Gelaufreinigung

Gel Purification

JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Gel Purification

2.9: Plasmid Purification

2.11: The Western Blot

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06:30 min

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April 30, 2023

Overview

Die Gelaufreinigung wird verwendet um DNA Fragmente nach elektrophoretischer Auftrennung zurückzugewinnen. Die DNA Rückgewinnung besteht aus 3 einfachen Schritten: dem Binden, Waschen und der Eluierung aus der Silica-Säule. Die DNA bindet das Silica durch Salzbrücken, wenn hohe Salzkonzentrationen vorhanden sind. Nach dem Binden wird die DNA gewaschen um Verunreinigungen wegzuspülen, und dann unter niedrigeren Salzbedingungen, welche die Salzbrücken unterbrechen, eluiert.

Dieses Video gibt eine Schritt für Schritt Anleitung eines allgemeinen Verfahrens, welches das Ausschneiden und die Auflösung des Gelstücks, die Aufreinigung der DNA durch deren Bindung an die Silica-Säule, und die nachfolgende Eluierung, beinhaltet. Zusätzlich dazu geben wir einige nützliche Hinweise für eine erfolgreiche Gelaufreinigung, wie zum Beispiel das Laufen des Agarose-Gels mit einem Marker oder einer DNA-Leiter, um die genaue Größe des DNA Fragments zu bestimmen.

Procedure

Die Gelaufreinigung ist ein Standardverfahren, um die gewünschten DNA Fragmente nach der elektrophoretischen Auftrennung zurückzugewinnen. Nachdem das Gelfragment aufgelöst wurde und einen speziellen Filter passiert hat, gewinnt man mit dieser Methode DNA, die ohne Verunreinigungen wie Salze, freie Nukleotiden oder Enzyme, weiterverarbeitet werden kann.

Die Grundlage hinter der Rückgewinnung von DNA aus einem Agarosegel besteht as Bindungs-, Wasch- und Eluierungsschritten. Nachdem das Gel-Fragment in einem Solubilisierungspuffer aufgelöst wurde, wird es auf eine “Zentrifugiersäule” gegeben, welche bewirkt, dass sich die DNA beim Zentrifugieren selektiv an einen Silica-Filter bindet und die Verunreinigungen in das Auffanggefäß durchfließen.

Die DNA bindet sich an das Silica wegen der hohen Salzkonzentration, die in dem Solubilisierungspuffer vorhanden ist. Dieser Puffer zerstört die Hydrationsstruktur um den Filter herum und stellt eine kationische Salzbrücke zwischen der starken negativen Ladung des Filters und der DNA her. Die übrigbleibenden Verunreinigungen werden beim Waschen mit Ethanol weggespült.

Wasser, oder Puffer mit niedriger Salzkonzentration wird dann auf die Säule gegeben, um die DNA durch die Unterbrechung der Kationenbrücken zu eluieren. Die DNA ist damit aus dem Gel aufgereinigt.

Der erste Schritt im Gelaufreinigungsverfahren ist das Herstellen eines Agarose-Gels und die elektrophoretische Auftrennung der DNA. Nachdem die DNA aufgetrennt wurde, können die gewünschten DNA Fragmente mit UV Licht abgebildet und mit Hilfe eines Molekülmassenstandards ausgewählt werden.

Wenn das Gel nicht eingefärbt wurde, kann man die ungefähre Lage der Bande durch Vergleichen mit der DNA-Leiter bestimmen. Beim Ausschneiden des Gels mit einer Rasierklinge muss man darauf achten, dass man so viel DNA und so wenig Gel wie möglich ausschneidet.

Wenn man mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen und UV Licht arbeitet, sollte man Handschuhe und eine Schutzbrille tragen. Nachdem das gewünschte DNA Fragment aus dem Gel ausgeschnitten wurde, entsorgt man das Gel und den Laufpuffer unter Einhaltung der Sicherheitsprotokolle des Instituts.

Nach der Isolation wird das Gelstück in ein Eppendorfgefäß gelegt und auf einer Waage gewogen. Mit der Annahme das 100 mg Gel gleich 100 µl Volumen sind, nimmt man das Vierfache des Gelgewichts an Solubilisierungspuffer und gibt diesen zu dem Gelstück hinzu. Nun inkubiert man das Gelstück bei ca. 50°C um die Agarose zu schmelzen.

Nachdem es geschmolzen ist, trägt man das gelöste Gel auf eine Zentrifugiersäule auf, in der die DNA und andere Partikel beim Zentrifugieren in dem Filter stecken bleiben.

Danach wird die gebundene DNA mit 70% Ethanol durch Zentrifugieren gewaschen, was die restlichen Unreinheiten aus dem Filter entfernt. Die durchgeflossene Waschlösung wird entsorgt und das Waschen wird bis zu 3 Mal wiederholt. Danach wird der leere Filter nochmals zentrifugiert um Ethanolrückstände zu entfernen. Der Silica-Filter wird dann bei Zimmertemperatur getrocknet. Danach wird Wasser oder Eluierungspuffer auf die Säule aufgetragen und zentrifugiert. Die DNA wird dadurch in dem Eppendorfgefäß gesammelt.

Die Methode, die ihr hier gerade gesehen habt, betrifft die Gelaufreinigung mit Silica-Filtern. Es gibt andere Methoden, die auf den gleichen Grundlagen der DNA Bindung an Silica, in Kombination mit Wasch und Eluierungsschritten, basieren. Zum Beispiel kann Silica mit DNA in einer Lösung die „Glasmilch“ heißt gemischt werden. Diese wird dann zu einem Pellet zentrifugiert, gewaschen und eluiert. Außerdem kann eine Saugvorrichtung genutzt werden, um die DNA durch den Filter zu ziehen. Versichert euch, dass ihr die Gelaufreinigungsverfahren, die in eurem Labor benutzt werden, versteht.

