Name: Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Einzelzellen mit einem mikrofluidischen Chip, der Fluoreszenz- und Immunoassays für die Quantifizierung intrazellulärer Proteine nutzt. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zellulärer Heterogenität.

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Die Autoren danken Tom Robinson für das Korrekturlesen des Manuskripts, C. Bärtschi und H. Benz für den Bau des custom-built Druck-Kontrollsystem. Wir möchten auch auf die Verwendung des Reinraum FIRST und der Lichtmikroskopie Center (LMC), die beide an der ETH Zürich zu bestätigen. Die Arbeit wurde von Merck Serono und des Europäischen Forschungsrates (ERC) im 7. Rahmenprogramm (ERC Starting Grant, Projekt-Nr. 203428, nμLIPIDs) finanziert.

1. SU-8 Master Fabrication Bereiten Sie die beiden Master-Formen für die Kanäle (fluidische und Kontrolle, für Schaltpläne und Abmessungen siehe Abbildung 2) mit dem folgenden Protokoll, aber mit unterschiedlichen Maskenmustern. Das Verfahren wird in Fig. 3a gezeigt. <ol><li> Beginnen, indem eine 4-Zoll-Siliciumwafer 10 min lang bei 180 ° C Laden Sie die dehydriert Wafer auf einem Spin-Coater und verwenden Sie die folgende Protokoll für Spin-Coating-SU-8 2015: <ol><li> Spin-Wafer bei 100 Upm für 20 sec (offene Deckel des Spin-Coater, verzichten SU-8 in diesem Schritt, Deckel schließen nach der Ausgabe). </li><li> Spin-Wafer bei 500 rpm für 10 sec (das wird weiterwider über den gesamten Wafer). </li><li> Schleuderscheibe bei 1750 Upm für 30 sec (definiert die Höhe des Resists zu 20 um). </li></ol></li><li> Entfernen Resist vom Rand des Wafers mit Aceton (mit einem Tupfer), da dies sonst zu der Kochplatte im nächsten Schritt zu halten. Übertragen Sie die Wafer ahotplate bei 95 ° C und Wärme für 4 min. Nach dem Softbake, setzen durch eine Photomaske mit Klebeband an der Resist Glas in einem Mask Aligner mit UV-Licht (150 mJ / cm 2, gemessen bei 365 nm) Kalk-Natron. </li><li> Nach der Belichtung wird der Wafer wieder erwärmen auf 95 ° C für 5 min auf einer Heizplatte. Kühlen Sie den Wafer auf RT und dann eintauchen in ein Bad aus SU-8-Entwickler für 4 min. Schütteln Sie vorsichtig, um nicht belichteten SU-8 zu entfernen. Waschen des Wafers mit Reinraum-Klasse Isopropanol und trocken blasen mit Stickstoff. Prüfen unter einem Mikroskop, wenn die Entwicklung erfolgreich (vor allem die Zellfallen) war. Wenn die Zelle Fallen vollständig entwickelt, sollte die Reflexion des Silizium-Wafers sichtbar. Falls notwendig, die Entwicklung der Wafer wieder für ein paar Minuten. </li><li> Backen des Wafers in einem Ofen für 2 Stunden bei 180 ° C, um alle Restlösungsmittel zu entfernen. Überprüfen Sie die Höhe der Kanäle mit einer Schritt-Profiler. Wenn die Höhe unterscheidet sich von der gewünschten Höhe, wiederholen dieses Protokoll ab Schritt 1.1 mit einem neuen Wafer undändern Sie die Spin-Geschwindigkeit (Schritt 1.1.3). Schließen Sie die Herstellung der Urform durch Silanisierung des Wafers mit 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluordecyl-dimethylchloro-Silan in einem Exsikkator über Nacht. </li></ol> 2. Meister Fertigung für Mikrokontaktdruck <ol><li> Um Master-Formen für Mikrokontakt-Drucken vorbereiten, dehydrieren einen Silizium-Wafer für 10 min bei 180 ° C Spin-Coat 1 ml HDMS auf diesem Wafer bei 7.500 rpm für 30 sec (das Resist haftet besser auf einen silanisierten Oberfläche). Spin-Coat 2 ml AZ1518 positiven Resist mit diesem Protokoll: <ol><li> Statische Abgabe des Resists auf dem Wafer. </li><li> Spin-Wafer für 5 Sekunden bei 500 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Spin-Wafer für 60 Sekunden bei 4000 Umdrehungen pro Minute. </li></ol></li><li> Nach einer 50 Sekunden Softbake bei 100 ° C auf einer Heizplatte, setzen die wider UV-Licht (21 mJ / cm 2 bei 365 nm) durch eine Photomaske und auf einem Mask Aligner. Entwicklung des Resists in einem Bad von AZ 726 für 75 Sekunden. Mit DI-Wasser und Schlag d spülen entwickelte Waferry mit Stickstoff. Entfernen restlichen Lösungsmittels durch Erwärmen des Wafers auf 115 ° C für 50 sek. Silanisieren den Wafer unter Vakuum über Nacht. </li></ol> 3. Herstellung der Mikrofluid-Chip Ein Zweischicht-Einrichtung Entwurf wird für diese Experimente verwendet. Die beiden Schichten werden getrennt hergestellt und miteinander verbunden werden, bevor der Chip wird schließlich auf einen Glasträger (3b) verbunden ist. Dieser Schritt ist die Herstellung der Schichten und die PDMS PDMS-Stempel für Mikrokontaktdruck. <ol><li> Bereiten Sie eine 10:1-Mischung von PDMS und Härter. Bereiten Sie etwa 80 g PDMS insgesamt (unter Verwendung unserer Designs, wird dies in 10 Chips führen). Mischen Sie die beiden Teile kräftig und entgast PDMS, bis die Mischung blasenfrei ist (~ 30 min). </li><li> Setzen Sie den Wafer mit der Kontrollschicht in einer Petri-Schale und kleben Sie es auf den Boden. Weiter, gießen ~ 50 g PDMS auf und legte die Scheibe für mindestens 2 Stunden in einem Ofen bei 80 ° C und gewährleisten eine vollständigeHärten der PDMS. Wiederholen Sie den Vorgang für den Mikrokontaktdruck-Wafer, dafür ~ 20 g PDMS benötigt wird. </li><li> Schleuderbeschichtungs PDMS auf dem Wafer mit der Fluidschicht mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 2.000 UpM, um eine etwa 40 um hohen PDMS-Schicht zu bilden. Härten des PDMS in einem Ofen mindestens 1 h bei 80 ° C. </li><li> Wenn beide Teile ausgehärtet ist, entfernen Sie die Schutzschicht von der Wafer-und in Stücke schneiden mit einer Rasierklinge. Punch-Druckanschluss Löcher durch die Verwendung eines 1 mm Biopsie Puncher. Für die Lagerung, ist es ratsam, ein Stück Klebeband über die Kanäle setzen. </li><li> Um die beiden Schichten zu verbinden, nehmen Sie die Spin-beschichtete Wafer und das Oberteil und legen Sie sie in einem Plasmafilter 23. Nach der Plasmabehandlung, beide Teile schnell unter einem Mikroskop mit großem Arbeitsabstand auszurichten. Fügen Sie einige Ersatz PDMS um die oberen Teile gelegt. Dieser Schritt ist nicht zwingend, aber es die Entfernung der PDMS von dem Wafer ermöglicht. Platzieren des Wafers in einem Ofen bei 80 ° C für mindestens 1 h. