanometer angeregt wird.

Zeichnen Sie auch die 530-Emission von RH 1 23 auf, indem Sie den Farbstoff bei 480 Nanometern anregen. Um konvektive Störungen während der Sauerstoffmodulation zu minimieren, wenden Sie während der Stimulations- und Waschschritte eine Pufferströmung an und stellen Sie sicher, dass die Strömung in den anderen Schritten während des Tests gestoppt wird. Sammeln Sie das Abwasser aus dem Glukoseauslass in Abständen von einer Minute für die Verwendung in zusätzlichen Analysen Mit dem in diesem Video gezeigten mikrofluidischen Ansatz ist es möglich, den Prozentsatz des Sauerstoffs, der an der dünnen PDMS-Membran vorbeifließt, mit den computergesteuerten Mikroinjektoren schnell zu regulieren.

Hier ist ein Beispiel für diese Modulation, die von einer Minute bis zu sechs Minuten reicht. Es ist auch möglich, quantitative sub-minütliche Modulationen des Sauerstoffs zwischen zwei und 8,5 Teilen pro Million zu erzielen, indem Sauerstoff zwischen fünf und 21 % zugeführt wird. Die blaue Linie zeigt den Prozentsatz des zugeführten Sauerstoffs und die grüne ist der resultierende gelöste Sauerstoff in Teilen pro Million. Wenn dieser Zyklus angewendet wird, um intermittierende Hypoxie an den Ösen zu erzeugen, kann man die Vorteile der Vorkonditionierung von Ösen gegen Hypoxie im Vergleich zu unregelmäßigen normoxischen Impulsen beobachten, indem man die verbesserten Effekte von Hypoxie und intermittierender Hypoxie nach der Behandlung beobachtet, die bei der Überschwing- und Oszillationsdämpfung von Kalziumtransienten beobachtet werden können, wie hier in Blau gezeigt, ist die normoxische Reaktion.

In Rot ist die hypoxische Reaktion zu sehen, und die grüne Linie ist die konditionierte hypoxische Reaktion. Das Maß für Kalzium, mitochondriales Potenzial und Insulin ist hier dargestellt. Sie sind die Ergebnisse der Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie und des Off-Chipp-EISA-Assays, bei denen die mikrofluidischen Ausflüsse aus dem System zusammen verwendet werden, um eine multimodale Sicht auf die Glukose-Insulin-Reaktion unter hypoxischen Transienten zu erstellen.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, ein Tag für die Herstellung des Geräts und die Isolierung der Augenlidzellen und ein Tag für die Augenlidexperimente selbst. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die abgegebene Sauerstoffkonzentration zu überprüfen, indem der Gasator des Geräts nach seiner Entwicklung verheiratet wird. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich des fetalen Auslasses und anderer Mikrophysiologien des Gewebes, um zu untersuchen, wie Hypoxie und vorübergehende Sauerstoffmuster Krankheiten wie Diabetes, Herz-Kreislauf- und neurologische Störungen beeinflussen können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Sauerstoffmodulation steuern, Mikrogewebe manipulieren und wiederholbare, aussagekräftige Messungen der Gewebehypoxie mit multimodalen mikrofluidischen Geräten durchführen können.