Nun das ihr gelernt habt wie man DNA aus Agarose-Gels zurückgewinnt, schauen wir uns an was man mit der DNA nach der Aufreinigung machen kann.

Zum Beispiel ist die Gelaufreinigung ein Schritt in der Chromatin Immunpräzipitation, also einer Technik mit der man Proteine isoliert, welche an genomische DNA binden, und die man verwendet, um zu sehen welche Sequenzen durch diese Proteine reguliert werden. Die isolierten Fragmente werden aufgereinigt und dann sequenziert, um sie auf einzelnen Chromosomen abzubilden.

Die Subklonierung, als der Prozess bei dem man ein Gen von einem Vektor in einen anderen kloniert, kann einen Gelaufreinigungsschritt beinhalten. Zum Beispiel kann ein Vektor verdaut werden und durch PCR in chimärische Sequenzen aneinandergefügt werden. Danach werden diese Sequenzen aufgereinigt und in andere Vektoren kloniert.

Vielleicht die einfachste Anwendung der Gelaufreinigung ist deren Verwendung nachdem die Gelstücke längerfristig bei -80˚C nach der elektrophoretischen Auftrennung gelagert wurden.

Hier habt ihr gelernt wie man DNA Fragmente von einem Agarose-Gel mit einer Kombination von Bindungs-, Wasch- und Eluierungsschritten durch dem Folgen individueller Protokolle aufreinigt. Außerdem haben wir einige Anwendungen dieser Methode erläutert. Wie immer – danke für eure Aufmerksamkeit

Transcript

Gel-purification is a standard procedure performed to recover desired DNA fragments from agarose gels after electrophoretic separation. After dissolving the gel fragment and running it through a specialized filter, this procedure yields DNA freed from impurities such as salts, free nucleotides and enzymes, suitable for downstream applications.

The basic principle behind DNA recovery from agarose gel involves a sequence of bind, wash, and elute steps. Once the gel is in solubilizing buffer, it is applied onto a “spin column,” which, upon centrifugation, allows DNA molecules to selectively bind to a silica-filter while the impurities flow through into a collection tube.

DNA is able to bind to silica thanks to a high salt concentration in the gel solubilization buffer. This buffer is believed to disrupt the hydration structure around the filter and create a cation salt bridge between the strong negative charges on the filter and negative charges on the DNA. Residual impurities are removed by washing with ethanol.

Water or low salt buffer is added to the column and will “elute,” or free, the DNA from it, presumably by disrupting the cation bridge. The DNA is now purified from the gel.

The first step in the gel purification procedure involves casting the agarose gel and performing electrophoresis of the DNA samples. Once the gel-run is complete, desired DNA fragments are visualized against UV light and fragments are selected after comparing against a molecular weight standard.

If the gel is unstained, the band location can be approximately determined based on a comparison to the DNA ladder. While cutting the gel with a razor blade, one must take care to recover as much DNA as possible with as little agarose as possible.

When handling ethidium bromide stained gels and working in front of UV light, gloves and protective eyewear should be used. After cutting the desired DNA from the gel, dispose of the gel and running buffer properly, in compliance with institutional safety protocols.

Once isolated, the piece of gel is placed in a microfuge tube and weighed on a balance. Using the approximation that 100 mg of gel occupies 100 l, a volume of solublilization buffer that is 4X the gel weight is added to the gel piece. After being placed in buffer, the gel piece is incubated at around 50 C to melt the agarose.

Once melted, the solubilized gel is added onto a spin column and the solution is centrifuged, which will cause all of the DNA and other particulates to stick to the filter.

Next, the bound DNA is washed by adding 70% ethanol to the filter, followed by centrifugation, which will remove residual impurities from the filter. Flow through is discarded, and this washing step is then generally repeated up to three times. The empty filter is spun again to remove residual ethanol, and the silica filter is allowed to dry at room temperature. Water or elution buffer is added to the filter, and with another round of centrifugation, purified DNA is collected in the bottom of the tube.

The method you’ve just seen applies to gel purification with silica spin column filters. Other methods exist that make use of the same basic principles of DNA binding to silica followed by washing and elution steps. For example, silica can be mixed with DNA in a suspension called “glassmilk,” which can be pelleted and washed, and later eluted. Also, suction can be used to pull DNA through silica filters and, later, elute it. Be sure to understand your lab’s gel purification procedures.

Now that you have learned how to recover DNA from agarose gels, let us examine a few downstream applications that use DNA obtained from gel-purification.

For example, gel-purification is an intermediate step in Chromatin Immunoprecipitation, a technique that aims to isolate the regulatory proteins that bundle genomic DNA, in order to identify which sequences are being regulated. The isolated fragments are gel-purified and sequenced, in order to be mapped onto the individual chromosome regions.

Subcloning – the process of moving a gene in one vector to another – can involve gel purification. For example, gene sequences from one vector can be digested from one construct, and assembled into chimeric sequences via PCR, after which they are gel purified and put into other constructs.

Perhaps the simplest application of gel-purification is its use after long-term storage at -80 ˚C of excised DNA bands following electrophoresis.

You have now learned how to extract DNA fragments from agarose gel, the variations of bind, wash, and elute procedures followed as per individual user-preference, and finally some of the possible downstream applications of this method. As always, thank you for watching.