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell vorsichtig die PDMS von der Wafer-und die Mikrochips geschnitten. Punch-Zugang Löcher für die fluidischen Anschlüsse mit einem 1,5 mm-Biopsie Puncher. </li><li> Die PDMS-Chip ist nun fertig und kann über Monate gelagert werden. Optional: Wenn der Chip mit einem Reservoir verwendet, schneiden Sie den oberen Teil einer 200 ul Pipettenspitze und verwenden einige Ersatz, halb ausgehärteten PDMS, um sie oben zu kleben. Setzen Sie den Chip im Backofen wieder auf 80 ° C für mindestens 1 Stunde. </li></ol> 4. Die Bindung an Glas Slide Um das Gerät für den direkten enzymatischen Assays verwenden, ist der einzige Schritt, nach der Verklebung erforderlich die Sperrung von Oberflächen. Aus diesem Protokoll, A. gehen jedoch die Mikrofluidik-Chip für Immunoassays oder ELISAs verwenden Sie bitte Protokoll B beziehen sich auf die Bindungsstellen nur auf den Glasobjektträger (dh für die TIRF-Mikroskopie oder SPR) zu beschränken. Wenn diese Einschränkung nicht wichtig ist, beziehen sich auf A, sondern verwenden biotinylierte Konjugate in Schritt 4.3 und fahren Sie mit Schritt 4.8in Protokoll B, um eine voll funktionsfähige Oberfläche. Vor der Durchführung Protokoll A und B: Es wird empfohlen, alle verwendeten Proteinlösungen vor der Einbringung in den Chip auswählen. Schutt und Proteinaggregate anderweitig zu blockieren Zellfallen, wodurch die Anzahl der Kammern, die für die Analyse verwendet werden können, verringert wird. Zu diesem Zweck, verwenden Sie eine nicht-Protein-Adsorptions-Filtereinheit, die alle Lösungen vor Aufnahme in die Kanäle zu filtern. Protokoll A (enzymatische Assays) <ol><li> Um die Mikrofluid-Vorrichtung abzuschließen, verbinden die PDMS-Teile auf einem Glasträger. Um dies zu tun, zuerst reinigen einen Glasobjektträger mit Seife, destilliertem Wasser und Ethanol. Trocknen Sie die Folie mit einem Stickstoffstrom. Reinigen Sie die PDMS Teil mit Klebeband. </li><li> Setzen Sie die PDMS-Teil und die gereinigte Glasobjektträger in die Plasmareiniger für 45 Sekunden bei 18 W. Um eine feste Bindung zu gewährleisten, setzen Sie den Chip auf einer heißen Platte (100 ° C) für 5 min. </li><li> Nach dem Verkleben, füllen Sie den Chip mit fLUID. Eine einfache Möglichkeit, dies zu erreichen, ist die Zentrifugalkraft zu verwenden. Schneiden Sie den unteren Teil von 200 ul Pipettenspitze. Für die Fluidkanäle, füllen sie mit der Blockierungslösung (Rinderserumalbumin (4% w / v) oder Poly-L-Lysin) gepfropfte Polyethylenglykol (0,05% w / v) und setzen die Spitzen in die Einlässe. Füllen Sie die Steuerschicht Buchten entweder mit Wasser oder mit einer isosmotischen Lösung, zB PBS. Legen Sie die Chips in die Zentrifuge (800 × g) für 5 min. Die Kanäle sollen nun mit Flüssigkeit vollständig gefüllt sein. Wenn nicht, wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Inkubieren der Blockierungslösung für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Waschen der Lösung aus dem Flüssigkeitsschicht mit PBS bei einer Flussrate von 10 &amp;mgr; l / min unter Verwendung einer Spritzenpumpe. Das Gerät ist nun bereit für die Zellexperimente. </li></ol> Protokoll B (Immunoassays) Für eine komplette Übersicht über die Oberflächenmodifikation von Schritt ab 4.7 finden Sie in Tabelle 1 beziehen. <ol start="5"><li> Incubate PDMS-Stempel für Mikrokontakt-Drucken mit einer BBSA / BSA-Lösung (z. B. 1-100). Nach 30 Minuten, reinigen Sie die Briefmarken gründlich mit destilliertem Wasser und trocknen Sie den Stempel unter einem Strom von Stickstoff. Platzieren schnell die Stempel auf einem gereinigten Glasobjektträger (4). </li><li> Setzen Sie die Glasobjektträger mit dem Stempel zusammen mit dem oberen Teil des mikrofluidischen Chips Sauerstoffplasma für 45 sec bei maximaler Leistung (18 W) in einem Plasma-Reiniger. Nach der Plasmabehandlung, entfernen Sie den Stempel, und richten Sie die bedruckte Oberfläche unter den Kleinst des Gerätes. Platzieren der Chip für 30 Minuten auf einer Heizplatte bei 50 ° C </li><li> Um die verbleibende Fläche zu blockieren, führen sterilfiltriert BSA-Lösung (4% (w / v) in PBS) in den Chip mit einer Zentrifuge (siehe Schritt 4.2). Inkubation für 1 Stunde und waschen Sie die Lösung aus der Fluidschicht mit PBS (siehe Schritt 4.3). Der Chip kann dann direkt oder bei 4 ° C in einer feuchten Box verwendet für bis zu 2 Wochen gelagert werden. </li><li> Für eine voll funktionsfähige Bindungs ​​surface, einzuführen Avidin (0,025% (w / v) in PBS) in den Vorratsbehälter. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 5 &amp;mgr; l / min für 30 min, um die Avidin-Lösung durch die Fluidkanäle zu entziehen. Danach spülen PBS für 10 min. Spülen Sie den Behälter gründlich. </li><li> Anschließend fügen Protein G (0,0025% (w / v) in PBS) und bündig für weitere 30 min. Danach Waschen mit PBS für weitere 10 min. Anschließend fügen Sie den Antikörper von Interesse (0,0001% (w / v) in PBS) für 10 min. Nach 10 min, stoppen den Fluss für 15 min Bindung zu ermöglichen. Weiter, waschen mit PBS für 10 min. </li></ol> 5. Zellexperimente Das Protokoll wird im Allgemeinen wegen der Vielzahl der möglichen Tests geschrieben. Als Beispiel werden die Reagenzien für den Assay benötigt G6PDH Toxizität angegeben. Die anfängliche Zellrückhalteleistung der Vorrichtung etwa 2,5%, das heißt 5 von 200 Zellen eingefangen werden. Die endgültige Belegung der Zelle Fallen hängt stark von der verwendeten Zelllinie, das Protokoll zu unterbrechendie Zelllinie und die Zeit, die Zellen werden durch den Kanal gespült. Für Zellen in Suspension (wie U937) natürlich wachsenden, können einzelne Zellen in etwa 75% der Kammern nach wenigen Minuten gefunden werden. Die anderen Kammern sind entweder nicht gefüllt ist, oder durch zwei oder mehr Zellen besetzt. Im allgemeinen ist die Einzelzellbelegung kleiner für adhärente Zelllinien. Bei Verwendung des hier vorgestellten eher milde Suspensions Protokoll nimmt der Anteil auf etwa 30% (HEK, MLT Zellen). Die Einzelzellbelegung kann durch Trypsin-Behandlung der Zellen verbessert werden, aber dies kann auch die Ergebnisse der Experimente zu ändern. Abhängig von dem Zielmolekül, kann die Adsorption oder Absorption an PDMS die Ergebnisse beeinflussen. Adsorption kann durch Blockieren der Oberflächen mit BSA oder PLL-g-PEG reduziert werden. Absorption ist unwahrscheinlich, für die meisten hydrophilen Biomoleküle, aber es sollte für (Klein-) lipophilen Zellkomponenten überprüft werden. <ol><li> Vorbereitung der Zellen gemäß dem spezifischen Protokoll (zB </em&gt; Drogenabhängigkeit). Für Suspensionszellen, fügen Zellen direkt in den Chip. Für Klebezelllinien verwenden enzymfreie Dissoziationspuffer um eine Zellsuspension zu erzeugen. Filtern Sie die Zellen vor, um die Einführung der Chip sie die Menge an Zellcluster zu reduzieren. </li><li> Laden der Zellen auf dem Chip unter Verwendung einer Spritzenpumpe und Vorlauf, statt der Zellsuspension zurückziehen. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 5 &amp;mgr; l / min für Suspensionszelllinien und höhere Durchflussraten von 10-20 &amp;mgr; l / min für Haftzellen, da unspezifische Bindung der Zellen auf den Kanalwänden zu reduzieren. </li><li> Wenn die Fallen gefüllt sind, schließen die Kammern. Wenn viele Zellen anhaften unspezifisch an der Oberfläche, versuchen, sie mit einer Fließgeschwindigkeit von 10-30 ml / min abzuwaschen mit Zelldissoziationspuffer. </li></ol> Protokoll A (enzymatische Assays) <ol start="4"><li> Ziehen Lyse-Puffer durch den Chip. In diesem Beispiel ist dies ein Puffer hypoosmolar Puffer mit Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1% (v / v) Tween 20). Für die Lyse, schnell öffnen und schließen Kammern (dh 500 ms für Flussraten von 10-50 ml / min 7,21). Assay für die G6PDH, add 2 mM Glucose-6-Phosphat, 0,5 mM NADP, 0,5 U / ml Diaphorase und 0,3 mM Resazurin dem Lysepuffer. Starten Sie die Überwachung der kinetischen Reaktion sofort nach der Lyse. </li></ol> Hinweis: Wählen Sie eine beliebige Puffer, die sich für den Test ist, beachten jedoch, dass nackten starke Reinigungsmittel (wie Triton, SDS) lysiert Zellen sofort und wird zu einem Verlust von Analyten in Kammeröffnung führen. Protokoll B (Immunoassays) Für eine kurze Beschreibung der ELISA Zellexperimenten (Durchflussmengen-, Kammer-Status, etc.), bitte die Tabelle 1 verwiesen. <ol start="5"><li> Für ELISA, fügen Sie die erforderlichen Nachweis-Reagens (z. B. sekundäre Antikörper, markierte Antigen) direkt an der Lyse-Puffer. Die hierin aufgenommen Tween 20 reduziert die unspezifische Adsorption. Lyse der Zellen nach Schritt 5.4. Inkubieren der Mischung für 10-15 Minuten Bindung (Inkubation je nach dem verwendeten Antigen und Antikörper) zu ermöglichen. </li><li> Antikörper-Enzym-Konjugate, die spezifisch an den Kanalwänden adsorbiert kann bis zu einem Umsatz des Nachweisreagenz schon innerhalb des Reservoirs und Kanäle führen. Um Probleme dieser Adsorption reduzieren, spülen eine dauerhafte Inhibitor des Enzyms verwendet Erkennung durch den Chip während der Inkubationszeit (Kammern geschlossen, vor der Zugabe des Detektions-Reagenz). Für HRP, verwenden Sie 20 mM HCl in Wasser, um die Enzyme unspezifisch adsorbiert dauerhaft zu inaktivieren. </li><li> Nach der Inkubationszeit, stellen die Nachweisreagenz (zB Amplex Red und Wasserstoffperoxid für HRP) auf dem Chip. Öffnen Sie die Kammern in Kürze erneut, um die nicht gebundenen sekundären Antikörper abzuwaschen und die Detektions-Reagenz hinzufügen. Start sofort die Überwachung der kinetischen Reaktion. </li><li> Kalibrierung: UnbeweglichkeitseffektDer Antikörper gegen das Ziel von Interesse. Schließen Kammern. Bereiten unterschiedlichen Konzentrationen des Analyten in Puffer oder in Zelllysat Off-Chip. Tragen Sie eine Konzentration auf den Chip und tauschen das Volumen innerhalb der Kammern (500 ms Öffnungszeit) schnell. Diese Öffnungszeit kurz genug ist, um sicherzustellen, dass keine zusätzliche Ansammlung von Analyten Spülen auftritt, und nur eine bestimmte Anzahl von Molekülen aus dem Volumen der Mikrokammer detektiert werden. Aus der bekannten Konzentration des Antigens in der Lösung und das Volumen der Kammer (625 pl), die Berechnung der Menge in der Kammer. Anschließend mit Schritt 5.5 fort und die Einführung der Nachweiseinheit. </li></ol>

<ol><li>Walling, M. A., Shepard, J. R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+and+live+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity and live cell arrays.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).</li>
