Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die mitochondriale Funktion in lebenden Hefezellen mit Hilfe von zwei grün fluoreszierenden Protein- oder GFP-Varianten zu messen. Redox-Sensing-GFP enthält oberflächenexponierte Cystine, die einer reversiblen und umgebungsabhängigen Oxidation und Reduktion unterzogen werden, die das Anregungsspektrum der proteinreduzierten Reihe verändert. GFP hat ein Anregungsmaximum bei 470 Nanometern, während oxidiertes Reihen-GFP bei 365 Nanometern einen erhöhten Anregungsmangel aufweist.

Der redoc-Zustand wird als RO-GFP-Emission bei 470 Nanometern Anregung über die RO-GFP-Emission bei 365 Nanometern Anregung go gemessen. Ein Team ist eine Bundsonde, bei der die Epsilon-Untereinheit der F-Null-F1-A-TP-Synthase zwischen einem Bunddonor-GFP und einem Bundakzeptor eingebettet ist, orange fluoreszierendes Protein oder OFP-Bindung eines TP an die Epsilon-Untereinheit führt zu bestätigenden Veränderungen im Protein, die Der Bunddonor und der Akzeptor befinden sich in unmittelbarer Nähe, was eine Energieübertragung vom Donor zum Akzeptor ermöglicht. Die a TP-Spiegel werden dann als OFP-Emission bei Anregung bei 488 Nanometern über GFP-Emission bei Anregung bei 488 Nanometern gemessen. Es werden Ergebnisse erzielt, die Veränderungen des Redoxzustands oder eines TP-Spiegels überwachen, die unter physiologischen Bedingungen auftreten.

Der Hauptvorteil dieser Methoden gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass man GFP auf die Straße schickt und losfährt. Ein Team ist genetisch kodiert und kann in lebenden Zellen eingeführt und stabil gehalten werden. Dadurch können sie zur Messung des mitochondrialen Redoxzustands und eines TP in lebenden Zellen verwendet werden, ohne die Fitness der Zellen oder der Organellen zu beeinträchtigen.

Beide Sonden überwachen Veränderungen des Redoxzustands oder eines TP-Spiegels unter physiologischen Bedingungen. Beide Sonden sind daher auch verhältnismetrisch. Messungen, die mit diesen Sonden durchgeführt werden, werden nicht durch Änderungen der Biosensorkonzentration oder der Probenbeleuchtung oder -dicke beeinflusst.

Beide Biosensoren liefern eine Auflösung auf der Ebene einzelner Organellen. Tatsächlich wurden RO-GFP-Varianten auf Mitochondrien, er, Endosomen und Peroxisomen ausgerichtet, wo sie Veränderungen des Redoxzustands festgestellt haben, die weitgehend unabhängig vom pH-Wert sind. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen der mitochondrialen Qualitätskontrolle und der Veränderung von Mitochondrien mit dem Alter zu beantworten.

visuelle Demonstration dieser Methode ist nützlich, da die Schwellenwert- und Verhältnisschritte während der Bildanalyse schwierig sind und unter Verwendung einheitlich definierter Richtlinien durchgeführt werden müssen. Um dieses Verfahren zu beginnen. Führen Sie die Transformation der Hefe mit Biosensoren durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Züchten Sie die Zellen in fünf Millilitern selektivem vollständigem Dropout-Medium in einem konischen 15-Milliliter-Bodenröhrchen bis zur mittleren logarithmischen Phase.

Verwenden Sie für alle Experimente denselben Medienstapel. Nachdem Sie einen Milliliter Kultur auf 20 Mikroliter konzentriert haben, geben Sie zwei Mikroliter der resuspendierten Zellen auf einen Objektträger und decken Sie die Zellen mit einem Deckglas ab. Schmelzen Sie dann eine kleine Menge VAP auf einem Metallspatel und verteilen Sie es zum Versiegeln entlang der Deckglaskanten.

Alternativ kann Klarlack für die Bildgebung von mito RO GFP one auf einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop verwendet werden. Verwenden Sie ein Objektiv mit der höchstmöglichen numerischen Apertur, das Licht bei 365 Nanometern durchlässt, wie z. B. den EEC-Plan von 100 x 1,3 NA. Neo-Fluor-Objektiv.

Konfigurieren Sie das Mikroskop so, dass es bei 365 und 470 Nanometern anregt, um oxidiertes bzw. reduziertes Gehrungsreihen-GFP zu detektieren. Verwenden Sie LEDs, um die Anregungswellenlänge zu ändern, und einen für GFP geeigneten Emissionsfilterwürfel. Wenn der Anregungsfilter entfernt ist, stellen Sie die Kamera auf eine nacheinander Benning ein, um eine optimale räumliche Auflösung zu erzielen.

