Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Transport eines Drug-Delivery-Systems oder des therapeutischen Wirkstoffs zu bewerten, den es über eine zelluläre Barriere wie ein Modell des gastrointestinalen Epithels – relevant für die orale Applikation von Arzneistoffen – befördert. Dies wird erreicht, indem zunächst Caco-2-Zellen auf Transwell-Einheiten kultiviert werden, um eine Differenzierung der Zellen und die Bildung einer Zellschicht zu ermöglichen.

Der zweite Schritt besteht darin, zu überprüfen, ob dieses Modell eine Permeabilitätsbarriere darstellt, indem der trans-epitheliale elektrische Widerstand gemessen, die Zelljunctions immunhistochemisch gefärbt und die passive Permeabilität eines nachweisbaren Tracermoleküls bewertet wird. Der nächste Schritt ist die Herstellung des Arzneimitteldelivery-Systems; in diesem Beispiel werden gezielte polymere Nanotransporter verwendet. Die Transportsysteme können eine Arzneimittelbeladung enthalten oder nicht, und Kontrollen wie nicht-gezielte Trägersysteme oder ein freies Arzneimittel müssen einbezogen werden.

Diese Elemente sind mit Radioisotopen markiert, um ihre Detektion zu ermöglichen. Anschließend werden die Träger nach der Inkubation in die apikale Kammer über der Zellmonolage gegeben. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden die Träger aus der apikalen Kammer, der basolateralen Kammer und der Zellmonolage gesammelt und auf eine mögliche Degradation der markierten Komponente untersucht.

Der Transport von Nanocarriern über die Zellmonolayer wird anschließend abschließend berechnet, um den Transportmechanismus zu untersuchen. Ähnliche Experimente müssen in Gegenwart pharmakologischer Inhibitoren der Transzytose über Zellen oder mit Reportern des parazellulären Transports zwischen Zellen durchgeführt werden. Die hier beschriebene Technik ist eine Anpassung etablierter Methoden, die zur Bewertung der Rate und des Mechanismus des Transports von Arzneimitteln und nanoskaligen Arzneimittelträgern über Zellmonolayer in Kultur verwendet werden und somit körpereigene Zellbarrieren repräsentieren.

Obwohl das hier betrachtete Beispiel den Transport gezielter polymerer Nanopartikel über ein Modell des gastrointestinalen Epithels validiert, können ähnliche Methoden auch zur Untersuchung des Durchtritts verschiedener Drug-Delivery-Systeme über diese oder andere Zellmonolagen eingesetzt werden, wie beispielsweise endotheliale Zellen, die typischerweise eine Barriere zwischen dem Blutkreislauf und Geweben sowie Organen bilden. Im Fall der Blut-Hirn-Schranke haben beispielsweise Personen, die neu in dieser Methode sind, häufig Schwierigkeiten, weil es schwer ist, geeignete Markierungen auszuwählen, um Drug-Delivery-Systeme in solchen Studien korrekt zu verfolgen, insbesondere wenn sie durch Zellen hindurchtransportiert werden und in geringen Mengen vorliegen.

Für diesen Aspekt verwenden wir Radioisotope zur Markierung von Arzneimittelabgabesystemen in unseren Studien. Eine weitere zentrale Fragestellung ist die Validierung der Integrität der modellhaften Zellbarriere und die Verwendung geeigneter Kontrollen, um dies im Verlauf der Experimente zu überprüfen. Dieses Verfahren wird in einer sterilen Zellkulturwerkbank der Biosicherheitsstufe zwei durchgeführt, und alle Materialien, die in die Werkbank eingebracht werden, müssen mit Ethanol sterilisiert werden. Verwenden Sie Pinzetten, um 0,8-Mikrometer-Poor-Polyethylen-Tarif-Phthalat-Transwell-Einsätze in eine 24-Loch-Platte einzubringen, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen.

Jede experimentelle Bedingung erfordert mindestens vier Wiederholungen. Verdünnen Sie humane epitheliale kolorektale Adenokarzinom- oder Caco-2-Zellen in zuvor vorbereitetem Zellmedium. Geben Sie 200 bis 400 Mikroliter der Zellsuspension in die obere oder apikale Kammer des Transwells.

Pflanzen Sie mit einer Dichte von 1,5 × 10⁵ Zellen pro cm² aus. Füllen Sie die untere oder basolaterale Kammer mit 700 bis 900 µL Zellkulturmedium und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit für 16 bis 21 Tage. Ersetzen Sie alle drei bis vier Tage das Medium in der oberen und unteren Kammer.

Ersetzen Sie das Medium in der folgenden Reihenfolge, um den Druck über der Zellschicht aufrechtzuerhalten: Aspirieren Sie das Medium aus der unteren Kammer, anschließend aus der oberen Kammer. Füllen Sie die obere Kammer mit 200 bis 400 Mikrolitern frischem Medium und die untere Kammer mit 700 bis 900 Mikrolitern frischem Medium, um die epitheliale Permeabilitätsbarriere mittels TEER zu validieren. Stellen Sie das Volt-Ohm-Meter auf die Widerstandsmessung ein und platzieren Sie die Elektroden senkrecht in einem Behälter, der das Transwell-Insert enthält.