<li>Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological single cell analysis.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).</li>
<li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+single+cell+analysis%3A+from+promise+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li>
<li>Faley, S., Seale, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platform+for+real-time+signaling+analysis+of+multiple+single+T+cells+in+parallel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel.</a> Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+enzyme+concentrations%2C+kinetics%2C+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).</li>
<li>Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyphenated+optical+trap+capillary+electrophoresis+laser+induced+native+fluorescence+system+for+single-cell+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis.</a> Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchamber+array+for+single+cell+isolation+and+analysis+of+intracellular+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules.</a> Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li>
<li>Ma, C., Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Shi, Q., Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+circulating+tumor+cells%3A+transcriptional+heterogeneity+and+diversity+from+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines.</a> PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).</li>
<li>Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+polarity%2C+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell polarity, stem cells and cancer.</a> Nature. 12 (1), 23-38 (2012).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li>
<li>Gao, Y., Majumdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+valve-enabled+microfluidic+cell+co-culture+platform+and+demonstration+of+its+applications+to+neurobiology+and+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology.</a> Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).</li>
<li>White, A. K., VanInsberghe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+RT-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).</li>
<li>Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+real+time+analysis+of+protein+secretion+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Towards real time analysis of protein secretion from single cells.</a> Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).</li>
<li>Huang, N. T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.</li>
<li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li>
<li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+%28G6PD%29%3A+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Mikrofluidik-Technologie hat neue und faszinierende Möglichkeiten für die Einzelzellanalyse eröffnet. Insbesondere hat die Möglichkeit, zu fangen und zu immobilisieren Zellen einzeln von Mikrofluidik-Tools systematische Kurz-und Langzeitstudien auf Einzelzelleigenschaften und der Reaktion erlaubt. Zusätzlich Verkapselung von Zellen in hoher Frequenz Mikrotröpfchen auf einem Mikrochip erzeugt hat einzelne Zelle Sekretion Studien, die mit herkömmlichen Vorrichtungen durchgeführt werden Zytometrie kann aktiviert. Die Mikro...

Viele Studien haben in der Vergangenheit Zell-zu-Zell-Unterschiede innerhalb einer großen Zellpopulation 1-3, insbesondere Signalprozesse 4 oder die Mengen an intrazelluläre Biomoleküle wie Proteine ​​5,6, Metaboliten, und Cofaktoren 7,8 ergab. Diese Heterogenitäten werden als grundlegend wichtig für die Zell Anpassung und Evolution 9 zu sein, aber auch eine Schlüsselrolle in der Entstehung und Behandlung von Krankheiten wie Krebs 13.10. Daher Studien über die Einzelzellebene sind von hohem Interesse in der biologischen und pharmakologischen Forschung, insbesondere, wenn diese Studien zeigen die verschiedenen Zell-Reaktionen nach der Behandlung mit bioaktiven chemischen Substanzen. In den letzten Jahren haben viele analytische Plattformen entwickelt worden, die die Analyse von einzelnen lebenden Zellen oder die chemische Zusammensetzung des Zellinhalts zu erleichtern. Während die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ist der Gold standard für sehr hohe Durchsatzanalyse von einzelnen lebenden Zellen, wobei das Verfahren nicht für die Bestimmung von intrazellulären und sekretierten Verbindungen eingesetzt werden. Die Entstehung von mikrofluidischen Plattformen hat neuartige analytische Strategien für die Positionierung, Behandlung und Beobachtung von Einzelzellen versprochen. Ein Meilenstein in der Mikrofluidik wurde mit der Integration der flexiblen PDMS Ventile von Quake und Mitarbeiter realisiert 14,15 erreicht. Diese Ventile sind nützlich, da sie Regionen auf dem Chip zu isolieren, z. B. zwei Kulturen trennen 16. Darüber hinaus sind sie besonders geeignet für Einzelzellanalyse und helfen, Probleme zu reduzieren Analyten Verdünnung daher. Die Kraft dieser Ansatz für die Einzelzellanalyse wurde kürzlich von Hansen und Mitarbeiter, die die Genexpression von Hunderten von Einzelzellen parallel analysiert 17 demonstriert. Wenn Targeting-Proteinen und Metaboliten ist die Analyse sehr schwierig aufgrund des Fehlens von geeigneten einmplification Methoden, die große Anzahl von verschiedenen Verbindungen enthalten, und ihre Variationen in der chemischen Natur. Darüber hinaus sind die meisten intrazelluläre Biomoleküle erwartet in geringer Kopienzahlen in der Größenordnung von einigen zehntausend 18 anwesend zu sein, daher