Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Umkehrform zu drucken, um gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für die 3D-Zellkultur herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine umgekehrte Form aus einem thermoreversiblen Polymer gedruckt wird, das bei vier Grad Celsius flüssig ist, bei Raumtemperatur jedoch ein weiches Gel. Dieser umgekehrten Form kann später entgangen werden.

Der zweite Schritt besteht darin, die Reverse-Form mit einem Biopolymer Ihrer Wahl zu füllen. Hier haben wir aros verwendet. Das Biopolymer kann entweder durch enzymatische, UV- oder Temperaturvernetzung vernetzt werden.

Als nächstes wird die umgekehrte Form El angedeutet, indem die Form in kaltes Wasser getaucht wird. Nach diesem Schritt ist die resultierende AROS-Form bereit für die Weiterverarbeitung. Der letzte Schritt besteht darin, die Hohlräume mit einem zweiten Biopolymer zu füllen, das Zellen enthalten könnte und mittels Enzymen, UV-Licht oder Temperatur vernetzt werden kann.

Letztendlich haben wir eine reproduzierbare Methode etabliert, um räumlich organisierte bis D-Zellkultur-Gerüste zu erstellen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als ein Kollege vorschlug, dass wir die thermoresponsiven Eigenschaften von Oxr nutzen könnten, indem wir es als Opferform verwenden. Das Verfahren wird von Misha Muah, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.

Zu Beginn 60 Milliliter eiskalte PBS-Lösung in eine Glasflasche geben und mit einem Magnetrührer kräftig umrühren. Wiegen Sie dann 24,5 Gramm Paul ER ab und geben Sie es in kleinen Mengen zum kalten PBS. Warten Sie, bis sich der Paul Oxr teilweise im PBS aufgelöst hat, bevor Sie weitere hinzufügen.

Rühren Sie die Lösung weiter, bis sich Paul Oxr vollständig aufgelöst hat. Als nächstes fügen Sie zusätzliches eiskaltes PBS hinzu, bis ein Endvolumen von 100 Millilitern erreicht ist, was eine Endkonzentration von 24,5 % Gewicht pro Volumen ergibt. Rühre dann die Mischung um, bis sie gut vermischt ist.

Hören Sie auf, die Lösung zu rühren und lassen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius ruhen, bis Blasen und Schaum in der Lösung verschwunden sind. Blasen, die im Gel eingeschlossen sind, werden auf die Druckerpatrone übertragen und führen zu Defekten in den gedruckten Opferformen. Steril Filtrieren Sie die Lösung mit einem Vorkühlfilter direkt in die Druckpatrone, um unerwünschte Partikel zu entfernen, die die Nadel verstopfen könnten.

Lagern Sie die Kartusche bis 30 Minuten vor dem Experiment bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie das Magnetventil und die Nadel für den Druck vor, indem Sie sie in separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen legen, die mit Reinstwasser gefüllt sind, und sie 30 Minuten lang syndizieren. Spülen Sie dann die gereinigten Ventile mit Ethanol und trocknen Sie sie mit einer Stickstoffpistole.

Installieren Sie als Nächstes das saubere Magnetventil und die Nadel im Drucker. Setzen Sie außerdem eine leere, saubere Druckpatrone ein, um das System zu testen. Üben Sie drei bar Druck auf das System aus und blasen Sie alle Restflüssigkeiten aus dem installierten Ventil und der Nadel mit Druckluft aus.

Für kleine Nadeldurchmesser. Installieren Sie einen Filter am Auslass der Druckluft, um das Eindringen kleiner Partikel zu verhindern, die die Nadel verstopfen könnten. Schalten Sie dann den Druck aus.

Wenn der Druck auf Null gesunken ist, setzen Sie die Kartusche mit dem Polyoxr vorgeladen. Die Patrone sollte ca. 30 Minuten vor dem Aufsetzen der Patrone aus dem Kühlschrank genommen werden, damit das noch flüssige Poly Oxr vor dem Drucken Raumtemperatur erreichen und gelieren kann. Überprüfen Sie, ob das Poly oxr geliert ist, indem Sie die Kartusche umdrehen.

Üben Sie anschließend einen Druck von drei bar auf das System aus und dosieren Sie Paul Emer, bis es die Nadelspitze erreicht und in einem kontinuierlichen Strang extrudiert wird. Zeichnen Sie mit der Bio-CAD-Software eine einzelne Linie, die ungefähr so lang ist wie die Struktur, die Sie im Einstellungsmenü der Druckersoftware drucken möchten. Stellen Sie das Magnetventil in der Parametersektion auf eine hohe Frequenz von 50 Hertz ein und stellen Sie die Hochdruckeinstellung von Hand auf drei bar ein.

Stellen Sie als Nächstes ein Glasmikroskop ein, schieben Sie den Drucker ein und befestigen Sie ihn durch Einschalten des Vakuums. Drucken Sie dann eine Schicht einer einzelnen Linie mit einer Tischgeschwindigkeit von 300 Millimetern pro Minute. Erreichen Sie die gewünschte Leitungsbreite, indem Sie den Druck von Hand und die Frequenzeinstellungen in der Software für jede neue Leitung reduzieren, um sicherzustellen, dass die Leitung kontinuierlich bleibt.

