Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Einzelzelllysate mittels Fluoreszenz- oder Immunoassays zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein mikrofluidisches Gerät hergestellt und die innere Kammer mit Antikörpern beschichtet wird. Dann werden einzelne Zellen in den Fallen immobilisiert und verschiedenen Reagenzien ausgesetzt, um in einem zweiten Schritt eine zelluläre Reaktion zu stimulieren.

Ein ringförmiges Ventil wird schnell geschlossen und der Lysepuffer durch das Gerät geleitet. Das ringförmige Ventil wird für kurze Zeit geöffnet und die Zellen werden in der Mikrokammer lysiert, so dass freigesetzte Proteine aufgrund des geringen Volumens in hoher Konzentration an die Antikörper binden können. Als nächstes wird das ringförmige Ventil geöffnet.

Die Kammer wird gewaschen und die Nachweisreagenzien werden in die geschlossene Mikrokammer eingeführt. Der Anstieg der Fluoreszenzintensität wird im Laufe der Zeit mit einem Fluoreszenzmikroskop überwacht, die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit dieses Systems, einen von einzelnen Zellen freigesetzten Analyten quantitativ und zuverlässig zu detektieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Einzel-A-Zell-Analyse zu beantworten.

Insbesondere wurden systematische Untersuchungen über die zelluläre Reaktion auf Schwankungen in der chemischen Umgebung durchgeführt. Wir können die Aufwärts- oder Abwärtsregulierung intrazellulärer Moleküle als Ergebnis des chemischen Stimulus sehen. Es gibt zwei Hauptvorteile dieser Technik.

Die erste besteht darin, dass wir die immobilisierten Zellen einer definierten chemischen Umgebung aussetzen können, die konstant ist oder sich periodisch ändert. Zweitens können wir die hochempfindliche und spezifische Analyse des Sats reformieren, ohne dass es zu Kreuzkontaminationen oder Transportverlusten von Analyten kommt. Zu Beginn der Herstellung der drei verschiedenen SU acht Master-Wafer, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Eine wird für die Erstellung der Fluidikschicht verwendet, eine für die Kontrollschicht und eine dritte für den Mikrokontaktstempel. Stellen Sie dann die mikrofluidischen Chips her, beginnend mit der Herstellung einer 10-zu-Eins-Mischung aus PDMS und einem Härtungsmittel. Mischen Sie beide Teile kräftig und entgasen Sie die Lösung 30 Minuten lang oder bis die Mischung blasenfrei ist.

Platzieren Sie dann den Wafer innerhalb der Kontrollschicht in einer Petrischale und kleben Sie ihn auf die Unterseite. Gießen Sie etwa 50 Gramm PDMS darüber, um eine vier bis fünf Millimeter dicke Schicht zu erhalten, und legen Sie den Wafer mindestens zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius in einen Ofen, um eine vollständige Aushärtung des PDMS zu gewährleisten. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für den Mikrokontakt-Druckwafer, verwenden Sie jedoch etwa 20 Gramm PDMS anstelle von 50, was zu einer vier bis fünf Millimeter dicken PDMS-Schicht führt.

Um die untere Schicht vorzubereiten, wird eine 40 Mikrometer hohe PDMS-Schicht mit der mikrofluidischen Schicht auf den Wafer geschleudert. Mit einer Drehzahl von 2000 U/min für 60 Sekunden. Härten Sie die PDMS-Schicht eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius in einem Ofen aus, wenn alle Teile ausgehärtet sind.

Entferne die Kontrollschicht vom Wafer und schneide ihn mit der Rasierklingenhilfe in Stücke. Stanzen Sie dann mit einer Ein-Millimeter-Biopsiepunktion Druckverbindungslöcher und decken Sie die Kanäle zur Aufbewahrung mit Klebeband ab. Entfernen Sie als Nächstes das PDMS über dem Mikrokontaktdruckwafer und bereiten Sie Stempel vor, die die Größe des Kammerbereichs haben.

Bewahren Sie sie bis zum Gebrauch staubfrei in einer Schublade auf. Anschließend legen Sie den spinnbeschichteten Wafer und die vier bis fünf Millimeter dicke Kontrollschicht in einen Plasmareiniger. Belichten Sie die Stücke 45 Sekunden lang bei 18 Watt mit Sauerstoffplasma bei 0,75 Millibar.

Richten Sie nach der Plasmabehandlung beide Schichten schnell unter einem Mikroskop mit großem Arbeitsabstand aus. Fügen Sie einige Ersatz-PDMS um die platzierten oberen Teile hinzu, um die Entnahme des PDMS vom Wafer zu erleichtern. Anschließend die Waffel für mindestens eine Stunde bei 80 Grad Celsius in den Ofen schieben.

Nach dem Aushärten das PDMS vorsichtig mit einem Skalpell vom Wafer entfernen und mit einer 1,5-Millimeter-Biopsiepunktion die Zugangslöcher für die Mikrochip-Stanzlöcher für die fluidischen Verbindungen herausschneiden. Erstellen Sie zusätzlich ein Reservoir im Mikrochip, indem Sie den oberen Teil einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze abschneiden und etwas halbgehärtetes Ersatz-PDMS verwenden. Kleben Sie es darauf.