der verwendeten analytischen Methode muss eine hohe Empfindlichkeit. Stärker Assays wie Immunoassays und Enzym-Immunoassays (ELISA) sind schwer in mikrofluidischen Systemen zu integrieren, da sie erfordern mehrere Wasch-und Inkubationsschritte sowie Oberflächen Immobilisierung. Aufgrund dieser Herausforderungen ist es nicht verwunderlich, dass nur ein paar Beispiele berichtet, bei denen Proteine ​​oder Metabolite wurden auf der Ebene einzelner Zellen quantifiziert. Beispielsweise wurden Studien über die Sekretion von fluoreszierenden Verbindungen wurde berichtet 19,20. Kürzlich wurde die Umsetzung mit ELISA zur Analyse von sezerniertem (nicht fluoreszierenden) Proteine ​​aus der Zellkultur (THP-1-Zellen) und 21 Einzel (i präsentiertmmune) Zellen 10. Targeting intrazellulären Proteinen, Shi et al. Entwickelten eine Mikrofluidik-Vorrichtung, welche die Identifikation von intrazellulären Proteinen für die Untersuchung von Signalwegen in Tumorzellen mittels eines Immunoassays 11 erleichtert. Aber nur die relativen Mengen von Proteinen bestimmt und keine enzymatische Amplifikation wurde verwendet, um das Signal für niedrige vorhandenen Proteine ​​zu erhöhen. Kürzlich waren wir in der Lage, ein Single-Cell-Trapping Kleinst mit Fluoreszenz-Assays 8 und 22 Immunoassays (Abbildung 1) zu kombinieren. Die Zellen werden passiv in mikrofeinen Hürde Strukturen, die Angebot und (schnelle) Austausch von mittel-und andere chemische Mittel ohne jede Bewegung der Zellen zu ermöglichen gefangen. Ein ringförmiger Ventil um jede Falle ermöglicht Isolierung der Zelle in einem sehr kleinen Volumen (&quot;der Mikrokammer&quot;). Dieses Ventil wird sofort nach Einführung einer Zell-Lyse (hypoosmolare)-Puffer, er betätigtnce Verhinderung intrazelluläre Moleküle oder Moleküle diffundieren abgesondert entfernt. Vor allem wegen der kleinen Größe des Volumens (625 pl) große Verdünnung der Moleküle verhindert wird. Da Lyse und Analyse sind in an der gleichen Position auf dem Chip durchgeführt wird, gibt es keinen Verlust von Analyten durch Transport. Die hier beschriebene Chip-Design besteht aus 8 Zeilen abwechselnd entweder 7 oder 8 Kleinst, insgesamt 60 Kleinst. Die Kammern sind in Reihen angesteuert, so dass eine Kreuzkontamination entlang einer Linie ausgeschlossen wird. Die Plattform kann in Kombination mit Fluoreszenz-Assays und immunologische Assays (1d) verwendet werden. Für letztere haben wir Protokolle zur Immobilisierung der Antikörper, die mit der Chip-Herstellung-und Montageprozess kompatibel sind. Daher die Plattform öffnet den Weg für empfindliche, zuverlässige und quantifizierbare Assays auf Einzelzellebene. Bis jetzt haben wir das Gerät für die Analyse von i verwendetntracellular und sezernierten Enzyme (relative Quantifizierung durch enzymatische Assays), intrazellulären Cofaktoren, Proteinen und kleinen Molekülen (absolute Quantifizierung von Endpunkt-Assays oder ELISA). Im Folgenden beschreiben wir den Prozess der Chipherstellung durch Mehrschicht-Weichlithographie und Protokolle zur Strukturierung der Antikörper durch Mikrokontaktdruck und Oberflächenchemie. Darüber hinaus werden einige Beispiele für den Einsatz und Betrieb Chip gegeben.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name des Reagenzes</td><td></td><td>Katalognummer</td><td>des Unternehmens Bemerkungen (optional)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluordecyl-dimethylchlor-silan <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ABCR (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &beta;-D-N,N&prime;-Diacetylchitobiosidhydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Deutschland)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Deutschland)</td><td>n.a.AZ</td><td></td></tr> <tr><td>726 Entwickler</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Deutschland)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin, Biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>Zelldissoziationspuffer</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan (HDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Deutschland)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR Entwickler 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlin, Deutschland)</td><td>n.a.PBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG transplantiertes</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, Schweiz)</td><td>n.a.PLL-g-PEG</td><td></td></tr> <tr><td>gepfropftes Biotin</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, Schweiz)</td><td>n.a.Kaliumchlorid</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Protein G, Biotin</td><td>Sigma Feinchemikalien</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumwafer</td><td>Si-Mat (Kaufering, Deutschland)</td><td>n.a.Sylgard</td><td></td></tr> <tr><td>184 Silikonelastomer Kit (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1610716</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>AUSSTATTUNG:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialname</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare (optional)</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m PES Spritzenvorsatzfilter</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1,5 mm Biopsie-Puncher</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics Filter 20 & Mikro; m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.Hotplate</td><td></td></tr> <tr><td>HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, Schweiz</td><td>n.a.MA-6</td><td></td></tr> <tr><td>Mask Aligner</td><td>Karl Suess</td><td>n.a.Multizoom</td><td></td></tr> <tr><td>AZ100M Mikroskop</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.Photomask</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microlitho, Essex, U.K.</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>Coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>Module SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Schweiz</td><td>n.a.Step</td><td></td></tr> <tr><td>Profiler Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.Spritzenpumpe</td><td></td></tr> <tr><td>neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