Die kurze Elektrode sollte sich in der oberen Kammer und die lange Elektrode in der unteren Kammer befinden, wobei letztere den Boden des Wells berührt. Sobald sich der Messwert des Voltmeters stabilisiert hat, notieren Sie den Widerstandswert in Ohm für jedes Well. Wiederholen Sie die Messungen alle ein bis zwei Tage, bis die Werte ansteigen und ein Maximum erreichen, das sich dann stabilisiert, was auf die Bildung einer Permeabilitätsbarriere hinweist. Dieser Vorgang dauert in der Regel zwei bis drei Wochen ab dem Zeitpunkt der Zellsemination.

Um das Vorhandensein von Tight Junctions in Zellmonolagen der hohen Stufe zunächst zu überprüfen, fixieren Sie die Zellen, aspirieren Sie das Medium aus beiden Kammern und waschen Sie die Zellen dreimal mit warmem DMEM; inkubieren Sie anschließend 15 Minuten lang mit kaltem 2 % Paraformaldehyd. Nach 15 Minuten entfernen Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Danach geben Sie je einen Mikrogramm pro Milliliter Anti-Occludin hinzu.

Verwenden Sie Wells mit geringer Permeabilität als negativen Kontrollwert für die Barrierebildung. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten waschen Sie die Zellen erneut mit PBS und geben dann pro Well 7,5 Mikrogramm pro Milliliter markierte sekundäre Antikörper zu. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Schließlich waschen Sie die Zellen mit PBS und schneiden vorsichtig die Filtermembran aus, an der die fixierte Zellschicht haftet. Bringen Sie diese auf Objektträgern zur Bildgebung mittels Epi-, Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie an.

Dieses Verfahren beginnt mit der Markierung des Zielantikörpers mit Iod-125 und der Berechnung der spezifischen Aktivität des markierten Antikörpers in Zählraten pro Minute pro Mikrogramm anhand zuvor veröffentlichter Protokolle. In diesem Beispiel handelt es sich bei dem Zielantikörper um einen mausmonoklonalen Antikörper gegen das humane interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 oder anti-ICAM-1 zur Kontrolle der Spezifität. Mit Iod-125 markiertes Maus-IgG wird verwendet, um nicht-zielgerichtete beschichtete Nanotransporter herzustellen, um den Transport einer therapeutischen Fracht zu untersuchen.

Die Fracht wird außerdem mit Iod-125 markiert. In diesem Beispiel handelt es sich bei der Fracht um Alpha-Galactosidase oder Alpha G, ein therapeutisches Enzym, das zur Behandlung der Fabry-Krankheit, einer genetischen lysosomalen Speicherkrankheit, verwendet wird. Einer der schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens besteht darin, einen ausreichenden Nachweis der transportierten Materialien sicherzustellen.

Um den Erfolg sicherzustellen, müssen die Bestandteile von Nanocarriern mit einer ausreichenden Menge an Isotopen in hoher spezifischer Aktivität markiert werden. Der nächste Schritt besteht darin, die markierten anti-ICAM-Antikörper an die Oberfläche der Nanocarrier zu koppeln. In diesem Fall mischen wir einfach die mit Iod-125 markierten anti-ICAM-Antikörper mit Polystyrol-Nanopartikeln mit einem Durchmesser von 100 Nanometern als Modell für die unspezifische Kontrolle.

Verwenden Sie jod-1-25-markiertes IgG, und um den Transport eines Cargos zu verfolgen, verwenden Sie eine Kombination aus anti-ICAM und jod-1-25-markiertem Alpha-G. Inkubieren Sie die Gemische eine Stunde bei Raumtemperatur, um die Oberflächenabsorption zu ermöglichen; nach einer Stunde zentrifugieren Sie bei 13.000 ×g für drei Minuten und entfernen anschließend die nicht beschichteten Partnervarianten im Überstand mittels Absaugpipette. Suspendieren Sie das Pellet, das die beschichteten Nanotransporter enthält, in 1 % Rinder-Serumalbumin in PBS und sonifizieren Sie danach bei niedriger Leistung, um potenzielle Partikelaggregate aufzubrechen. Geben Sie jod-1-25-markierte anti-ICAM-Nanotransporter in die obere Kammer über konfluente Caco-2-Monolayer mit hohem Transendothelial Electrical Resistance (TEER). Wiederholen Sie das Verfahren für die unspezifischen und therapeutischen Gegenstücke nach der Messung des TEER-Werts.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für ein oder mehrere gewünschte Zeitintervalle. Messen Sie den Reißwert nach der Inkubation erneut. Die Reißmessungen dienen der Beurteilung der Auswirkungen von Nanoträgern auf die Permeabilitätsbarriere.

Sammeln Sie das Medium aus den oberen und unteren Kammern. Spülen Sie die obere Kammer mit 0,5 Millilitern DMEM bei 37 Grad Celsius und die untere Kammer mit einem Milliliter deionisiertem Wasser. Sammeln Sie die Spülungen zur Messung des gesamten Radioisotopgehalts unter Verwendung eines Gammazählers zur Bestimmung der Zellfraktion.

