Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Einzelzell-Lysate mithilfe von Fluoreszenz- oder Immunoassays zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mikrofluidische Vorrichtung hergestellt und die innere Kammer mit Antikörpern beschichtet wird. Anschließend werden Einzelzellen in den Fallen immobilisiert und im zweiten Schritt verschiedenen Reagenzien ausgesetzt, um eine zelluläre Reaktion auszulösen.

Ein ringförmiges Ventil wird schnell geschlossen, und Lysepuffer wird durch das Gerät geleitet. Das ringförmige Ventil wird kurz geöffnet, wodurch die Zellen innerhalb der Mikrokammer lysiert werden, sodass freigesetzte Proteine aufgrund des geringen Volumens in hoher Konzentration an die Antikörper binden können. Anschließend wird das ringförmige Ventil geöffnet.

Die Kammer wird gewaschen und Nachweisreagenzien werden in die geschlossene Mikrokammer eingeführt. Der Anstieg der Fluoreszenzintensität wird über die Zeit hinweg mittels eines Fluoreszenzmikroskops überwacht. Die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit dieses Systems, einen Analyten von Interesse, der von einzelnen Zellen freigesetzt wird, quantitativ und zuverlässig nachzuweisen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Einzelzellanalyse zu beantworten.

Besonders fehlten systematische Untersuchungen zur zellulären Antwort auf Veränderungen im chemischen Milieu. Wir können die Hoch- oder Herunterregulation intrazellulärer Moleküle als Reaktion auf den chemischen Reiz beobachten. Diese Technik weist zwei wesentliche Vorteile auf.

Erstens können wir die immobilisierten Zellen einer definierten chemischen Umgebung aussetzen, die konstant oder periodisch wechselnd ist. Zweitens können wir hochsensible und spezifische Analysen des Zustands erneut durchführen, ohne dass eine Kreuzkontamination oder ein Verlust der Analyten durch Transport entsteht. Um zu beginnen, stellen Sie die drei verschiedenen SU-8-Masterwafer wie in der begleitenden Textanleitung beschrieben her.

Eines wird zur Herstellung der Fluidikschicht verwendet, eines für die Steuerschicht und ein drittes für den Mikrokontakt-Abdruck. Anschließend werden die mikrofluidischen Chips hergestellt, beginnend mit der Herstellung eines 10:1-Gemischs aus PDMS und einem Härtungsmittel. Beide Komponenten gründlich vermischen und die Lösung 30 Minuten lang entgasen oder bis das Gemisch blasenfrei ist.

Als Nächstes platzieren Sie die Wafer in der Steuerschicht innerhalb einer Petrischale und befestigen sie mit Klebeband am Boden. Gießen Sie etwa 50 Gramm PDMS darauf, um eine vier bis fünf Millimeter dicke Schicht zu erzeugen, und stellen Sie die Wafer mindestens zwei Stunden lang in einen Ofen bei 80 Grad Celsius, um eine vollständige Aushärtung des PDMS sicherzustellen. Wiederholen Sie denselben Vorgang für die Wafer zur Mikrokontaktkopie, verwenden Sie jedoch etwa 20 Gramm PDMS statt 50, wodurch eine vier bis fünf Millimeter dicke PDMS-Schicht entsteht.

Um die untere Schicht vorzubereiten, wird eine 40 µm dicke PDMS-Schicht mittels Spin-Beschichtung auf den Wafer mit der mikrofluidischen Schicht aufgebracht. Drehen Sie hierzu mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 2000 U/min für 60 Sekunden. Anschließend wird die PDMS-Schicht im Ofen eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius ausgehärtet, sobald alle Teile ausgehärtet sind.