eine mikrofluidische chip für die vielseitige chemische analyse von einzelzellen

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Wir stellen eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die die quantitative Bestimmung der intrazellulären Biomoleküle in mehreren Einzelzellen parallel ermöglicht. Zu diesem Zweck werden die Zellen passiv in der Mitte eines Mikrokammer gefangen. Nach der Aktivierung des Steuerungsschicht wird die Zelle von der umgebenden Volumen in einer kleinen Kammer isoliert. Die umgebende Volumen kann dann ohne die isolierte Zelle ausgetauscht werden. Jedoch nach kurzer Öffnen und Schließen der Kammer, wobei die Lösung in der Kammer in ein paar hundert Millisekunden ersetzt werden. Aufgrund der Reversibilität der Kammern, die Zellen können an verschiedenen Lösungen nacheinander in einer hoch steuerbar, z. B. für die Inkubation, Waschen und schließlich Zelllyse ausgesetzt werden. Die dicht verschlossenen Kleinst ermöglichen die Retention des Lysats, zu minimieren und die Verdünnung zu steuern, nachdem Zell-Lyse. Seit Lyse und Analyse an der gleichen Stelle auftreten, wird eine hohe Empfindlichkeit beibehalten, da keine weitere dilution oder Verlust der Analyten erfolgt während des Transports. Die Mikrokammer-Design ermöglicht somit die zuverlässige und reproduzierbare Analyse sehr kleiner Kopienzahlen von intrazellulären Molekülen (attomol, zeptomoles) aus einzelnen Zellen freigesetzt wird. Darüber hinaus können viele Mikrokammern in einem Array-Format angeordnet werden, wodurch die Analyse von vielen Zellen gleichzeitig, da die geeignete optische Geräte für die Überwachung verwendet wird. Wir haben bereits die Plattform für den Proof-of-Concept-Studien verwendet, um intrazelluläre Proteine, Enzyme, Cofaktoren und Botenstoffe in relativ oder absolut quantifizierbare Weise zu analysieren.

Unsere Plattform ist in der Lage, eine Vielzahl von intrazellulären und sekretierten Molekülen in Gegenwart oder durch einzelne Zellen produziert analysieren. Hier möchten wir beispielsweise verschiedene Studien, um die Vielfalt der möglichen Tests unterstreichen präsentieren. Wir werden ein Beispiel für ein sezerniertes Enzym (5a) sowie ein intrazelluläres Enzym (Fig. 5b) und Protein (Fig. 5c und d) erhalten wird. Weitere Beispiele, wie Cofaktoren oder...

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Einzelzell-Lysate mithilfe von Fluoreszenz- oder Immunoassays zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mikrofluidische Vorrichtung hergestellt und die innere Kammer mit Antikörpern beschichtet wird. Anschließend werden Einzelzellen in den Fallen immobilisiert und im zweiten Schritt verschiedenen Reagenzien ausgesetzt, um eine zelluläre Reaktion auszulösen.Ein ringförmiges Ventil wird schnell geschlossen, und Lysepuffer wird durch das Gerät geleitet. Das ringförmige Ventil wird kurz geöffnet, wodurch die Zellen innerhalb der Mikrokammer lysiert werden, sodass freigesetzte Proteine aufgrund des geringen Volumens in hoher Konzentration an die Antikörper binden können. Anschließend wird das ringförmige Ventil geöffnet.Die Kammer wird gewaschen und Nachweisreagenzien werden in die geschlossene Mikrokammer eingeführt. Der Anstieg der Fluoreszenzintensität wird über die Zeit hinweg mittels eines Fluoreszenzmikroskops überwacht. Die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit dieses Systems, einen Analyten von Interesse, der von einzelnen Zellen freigesetzt wird, quantitativ und zuverlässig nachzuweisen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Einzelzellanalyse zu beantworten.Besonders fehlten systematische Untersuchungen zur zellulären Antwort auf Veränderungen im chemischen Milieu. Wir können die Hoch- oder Herunterregulation intrazellulärer Moleküle als Reaktion auf den chemischen Reiz beobachten. Diese Technik weist zwei wesentliche Vorteile auf.Erstens können wir die immobilisierten Zellen einer definierten chemischen Umgebung aussetzen, die konstant oder periodisch wechselnd ist. Zweitens können wir hochsensible und spezifische Analysen des Zustands erneut durchführen, ohne dass eine Kreuzkontamination oder ein Verlust der Analyten durch Transport entsteht. Um zu beginnen, stellen Sie die drei verschiedenen SU-8-Masterwafer wie in der begleitenden Textanleitung beschrieben her.Eines wird zur Herstellung der Fluidikschicht verwendet, eines für die Steuerschicht und ein drittes für den Mikrokontakt-Abdruck. Anschließend werden die mikrofluidischen Chips hergestellt, beginnend mit der Herstellung eines 10:1-Gemischs aus PDMS und einem Härtungsmittel. Beide Komponenten gründlich vermischen und die Lösung 30 Minuten lang entgasen oder bis das Gemisch blasenfrei ist.Als Nächstes platzieren Sie die Wafer in der Steuerschicht innerhalb einer Petrischale und befestigen sie mit Klebeband am Boden. Gießen Sie etwa 50 Gramm PDMS darauf, um eine vier bis fünf Millimeter dicke Schicht zu erzeugen, und stellen Sie die Wafer mindestens