Anschließend den Chip im Backofen bei 80 Grad Celsius für mindestens eine Stunde aushärten. Beginnen Sie mit der Reinigung eines Objektträgers und der PDMS-Teile. Reinigen Sie einen Objektträger mit Seife.

Spülen Sie es mit destilliertem Wasser und dann erneut mit Ethanol ab. Trocknen Sie den Objektträger mit einem Stickstoffstrahl. Verwenden Sie Klebeband, um Schmutz und Staubpartikel vom PDMS zu entfernen.

Platzieren Sie dann das PDMS-Teil und das gereinigte Glas. Schieben Sie den Chip für 45 Sekunden bei 18 Watt in den Plasmareiniger, um eine dichte Verbindung zu gewährleisten, legen Sie den Chip nach der Plasmabehandlung fünf Minuten lang auf eine heiße Platte. Schneiden Sie nach dem Verkleben den unteren Teil von einigen 200-Mikroliter-Pipettenspitzen ab. Füllen Sie sie mit 10 bis 15 Mikrolitern gefiltertem PBS mit 4%BSA und legen Sie sie in die Einlässe des Geräts.

Verwenden Sie dann abgeschnittene Spitzen mit zugesetzten 10 bis 15 Mikrolitern PBS und geben Sie sie in die Steuerkanäle. Legen Sie anschließend die Späne in die Zentrifuge und drehen Sie sie fünf Minuten lang bei 800-facher Schwerkraft, um die Kanäle mit Flüssigkeit zu füllen. Wenn sich Luft in einem der Kanäle befindet, wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Kanäle vollständig gefüllt sind.

Inkubieren Sie die Blockierungslösung mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Lösung mit PBS bei einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute aus der Fluidschicht aus. Mit einer Spritzenpumpe ist das Gerät nun bereit für Zellexperimente, um den Objektträger für Immunoassays vorzudrucken und PDMS-Mikrokontaktdruckstempel mit 0,5 % biotinyliertem BSA in einer sauberen Petrischale zu inkubieren.

Reinigen Sie die Stempel nach einer halben Stunde gründlich und schnell mit destilliertem Wasser und trocknen Sie den Stempel unter einem Stickstoffstrahl. Legen Sie die Stempel nach dem Trocknen schnell auf einen gereinigten Objektträger, um das gemusterte biotinylierte BSA abzulagern. Bewegen Sie den Stempel nach dem Platzieren nicht und prüfen Sie, ob der Stempel mit dem Objektträger in Kontakt kommt.

Wenn nicht leicht, klopfen Sie auf den Stempel, aber drücken Sie ihn nicht fest nach unten. Legen Sie dann den Stempel zusammen mit dem oberen Teil des Mikrofluidik-Chips in die Plasmakammer und belichten Sie diese für 45 Sekunden mit Sauerstoffplasma bei 18 Watt. Entfernen Sie nach der Plasmabehandlung den Stempel vom Objektträger.

Wenn Sie auf die Oberfläche atmen, wird das Muster sichtbar. Richten Sie die Mikrokammern auf der bedruckten Oberfläche aus. Nach dem Ausrichten legen Sie den Chip 30 Minuten lang auf eine heiße Platte bei 50 Grad Celsius, um die verbleibende Oberfläche zu blockieren, geben Sie eine 4%ige sterile gefilterte BSA-Lösung in PBS mit einer Zentrifuge in den Chip, wie zuvor gezeigt, inkubieren Sie den Mikrochip mindestens 30 Minuten lang und waschen Sie dann die Lösung mit PBS bei einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute aus der Flüssigkeitsschicht aus.

Verwenden Sie den Chip mit einer Spritzenpumpe direkt oder lagern Sie ihn bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius in einer feuchten Box. Schaffen Sie als Nächstes eine voll funktionsfähige Bindungsfläche, indem Sie Avadon in PBS in das Reservoir einführen. Lassen Sie die Lösung fließen, um das Avadon anschließend durch die Flüssigkeitskanäle zu ziehen.

Spülen Sie den Behälter gründlich aus und spülen Sie die Kanäle mit PBS. Gib dann Protein G in das Reservoir und ziehe es durch die Kanäle. Waschen Sie überschüssiges Protein G aus, indem Sie das Reservoir und den Chip mit PBS spülen.

Fügen Sie als Nächstes den interessierenden Antikörper zum Reservoir hinzu und lassen Sie ihn durch die Kanäle fließen. Stoppen Sie dann den Fluss, um eine Bindung zu ermöglichen, bevor Sie die Kanäle mit PBS fluoreszierend waschen, markierte Analoga können verwendet werden, um die Qualität des Druckprozesses zu überprüfen, bevor Zellen in die Kanäle eingeführt werden. Entnehmen Sie adhärente Zellen, wie z. B. die hier gezeigten HE 2 9 3-Zellen mit enzymfreiem Dissoziationspuffer, und filtern Sie sie dann, um die Anzahl der Zellcluster zu reduzieren. Nach dem Filtern werden sie in eine Spritze geladen.