Entfernen Sie die Steuerschicht von der Wafer und schneiden Sie sie mithilfe der Rasierklinge in Stücke. Stanzen Sie anschließend die Druckanschlusslöcher mit einer ein Millimeter großen Biopsiepunchvorrichtung aus und verschließen Sie die Kanäle mit Klebeband zur Aufbewahrung. Entfernen Sie danach das PDMS von der Mikrokontaktdruck-Wafer und bereiten Sie Stempel in der Größe des Kammerbereichs vor.

Bewahren Sie sie staubfrei in einer Schublade bis zur Verwendung auf. Anschließend bringen Sie den spin-beschichteten Wafer und die vier bis fünf Millimeter dicke Steuerschicht in einen Plasma-Reiniger ein. Exponieren Sie die Stücke 45 Sekunden lang bei 18 Watt mit Sauerstoffplasma bei 0,75 Millibar.

Nach der Plasmabehandlung beide Schichten unter einem Mikroskop mit großem Arbeitsabstand schnell ausrichten. Einige zusätzliche PDMS-Menge um die platzierten oberen Teile herum hinzufügen, um die Entfernung des PDMS von der Wafer zu erleichtern. Anschließend den Wafer mindestens eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius in einen Ofen stellen.

Nach der Aushärtung das PDMS vorsichtig mit einem Skalpell vom Wafer lösen und die Mikrochips mithilfe einer 1,5 Millimeter-Biopsiepistole ausschneiden, um Zugangsöffnungen für die fluidischen Anschlüsse zu schaffen. Zusätzlich einen Vorratsbehälter im Mikrochip anlegen, indem man das obere Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze abschneidet und etwas zusätzliches, teilweise ausgehärtetes PDMS verwendet. Dieses daraufkleben.

Anschießend den Chip mindestens eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius im Ofen aushärten lassen. Beginnen Sie damit, einen Objektträger und PDMS-Teile zu reinigen. Reinigen Sie einen Objektträger mit Seife.

Spülen Sie es mit destilliertem Wasser und danach erneut mit Ethanol ab. Trocknen Sie den Objektträger mit einem Stickstoffstrom. Entfernen Sie mithilfe von Klebeband jegliche Verunreinigungen und Staubpartikel aus dem PDMS.

Danach das PDMS-Teil und das gereinigte Glas platzieren. Für 45 Sekunden bei 18 Watt in den Plasma-Reiniger schieben, um eine feste Bindung sicherzustellen; nach der Plasma-Behandlung den Chip fünf Minuten lang auf eine Heizplatte stellen. Nach dem Bonding den unteren Teil mehrerer 200-Mikroliter-Pipettenspitzen abschneiden. Diese mit 10 bis 15 Mikrolitern filtriertem PBS mit 4 % BSA füllen und in die Zuleitungen des Geräts einsetzen.

Verwenden Sie anschließend abgeschnittene Pipettenspitzen mit zugegebenen 10 bis 15 Mikrolitern PBS und geben Sie diese in die Kontrollkanäle. Danach platzieren Sie die Chips in die Zentrifuge und zentrifugieren sie fünf Minuten lang mit 800 × g, um die Kanäle mit Flüssigkeit zu füllen. Falls sich in einigen Kanälen noch Luft befindet, wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Kanäle vollständig gefüllt sind.

Die Blockierungslösung mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend wird die Lösung aus der Flüssigkeitsschicht mit PBS bei einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute ausgewaschen. Mithilfe einer Spritzenpumpe ist das Gerät nun bereit für Zellversuche. Um den Objektträger für Immunoassays vorzubereiten, inkubieren Sie PDMS-Mikrokontaktdruckstempel mit 0,5 % biotinyliertem BSA in einer sauberen Petrischale.

Nach einer halben Stunde die Stempel gründlich und schnell mit destilliertem Wasser reinigen und den Stempel unter einem Stickstoffstrom trocknen. Sobald der Stempel trocken ist, diesen umgehend auf eine gereinigte Glasobjektträgerplatte legen, um das strukturierte biotinylierte BSA abzusetzen. Den Stempel nach dem Platzieren nicht mehr bewegen und sicherstellen, dass er vollständig mit der Glasobjektträgerplatte in Kontakt steht.