zwei Stunden lang in einen Ofen bei 80 Grad Celsius, um eine vollständige Aushärtung des PDMS sicherzustellen. Wiederholen Sie denselben Vorgang für die Wafer zur Mikrokontaktkopie, verwenden Sie jedoch etwa 20 Gramm PDMS statt 50, wodurch eine vier bis fünf Millimeter dicke PDMS-Schicht entsteht.Um die untere Schicht vorzubereiten, wird eine 40 µm dicke PDMS-Schicht mittels Spin-Beschichtung auf den Wafer mit der mikrofluidischen Schicht aufgebracht. Drehen Sie hierzu mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 2000 U/min für 60 Sekunden. Anschließend wird die PDMS-Schicht im Ofen eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius ausgehärtet, sobald alle Teile ausgehärtet sind.Entfernen Sie die Steuerschicht von der Wafer und schneiden Sie sie mithilfe der Rasierklinge in Stücke. Stanzen Sie anschließend die Druckanschlusslöcher mit einer ein Millimeter großen Biopsiepunchvorrichtung aus und verschließen Sie die Kanäle mit Klebeband zur Aufbewahrung. Entfernen Sie danach das PDMS von der Mikrokontaktdruck-Wafer und bereiten Sie Stempel in der Größe des Kammerbereichs vor.Bewahren Sie sie staubfrei in einer Schublade bis zur Verwendung auf. Anschließend bringen Sie den spin-beschichteten Wafer und die vier bis fünf Millimeter dicke Steuerschicht in einen Plasma-Reiniger ein. Exponieren Sie die Stücke 45 Sekunden lang bei 18 Watt mit Sauerstoffplasma bei 0,75 Millibar.Nach der Plasmabehandlung beide Schichten unter einem Mikroskop mit großem Arbeitsabstand schnell ausrichten. Einige zusätzliche PDMS-Menge um die platzierten oberen Teile herum hinzufügen, um die Entfernung des PDMS von der Wafer zu erleichtern. Anschließend den Wafer mindestens eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius in einen Ofen stellen.Nach der Aushärtung das PDMS vorsichtig mit einem Skalpell vom Wafer lösen und die Mikrochips mithilfe einer 1,5 Millimeter-Biopsiepistole ausschneiden, um Zugangsöffnungen für die fluidischen Anschlüsse zu schaffen. Zusätzlich einen Vorratsbehälter im Mikrochip anlegen, indem man das obere Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze abschneidet und etwas zusätzliches, teilweise ausgehärtetes PDMS verwendet. Dieses daraufkleben.Anschießend den Chip mindestens eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius im Ofen aushärten lassen. Beginnen Sie damit, einen Objektträger und PDMS-Teile zu reinigen. Reinigen Sie einen Objektträger mit Seife.Spülen Sie es mit destilliertem Wasser und danach erneut mit Ethanol ab. Trocknen Sie den Objektträger mit einem Stickstoffstrom. Entfernen Sie mithilfe von Klebeband jegliche Verunreinigungen und Staubpartikel aus dem PDMS. Danach das PDMS-Teil und das gereinigte Glas platzieren. Für 45 Sekunden bei 18 Watt in den Plasma-Reiniger schieben, um eine feste Bindung sicherzustellen; nach der Plasma-Behandlung den Chip fünf Minuten lang auf eine Heizplatte stellen. Nach dem Bonding den unteren Teil mehrerer 200-Mikroliter-Pipettenspitzen abschneiden. Diese mit 10 bis 15 Mikrolitern filtriertem PBS mit 4 % BSA füllen und in die Zuleitungen des Geräts einsetzen.Verwenden Sie anschließend abgeschnittene Pipettenspitzen mit zugegebenen 10 bis 15 Mikrolitern PBS und geben Sie diese in die Kontrollkanäle. Danach platzieren Sie die Chips in die Zentrifuge und zentrifugieren sie fünf Minuten lang mit 800 × g, um die Kanäle mit Flüssigkeit zu füllen. Falls sich in einigen Kanälen noch Luft befindet, wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Kanäle vollständig gefüllt sind.Die Blockierungslösung mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend wird die Lösung aus der Flüssigkeitsschicht mit PBS bei einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute ausgewaschen. Mithilfe einer Spritzenpumpe ist das Gerät nun bereit für Zellversuche. Um den Objektträger für Immunoassays vorzubereiten, inkubieren Sie PDMS-Mikrokontaktdruckstempel mit 0,5 % biotinyliertem BSA in einer sauberen Petrischale.Nach einer halben Stunde die Stempel gründlich und schnell mit destilliertem Wasser reinigen und den Stempel unter einem Stickstoffstrom trocknen. Sobald der Stempel trocken ist, diesen umgehend auf eine gereinigte Glasobjektträgerplatte legen, um das strukturierte biotinylierte BSA abzusetzen. Den Stempel nach dem Platzieren nicht mehr bewegen und sicherstellen, dass er vollständig mit der Glasobjektträgerplatte in Kontakt steht.Falls nicht leicht, klopfen Sie leicht auf den Stempel, aber drücken Sie nicht fest nach unten. Anschließend stellen Sie den Stempel zusammen mit dem oberen Teil des mikrofluidischen Chips in die Plasmakammer und setzen ihn 45 Sekunden lang einem Sauerstoffplasma mit 18 Watt aus. Entfernen Sie nach der Plasmabehandlung den Stempel vom Objektträger. Beim Atmen auf die Oberfläche wird das Muster sichtbar. Richten Sie die Mikrokammern auf der bedruckten Oberfläche aus. Nach der Ausrichtung stellen Sie den Chip 30 Minuten lang auf eine Heizplatte bei 50 Grad Celsius, um die verbleibende Oberfläche zu blockieren. Geben Sie anschließend wie zuvor gezeigt eine steril gefilterte BSA-Lösung (4 % in PBS) mithilfe einer Zentrifuge in den Chip, inkubieren Sie den Mikrochip mindestens 30 Minuten lang und spülen Sie die Lösung danach mit PBS aus der Fluidschicht bei einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute aus.Verwenden Sie mit einer Spritzenpumpe den Chip direkt oder lagern Sie ihn bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius in einer feuchten Kammer. Erstellen Sie anschließend eine voll funktionsfähige