Bei 300.000 Zellen pro Milliliter laden Sie die Zellen auf den Chip durch Vorwärtsströmung auf der Spritzenpumpe für etwa drei Minuten mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 20 Mikrolitern pro Minute. Für Adhäsivzellen wie diese, um ein unspezifisches Anhaften der Zellen beim Befüllen der Fallen zu verhindern, verschließen Sie die Kammern, indem Sie die oberste Schicht mit drei Stäben unter Druck setzen. Untersuchen Sie dann die Kammern mit einem Mikroskop. Wenn sich herausstellt, dass viele Zellen unspezifisch an der Oberfläche in den Kammern haften, öffnen Sie sie schnell und versuchen Sie, sie mit Zelldissoziationspuffer bei einer Flussrate von 10 bis 30 Mikrolitern pro Minute wegzuspülen.

Für den Glucose-Six-Phosphat-Dehydrogenase- oder G-Six-PDH-Assay fügen Sie zwei millimolare Glukose, sechs Phosphate 0,5 Millimolar und ein DP 0,5 Einheiten pro Milliliter DIA-Arrays und 0,3 Millimolar RIN zu einem Lysepuffer hinzu und stellen Sie sicher, dass er gut gemischt ist. Sobald die Kanäle frei sind, ziehen Sie den G six PDH-Lysepuffer mit einer Durchflussrate von 30 Mikrolitern pro Minute durch den Chip. Während der Lysepuffer fließt, öffnen und schließen Sie die Kammern schnell und lassen Sie sie 500 Millisekunden lang offen, damit die Lyse unmittelbar nach Beginn der Lyse in die Kammer eintreten kann, um die kinetische Reaktion zu überwachen.

In diesem Beispiel kann ein fluoreszierendes Produkt über die Zeit überwacht werden. Hier ist eine Anordnung von Kammern zu sehen, die mit orangefarbener Lebensmittelfarbe gefüllt und dann durch Druckbeaufschlagung der Kontrollschicht über den Mikrokammern verschlossen wurden. Nach dem Schließen der Kammer wurde grüner Lebensmittelfarbstoff durch die Kanäle gespült, um die Dichtheit der Kammern zu zeigen.

Jede Kammer enthält ein Volumen von nur 625 Pikolitern Flüssigkeit, das die Konzentration der aus den Lyszellen freigesetzten Moleküle hoch genug für die Analyse hält. Darüber hinaus können die Ventile so geöffnet und geschlossen werden, dass eine Kreuzkontamination zwischen den Kammern ausgeschlossen ist. In diesen Kammern ist es möglich, Analyten wie die Menge an Lysosom, die von einer einzelnen PMA-aktivierten U 9 37-Zelle freigesetzt wird, zu messen, da es enzymatisch die Produktion eines fluoreszierenden Moleküls in der Kammer katalysiert.

Die grünen Linien stellen die Änderung der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit für Kammern dar, die von einer Zelle belegt sind. Ebenfalls dargestellt ist die Fluoreszenzintensität für eine Kammer ohne Zellen, dargestellt durch die schwarze gestrichelte Linie. Zum Vergleich zeigt dieser Assay die Wirkung eines toxischen Moleküls auf die Membranintegrität durch Messung eines intrazellulären Enzyms G sechs PDH.

Die schwarze Linie stellt die Kontrollproben ohne toxischen Einfluss dar, während die orangefarbene Linie Zellen darstellt, die durch das gezeigte Toxin beeinflusst wurden. Hier ist ein Beispiel für einen Immunoassay für das intrazelluläre Protein. GFP-Anti-GFP-Antikörper wurden auf der Oberfläche immobilisiert und nach der Lyse der Zellen wurde die Bindungskinetik der GFP-Proteine mittels Turfmikroskopie sichtbar gemacht.

Zeitpunkt 0,1 markiert die Einführung des Lysepuffers, zum Zeitpunkt 0,2 beginnt sich GFP an der Oberfläche anzusammeln, was bedeutet, dass die Zelllyse stattgefunden hat und GFP an die Oberfläche diffundiert ist. Die Bindung von GFP an die Antikörper ist zum Zeitpunkt 0,3 abgeschlossen. In diesem letzten Beispiel wurden freigesetztes GA DH, das an Fängerantikörper auf der Oberfläche gebunden ist, und dann HRP-gekoppelte Detektionsantikörper hinzugefügt.

Nachdem alle ungebundenen Nachweisantikörper weggespült worden waren, wurde das Nachweisreagenz eingeführt und die Reaktion erfolgte im Laufe der Zeit. Hier ist ein Vergleich der Menge an ehemals intrazellulärem GA DH in tierischen Mengen zwischen U 9 37 und HEC 2 93 Zellen, die mit dieser Methode gemessen wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die mikrofluidischen Chips vorbereiten, wie Sie die Oberfläche modifizieren, um Immunoassays zu ermöglichen, und schließlich, wie Sie das Gerät für die Einzelzellanalyse verwenden.

Diese Methode kann zur Beantwortung vieler aufwerfender Fragen im Bereich der Einzelzellbiologie eingesetzt werden.