Stellen Sie als Nächstes die Software so ein, dass sie einen Zack erfasst, der aus 11 Schichten mit einem Abstand von 0,5 Mikrometern besteht und beide Kanäle an jeder Z-Position sammelt. Lokalisieren Sie die Brennebene von Zellen mit Durchlicht, um das Ausbleichen der Fluoreszenzsonde zu minimieren. Nehmen Sie dann eine Z-Serie über die gesamte Tiefe einer typischen Zelle mit einer Schrittweite von 0,5 Mikrometern auf, um sie für die Bildgebung einzurichten.

Könnte ein Team zu zweit an einem spektralen konfokalen Mikroskop gehen. Verwenden Sie das Objektiv mit der höchsten numerischen Apertur, das hier erhältlich ist. Zum Einsatz kommt eine 100 x 1,49 APO Rasenlinse.

Konfigurieren Sie das Mikroskop so, dass es migo a team two bei 488 Nanometern anregt und die Emission von 500 bis 520 Nanometern für eine TP-Bindung und von 550 bis 580 Nanometern sammelt. Für ein TP ungebundene Formulare. Die tatsächlich optimalen Werte können je nach den Eigenschaften des Bildgebungssystems variieren.

Stellen Sie die Lochblende auf 1,0 Flächeneinheiten ein und legen Sie sie dann fest. Scan-Zoom, um sich dem Nyquist-Sampling-Limit zu nähern. Um die Bildgeschwindigkeit zu erhöhen, schneiden Sie das Feld auf 512 x 256 Pixel zu.

Verwenden Sie bei Bedarf die Scan-Mittelwertbildung, um das Rauschen zu reduzieren. Verbrauchen Sie so wenig Laserleistung wie möglich und erzeugen Sie dennoch ein interpretierbares Bild. Verwenden Sie ein internes oder externes Leistungsmessgerät, um Änderungen der Laserleistung zu überwachen, die normalerweise im Laufe der Zeit in jedem optischen System auftreten.

Passen Sie die Detektorverstärkung und die Beleuchtungsintensität an, um den Dynamikbereich zu maximieren. Aber vermeiden Sie Sättigung. Analysieren Sie keine Zellen mit mehr als 1 % gesättigten Pixeln.

Lokalisieren Sie die Fokusebene von Zellen mit Durchlicht, bevor Sie eine Z-Serie durch die Haltetiefe einer typischen Zelle mit einer Schrittweite von 0,5 Mikrometern sammeln. Bilden Sie alle Proben mit demselben objektiven Laserleistungsscan ab, zoomen Sie die Pixelgröße, die Verstärkung und den gleichen Offset. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder und ändern Sie den Typ auf 32 Bit, um den Hintergrund zu bestimmen. Zeichnen Sie einen Interessenbereich oder ROI in einem Bereich, in dem keine Zellen vorhanden sind.

Auswählen, analysieren, messen, um die mittlere Intensität in diesem ROI zum Ergebnisfenster hinzuzufügen. Um diesen Wert vom Stapel zu subtrahieren, wählen Sie Prozessmathematik und Subtrahieren. Geben Sie dann die mittlere Intensität des Hintergrunds ein und wählen Sie Vorschau.

Okay und ja, die Festlegung von Schwellenwerten ist der schwierigste Aspekt des Verfahrens. Um den Erfolg sicherzustellen, definieren Sie Schwellenwertparameter so, dass das resultierende Bild die tatsächliche Größe des fluoreszierenden Objekts im Originalbild beibehält. Die Verwendung exakt der gleichen Belichtungsbedingungen für jedes Experiment trägt dazu bei, eine konsistente Schwellenwertbestimmung während der gesamten Bildverarbeitung zu erzielen.

Ein zu niedriger Schwellenwert schließt Hintergrundpixel ein. Ein zu hoher Schwellenwert eliminiert Teile der Mitochondrien aus der Analyse mit dem subtrahierten Zack, findet die mittlere Schicht und wählt Bildanpassung und Schwellenwert und dann den Schwellenwert für die Mitochondrien aus, nachdem ein geeigneter Schwellenwert gefunden wurde. Klicken Sie auf Anwenden, um diesen Schwellenwert auf alle Slices im Stack anzuwenden.

Aktivieren Sie dann die Option Hintergrundpixel auf NAN oder keine Zahl festlegen und klicken Sie auf OK und ja, wiederholen Sie diesen Vorgang für das andere Bild. Erstellen Sie den Z-Stapel des Verhältnisses, indem Sie auf Verarbeiten und dann auf Bildrechner klicken. Teilen Sie den reduzierten Stack durch den oxidierten C-Stack für die MIT O-R-G-F-P one-Analyse.

Das gleiche Protokoll wird für die migo AAM two Analyse verwendet. In diesem Fall dividieren Sie das 560-Nanometer-Bild von A TP durch das ungebundene 510-Nanometer-Bild von A TP. Zeichnen Sie einen ROI um den Interessenbereich.