Bindungsfläche, indem Sie Avadon in PBS in das Reservoir einführen. Leiten Sie die Lösung weiter, um das Avadon danach durch die Fluidkanäle zu ziehen.Spülen Sie das Reservoir gründlich aus und spülen Sie die Kanäle mit PBS durch. Geben Sie anschließend Protein G in das Reservoir und ziehen Sie es durch die Kanäle. Spülen Sie überschüssiges Protein G aus, indem Sie das Reservoir und den Chip mit PBS ausspülen.Fügen Sie anschließend den Antikörper der Wahl dem Reservoir hinzu und leiten Sie ihn durch die Kanäle. Stoppen Sie dann den Durchfluss, um die Bindung zu ermöglichen, bevor Sie die Kanäle mit PBS spülen. Fluoreszent markierte Analoga können verwendet werden, um die Qualität des Druckprozesses zu überprüfen, bevor Zellen in die Kanäle gegeben werden. Gewinnen Sie adhärierte Zellen, wie hier die HEK 293-Zellen gezeigt, mithilfe eines enzymfreien Dissoziationspuffers und filtrieren Sie diese, um die Anzahl der Zellkluster zu verringern. Nach der Filtration füllen Sie sie in eine Spritze. Bei 300.000 Zellen pro Milliliter geben Sie die Zellen mithilfe des Vorwärtsflusses der Spritzenpumpe etwa drei Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 20 Mikrolitern pro Minute auf den Chip, um bei adhärenten Zellen wie diesen eine unspezifische Anheftung zu verhindern, sobald die Fallen gefüllt sind. Schließen Sie anschließend die Kammern, indem Sie die obere Schicht mit drei Bar Druck beaufschlagen. Untersuchen Sie danach die Kammern mit einem Mikroskop. Falls viele Zellen unspezifisch an der Oberfläche innerhalb der Kammern haften, öffnen Sie diese schnell und versuchen Sie, sie mit einem Zell-Dissociationspuffer bei einer Flussrate von 10 bis 30 Mikrolitern pro Minute wegzuspülen.Für den Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase- oder G-6-PDH-Assay zwei Millimolar Glucose-6-phosphat, 0,5 Millimolar NADP⁺ und 0,5 Einheiten pro Milliliter DIA-Arrays sowie 0,3 Millimolar RIN in einen Lysepuffer geben und sorgfältig vermischen. Sobald die Kanäle frei sind, den G-6-PDH-Lysepuffer mit einer Flussrate von 30 Mikrolitern pro Minute durch den Chip leiten. Während der Lysepuffer fließt, die Kammern kurz öffnen und schließen, wobei sie 500 Millisekunden geöffnet bleiben, damit die Lyse sofort nach Beginn der Lyse in die Kammer eindringen kann; danach die kinetische Reaktion überwachen.In diesem Beispiel kann ein fluoreszierendes Produkt über die Zeit beobachtet werden. Dargestellt ist ein Array von Kammern, die mit orangefarbenem Lebensmittelfarbstoff gefüllt und anschließend durch Druckerhöhung in der Steuerungsschicht über den Mikrokammern verschlossen wurden. Nach dem Verschluss der Kammern wurde grüner Lebensmittelfarbstoff durch die Kanäle gespült, um die Dichtheit der Kammern zu demonstrieren.Jede Kammer enthält ein Volumen von nur 625 Pikroliter Flüssigkeit, wodurch die Konzentration der aus den lysierten Zellen freigesetzten Moleküle ausreichend hoch bleibt, um eine Analyse zu ermöglichen. Darüber hinaus können die Ventile geöffnet und geschlossen werden, um eine Kreuzkontamination zwischen den Kammern auszuschließen. In diesen Kammern ist es möglich, Analyten wie die Menge an Lysosomen, die von einer einzelnen PMA-aktivierten U 937-Zelle freigesetzt wurden, zu messen, während diese enzymatisch die Bildung eines fluoreszierenden Moleküls innerhalb der Kammer katalysiert.Die grünen Linien stellen die Änderung der Fluoreszenzintensität über die Zeit für Kammern dar, die eine Zelle enthalten. Zusätzlich ist die Fluoreszenzintensität für eine Kammer ohne Zellen, dargestellt durch die schwarze gestrichelte Linie, gezeigt. Zum Vergleich zeigt dieser Assay die Wirkung eines toxischen Moleküls auf die Membranintegrität, indem eine intrazelluläre Enzymaktivität von G six PDH gemessen wird.Die schwarze Linie stellt die Kontrollproben ohne toxische Einwirkung dar, während die orangefarbene Linie Zellen zeigt, die durch das dargestellte Toxin beeinflusst wurden. Hier sehen Sie ein Beispiel für ein Immunoassay für ein intrazelluläres Protein. GFP-anti-GFP-Antikörper wurden auf der Oberfläche immobilisiert, und nachdem die Zellen lysiert wurden, wurden die Bindungskinetiken der GFP-Proteine mittels TURB-Mikroskopie sichtbar gemacht.Der Zeitpunkt 0,1 markiert die Zugabe des Lysepuffers. Zum Zeitpunkt 0,2 beginnt die Akkumulation von GFP an der Oberfläche, was darauf hinweist, dass eine Zelllyse stattgefunden hat und GFP zur Oberfläche diffundiert ist. Die Bindung von GFP an die Antikörper ist zum Zeitpunkt 0,3 abgeschlossen. In diesem letzten Beispiel bindet freigesetztes GA-DH an die Festphasen-gebundenen Erfassungsantikörper, woraufhin HRP-gekoppelte Detektionsantikörper hinzugefügt werden.Nachdem alle nicht gebundenen Detektionsantikörper ausgewaschen wurden, wurde das Nachweisreagenz zugegeben und die Reaktion wurde über einen bestimmten Zeitraum durchgeführt. Hier ist ein Vergleich der Menge an zuvor intrazellulärer GA-DH in tierischen Mengen zwischen U-937- und HEC-293-Zellen, gemessen mit dieser Methode. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die mikrofluidischen Chips vorbereitet, wie man die Oberfläche modifiziert, um Immunoassays zu ermöglichen, und schließlich, wie man das Gerät für die Einzelzellanalyse verwendet.Diese Methode kann angewendet werden, um viele auslösende Fragen im Bereich der Einzelzellbiologie zu beantworten.

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Research

Forschung

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Bioengineering

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