Falls nicht leicht, klopfen Sie leicht auf den Stempel, aber drücken Sie nicht fest nach unten. Anschließend stellen Sie den Stempel zusammen mit dem oberen Teil des mikrofluidischen Chips in die Plasmakammer und setzen ihn 45 Sekunden lang einem Sauerstoffplasma mit 18 Watt aus. Entfernen Sie nach der Plasmabehandlung den Stempel vom Objektträger.

Beim Atmen auf die Oberfläche wird das Muster sichtbar. Richten Sie die Mikrokammern auf der bedruckten Oberfläche aus. Nach der Ausrichtung stellen Sie den Chip 30 Minuten lang auf eine Heizplatte bei 50 Grad Celsius, um die verbleibende Oberfläche zu blockieren. Geben Sie anschließend wie zuvor gezeigt eine steril gefilterte BSA-Lösung (4 % in PBS) mithilfe einer Zentrifuge in den Chip, inkubieren Sie den Mikrochip mindestens 30 Minuten lang und spülen Sie die Lösung danach mit PBS aus der Fluidschicht bei einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute aus.

Verwenden Sie mit einer Spritzenpumpe den Chip direkt oder lagern Sie ihn bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius in einer feuchten Kammer. Erstellen Sie anschließend eine voll funktionsfähige Bindungsfläche, indem Sie Avadon in PBS in das Reservoir einführen. Leiten Sie die Lösung weiter, um das Avadon danach durch die Fluidkanäle zu ziehen.

Spülen Sie das Reservoir gründlich aus und spülen Sie die Kanäle mit PBS durch. Geben Sie anschließend Protein G in das Reservoir und ziehen Sie es durch die Kanäle. Spülen Sie überschüssiges Protein G aus, indem Sie das Reservoir und den Chip mit PBS ausspülen.

Fügen Sie anschließend den Antikörper der Wahl dem Reservoir hinzu und leiten Sie ihn durch die Kanäle. Stoppen Sie dann den Durchfluss, um die Bindung zu ermöglichen, bevor Sie die Kanäle mit PBS spülen. Fluoreszent markierte Analoga können verwendet werden, um die Qualität des Druckprozesses zu überprüfen, bevor Zellen in die Kanäle gegeben werden. Gewinnen Sie adhärierte Zellen, wie hier die HEK 293-Zellen gezeigt, mithilfe eines enzymfreien Dissoziationspuffers und filtrieren Sie diese, um die Anzahl der Zellkluster zu verringern. Nach der Filtration füllen Sie sie in eine Spritze.

Bei 300.000 Zellen pro Milliliter geben Sie die Zellen mithilfe des Vorwärtsflusses der Spritzenpumpe etwa drei Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 20 Mikrolitern pro Minute auf den Chip, um bei adhärenten Zellen wie diesen eine unspezifische Anheftung zu verhindern, sobald die Fallen gefüllt sind. Schließen Sie anschließend die Kammern, indem Sie die obere Schicht mit drei Bar Druck beaufschlagen. Untersuchen Sie danach die Kammern mit einem Mikroskop. Falls viele Zellen unspezifisch an der Oberfläche innerhalb der Kammern haften, öffnen Sie diese schnell und versuchen Sie, sie mit einem Zell-Dissociationspuffer bei einer Flussrate von 10 bis 30 Mikrolitern pro Minute wegzuspülen.

Für den Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase- oder G-6-PDH-Assay zwei Millimolar Glucose-6-phosphat, 0,5 Millimolar NADP⁺ und 0,5 Einheiten pro Milliliter DIA-Arrays sowie 0,3 Millimolar RIN in einen Lysepuffer geben und sorgfältig vermischen. Sobald die Kanäle frei sind, den G-6-PDH-Lysepuffer mit einer Flussrate von 30 Mikrolitern pro Minute durch den Chip leiten. Während der Lysepuffer fließt, die Kammern kurz öffnen und schließen, wobei sie 500 Millisekunden geöffnet bleiben, damit die Lyse sofort nach Beginn der Lyse in die Kammer eindringen kann; danach die kinetische Reaktion überwachen.