Wenn die gezeichnete Linie durchbrochen wird, ist die untere Grenze erreicht. Sobald eine durchgehende Linie mit der gewünschten Breite erreicht ist, bestimmen Sie die optimale Tischgeschwindigkeit und Schichtdicke, indem Sie die gedruckten Konstrukte auf Fehler prüfen. Um die Schichtdicke fein abzustimmen, müssen ggf. auch Druck und Frequenz leicht nachjustiert werden.

Um die Einstellung der Schichtdicke zu testen, drucken Sie mehrere Schichten übereinander und achten Sie darauf, dass sich die Nadel in der richtigen Position über der vorherigen Schicht befindet. Passen Sie die Schichtdicke so an, dass jede Schicht direkt auf die vorherige gedruckt wird. Um die Tischgeschwindigkeit zu optimieren, verringern Sie zunächst die Tischgeschwindigkeit schrittweise von 300 Millimetern pro Minute, sodass die extrudierten Schichten an den gleichen Positionen beginnen und enden wie die vorherigen.

Wenn sich die Bühne zu schnell bewegt, erscheint ein wellenartiges Muster am oberen Rand der Ebene. Für den Druck von Säulenkonstruktionen zeichnen Sie in der CAD-Software einen einzelnen Punkt anstelle einer Linie. Passen Sie dann den Druck und die Frequenz an, um die Schichtdicke und den Säulendurchmesser sowie die Schrittzeit des Druckkopfs zu regulieren und die Druckgeschwindigkeit zu maximieren.

Speichern Sie nach der Optimierung die Parameter für die spätere Verwendung. Drucken Sie zunächst die innere Struktur, wie z.B. dieses Säulenarray, auf einen Objektträger aus Glas und lassen Sie es trocknen. Die Trocknung über Nacht reduziert die Größe und Dicke der Strukturen und sorgt für eine bessere Haftung zwischen der Struktur und dem Substrat.

Zeichnen Sie am nächsten Tag eine Struktur, die aus einer Außenwand besteht, die die Strukturen umgibt, die Sie umgehen und füllen möchten. Die Polymerwand sollte aufgrund der Abmessungen der Nadel mindestens 3,5 Millimeter von den inneren Strukturen entfernt gedruckt werden. Bereiten Sie als Nächstes eine Mischung aus 1%aros in deionisiertem Wasser vor, indem Sie sie in der Mikrowelle erhitzen, sobald sie vollständig aufgelöst ist.

Kühlen Sie die Agro-Lösung auf 35 bis 45 Grad Celsius ab. Füllen Sie dann die Opferform mit einer Pipette mit der Agro-Lösung. Dies sollte langsam erfolgen, um eine Zerstörung der Struktur im Inneren der Wand zu vermeiden.

Sobald sie gefüllt ist, stelle die Form auf vier Grad Celsius, um das Gel zu verfestigen. Nach ca. 10 Minuten nehmen Sie das Gel aus dem Kühlschrank und legen es für 10 Minuten in ein Eisbad, um die Polymerstruktur zu eluieren. Entfernen Sie dann vorsichtig die Struktur und entfernen Sie das restliche Wasser, indem Sie es mit einem Papiertuch abtupfen.

Drücken Sie die Struktur vorsichtig auf einen neuen Objektträger aus Glas, um eine gute Abdichtung zu schaffen, die ein Auslaufen des dritten Hydrogels verhindert. Bereiten Sie als nächstes eine 1%ige Lösung von Alginatmethacrylat in 0,15 molaren Natriumchlorid vor. Wirbeln Sie die Lösung auf, um das Alginatmethacrylat aufzulösen.

Fügen Sie dann 2,5 % Lautstärke zur Lautstärke hinzu. Alexa, 4 88 konjugiertes Fibrinogen und 0,05 % Gewicht pro Volumen. Lithiumphenyl2,4,6-trimethylbenzoylphosphat, um ein drittes Hydrogel zu erhalten, das durch Fluoreszenz leicht sichtbar gemacht werden kann.

Geben Sie diese Lösung in eine 0,3-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Verwenden Sie dann die Spritze, um die Hohlräume zu füllen, die das ausgewichene Polymer hinterlassen hat. Achten Sie darauf, jede Säule vollständig zu füllen, indem Sie das Polymer auswerfen, während die Nadel aus jeder Säule gezogen wird.

Schließlich wird das injizierte Polymer fünf Minuten lang mit einer hochintensiven UV-Lampe photopolymerisiert und dann das Konstrukt mit einem Epi-Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop abgebildet. Hier ist eine 3D-Zack-Rekonstruktion eines Konstrukts zu sehen, das dem gerade hergestellten ähnelt, dem fluoreszenzmarkierten Alginat, das zum Verfüllen verwendet wird. Die Säulenformen werden als grüne Säulen angezeigt, und der äußere Teil des Konstrukts ist transparent.

Die in diesem Video gezeigten Techniken sind weitgehend an viele verschiedene 3D-Anordnungen anpassbar, wie z. B. die hier gezeigten konzentrischen Kreise. Die Auflösung ist abhängig vom Nadeldurchmesser. Die für dieses Design verwendete Nadel mit einem Durchmesser von 150 Mikrometern kann Stränge mit einem Durchmesser zwischen 120 und 200 Mikrometern produzieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Schritte haben, die mit dem Drucken von oxr verbunden sind. Wir haben die Verwendung von oxr als Opferform zur Herstellung von Musterhydrogelen demonstriert, aber das oxr kann auch UV-stabilisiert werden, wenn eine herstellerbezogene Version des Polymers verwendet wird.