Wählen Sie Analysewerkzeuge aus. ROI-Manager und klicken Sie auf Hinzufügen, um den ROI aufzuzeichnen, und wählen Sie dann mehr Multi-Measure und OK. Kopieren Sie abschließend die Zeilenzahl, den Bereich und den Mittelwert und exportieren Sie die Daten zur Analyse in eine Tabelle, verwenden Sie die Tabelle, um die Flächenmultizitate zu berechnen, die gewichtete Summe und die gewichteten durchschnittlichen Zellen, die Mitochondrien exprimieren, zielen GFP und Zeile GFP eins mit normalen Raten an

Die maximale Wachstumsrate ist in Zellen, die mito GFP exprimieren, und MIT, Reihe GFP eins, ähnlich. Darüber hinaus sind Mitochondrien und Hefen, die MIT RO GF P one exprimieren, röhrenförmig entlang der Mutterknospenachse ausgerichtet und reichern sich an den Spitzen der Mutter- und Tochterzellen an. Diese normale Morphologie deutet darauf hin, dass MIT RO GF P one die mitochondriale Funktion nicht stört.

Um den dynamischen Bereich von mitg FP einer Midlock-Phase Wildtyp-Hefezellen mit Wasserstoffperoxid und Dihi drei Etol, zu beurteilen, wurde das mittlere Verhältnis von mitochondrial reduziert zu oxidiert gemessen, um den mitochondrialen Redoxzustand zu beurteilen, die Titration des mitochondrialen Redoxzustands mit Wasserstoffperoxid oder DTT von null bis 10 millimolar führt zu einer dosisabhängigen Änderung. Im mittleren Verhältnis von mitochondrialen reduzierten zu oxidierten Bedingungen mit einem gemessenen Bereich von 0,6 unter oxidierenden Bedingungen bis 1,23 unter reduzierenden Bedingungen. Damit ist mitg FP one ein effektiver Biosensor für die Analyse der mitochondrialen Datierung in lebenden Zellen.

Mito RO GFP one bietet auch eine subzelluläre Auflösung des mitochondrialen Redoxzustands. Diese subzelluläre Auflösung zeigt, dass sich Mitochondrien innerhalb einzelner Hefezellen im relativen Redoxzustand unterscheiden: Licht kann Veränderungen im GFP Chromo vier induzieren, wenn es einer hohen Lichtintensität von 400 Nanometern ausgesetzt wird. Während des analysierten Zeitraums gibt es keine signifikante Fotokonversion.

Die bevorzugte Methode zur Reduzierung der Photokonversion besteht darin, die oxidierte Form des Reihen-GFP bei 365 Nanometern anzuregen. MIGO AAM, zwei Co-Lokalisationen mit DAPI-gefärbter mitochondrialer DNA in Hefe und finden sich in röhrenförmigen Strukturen, die für Wildtyp-Hefe-Mitochondrien typisch sind. Darüber hinaus ist die Wachstumsrate von Zellen, die MIGO AAM zwei exprimieren, ähnlich wie die von Zellen, die Mitochondrien spezifisches GFP sowohl in Glukose- als auch in Glycerinmedien exprimieren. Daher scheint die Expression von migo A two für die Zelle oder die Mitochondrien nicht schädlich zu sein. Um zu testen, ob migo A two auf Veränderungen der mitochondrialen A TP-Spiegel reagiert, wurden die Zellen mit Antimycin A behandelt, einem Mittel, das die mitochondriale A TP-Produktion hemmt.

Das mediane Bundverhältnis nimmt bei Zellen, die mit Antimycin behandelt werden, ab. Interessanterweise deuten die vorläufigen Daten darauf hin, dass es Unterschiede in den TP-Spiegeln in verschiedenen Mitochondrien innerhalb derselben Zelle geben kann. Einmal gemeistert, kann diese Technik in mehreren Stunden durchgeführt werden.

Darüber hinaus ist es bei diesem Verfahren wichtig, die Bildgebungsparameter konstant zu halten und gleichzeitig die Zellen auf mitochondriale Fragmentierung und andere Anzeichen von Phototoxizität zu überwachen. Vermeiden Sie Photobleaching und entwickeln Sie einheitliche Kriterien für die Festlegung von Schwellenwerten. Diese Biosensoren können verwendet werden, um mitochondriale Veränderungen in lebenden Pflanzenpilzen und Säugetierzellen zu überwachen.

Sie können auch verwendet werden, um mitochondriale Veränderungen bei Neurodegeneration, Stoffwechselerkrankungen und anderen Krankheiten, die mit Defekten in den mitochondrialen Funktionen verbunden sind, zu überwachen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, metrische Fluoreszenzfarbstoffe für Mitochondrien zu verwenden, um den mitochondrialen Redoxzustand und eine TP in lebenden Zellen zu überwachen.