In diesem Beispiel kann ein fluoreszierendes Produkt über die Zeit beobachtet werden. Dargestellt ist ein Array von Kammern, die mit orangefarbenem Lebensmittelfarbstoff gefüllt und anschließend durch Druckerhöhung in der Steuerungsschicht über den Mikrokammern verschlossen wurden. Nach dem Verschluss der Kammern wurde grüner Lebensmittelfarbstoff durch die Kanäle gespült, um die Dichtheit der Kammern zu demonstrieren.

Jede Kammer enthält ein Volumen von nur 625 Pikroliter Flüssigkeit, wodurch die Konzentration der aus den lysierten Zellen freigesetzten Moleküle ausreichend hoch bleibt, um eine Analyse zu ermöglichen. Darüber hinaus können die Ventile geöffnet und geschlossen werden, um eine Kreuzkontamination zwischen den Kammern auszuschließen. In diesen Kammern ist es möglich, Analyten wie die Menge an Lysosomen, die von einer einzelnen PMA-aktivierten U 937-Zelle freigesetzt wurden, zu messen, während diese enzymatisch die Bildung eines fluoreszierenden Moleküls innerhalb der Kammer katalysiert.

Die grünen Linien stellen die Änderung der Fluoreszenzintensität über die Zeit für Kammern dar, die eine Zelle enthalten. Zusätzlich ist die Fluoreszenzintensität für eine Kammer ohne Zellen, dargestellt durch die schwarze gestrichelte Linie, gezeigt. Zum Vergleich zeigt dieser Assay die Wirkung eines toxischen Moleküls auf die Membranintegrität, indem eine intrazelluläre Enzymaktivität von G six PDH gemessen wird.

Die schwarze Linie stellt die Kontrollproben ohne toxische Einwirkung dar, während die orangefarbene Linie Zellen zeigt, die durch das dargestellte Toxin beeinflusst wurden. Hier sehen Sie ein Beispiel für ein Immunoassay für ein intrazelluläres Protein. GFP-anti-GFP-Antikörper wurden auf der Oberfläche immobilisiert, und nachdem die Zellen lysiert wurden, wurden die Bindungskinetiken der GFP-Proteine mittels TURB-Mikroskopie sichtbar gemacht.

Der Zeitpunkt 0,1 markiert die Zugabe des Lysepuffers. Zum Zeitpunkt 0,2 beginnt die Akkumulation von GFP an der Oberfläche, was darauf hinweist, dass eine Zelllyse stattgefunden hat und GFP zur Oberfläche diffundiert ist. Die Bindung von GFP an die Antikörper ist zum Zeitpunkt 0,3 abgeschlossen. In diesem letzten Beispiel bindet freigesetztes GA-DH an die Festphasen-gebundenen Erfassungsantikörper, woraufhin HRP-gekoppelte Detektionsantikörper hinzugefügt werden.

Nachdem alle nicht gebundenen Detektionsantikörper ausgewaschen wurden, wurde das Nachweisreagenz zugegeben und die Reaktion wurde über einen bestimmten Zeitraum durchgeführt. Hier ist ein Vergleich der Menge an zuvor intrazellulärer GA-DH in tierischen Mengen zwischen U-937- und HEC-293-Zellen, gemessen mit dieser Methode. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die mikrofluidischen Chips vorbereitet, wie man die Oberfläche modifiziert, um Immunoassays zu ermöglichen, und schließlich, wie man das Gerät für die Einzelzellanalyse verwendet.

Diese Methode kann angewendet werden, um viele auslösende Fragen im Bereich der Einzelzellbiologie zu beantworten.