Entfernen Sie den durchlässigen Filter, indem Sie mit einem Rasiermesser entlang der Ränder schneiden. Inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang in einem Gamma-Zählrohr mit 1 % Triton X-100, um den Zellinhalt freizusetzen, bevor Sie die zellgebundene Gesamtradioaktivität messen, um freigesetztes Jod-125 zu quantifizieren, das während des Transports oder aufgrund einer möglichen Degradation aus Nanoträgern ausgetreten ist. Mischen Sie zunächst 300 Mikroliter jeder Probe mit 700 Mikrolitern 3 % BSA in PBS und 200 Mikrolitern Trichloressigsäure (TCA) und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Während dieser 15-minütigen Inkubation messen Sie die Gesamtradioaktivität der Proben in einem Gammazähler. Zentrifugieren Sie die TCA-Proben bei 3000 ×g für fünf Minuten, um das intakte Protein vom abgebauten Protein oder der Jod-125-Fraktion zu trennen. Quantifizieren Sie die Radioaktivität der freien Jod-125-Fraktion und subtrahieren Sie diesen Wert von der vor der Zentrifugation gemessenen Gesamtradioaktivität. Dadurch ergibt sich die Menge des markierten Proteins im Vergleich zu dem Anteil des Radiotracers, der sich davon gelöst hat, um den parazellulären Transport mithilfe von Albumin-Parazellulärleckage-Kulturen zu bewerten. Kultivieren Sie zwei Zellschichten auf Transwell-Einheiten, wie zuvor gezeigt, und geben Sie das Medium in die obere Kammer über der Zellschicht entweder mit Jod-125-markiertem Albumin allein als negativer Kontrolle, die das basale Ausmaß der Leckage zeigt, oder mit Jod.

1 25 markiertes Albumin und nicht radioaktiv markierter Antikörper. Inkubieren Sie gezielte nanoskalige Trägersysteme bei 37 Grad Celsius über die ausgewählten Zeitintervalle, die denen entsprechen sollten, die bei der Untersuchung von nz.Transport verwendet wurden. Messen Sie die Tränenflüssigkeit wie zuvor gezeigt, vor, während und nach der Inkubation.

Sammlen Sie alle Fraktionen nach der Inkubation zur Messung des gesamten Iods 125 und freien Iods 125 als positiven Kontrollwert für die Öffnung der interzellulären Junctions. Geben Sie Zellkulturmedium, das fünf Millimolar Wasserstoffperoxid enthält, in die oberen und unteren Kammern des Transwells. Fügen Sie ein und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.

Messen Sie die Tränenflüssigkeit und geben Sie Iod-125-Albumin in die obere Kammer für die ausgewählten Zeitintervalle hinzu. Bestimmen Sie die Tränenflüssigkeit zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubation, um den Abfall des Tränenwerts infolge der durch Wasserstoffperoxid induzierten Öffnung der Zelljunctions zu ermitteln. In parallelen Experimenten bewerten Sie den transzellulären Transport oder die Transzytose von Iod-125-markierten Nanoträgern, indem Sie konfluente Caco-2-Monolagen mit jedem dieser Inhibitoren inkubieren.

50 Mikromolar MDC, ein Inhibitor der clathrinvermittelten Endozytose. Ein Mikrogramm pro Milliliter Filipin, ein Inhibitor der clarvermittelten Endozytose. 0,5 Mikromolar WT Manin, ein Inhibitor der Phosphatidylinositol-3-Kinase, die an der Makropinozytose beteiligt ist, und 20 Mikromolar EIPA.

Ein Inhibitor der Makropinozytose und der chemisch vermittelten Endozytose misst den TEER (Transepithelial Electrical Resistance) vor, während und nach der Inkubation von Zellen mit Inhibitoren und radioaktiv markierten Substanzen als zusätzliche Kontrolle für den Effekt der Inhibitoren auf die Monolayer-Permeabilität, um Caco-2-Monolayer als Modell für den trans-epithelialen Transport gezielter Nanotransporter zu validieren. Caco-2-Zellen wurden auf Transwell-Einlagen bei einer Dichte von 1,5 × 10⁵ Zellen pro cm² kultiviert, und der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) wurde zur Beurteilung der Monolayer-Integrität gemessen. Wie in dieser Grafik dargestellt, erreichten die Monolayer am Tag 12 Konfluenz und behielten ihre Integrität bis zum Tag 18 bei. Dieses Ergebnis wurde weiterhin durch das Vorhandensein von Occludin-positiven engen Verbindungen (tight junctions) in Monolayern mit einem hohen TEER-Wert von 380 Ohm pro cm² am Tag 14 bestätigt, verglichen mit schwacher Färbung enger Verbindungen bei einem niedrigen TEER-Wert von 17 Ohm pro cm² am Tag 5. Um den Transport von Anti-ICAM-Nanotransportern über Caco-2-Zellmonolayer zu untersuchen, wurden konfluente Caco-2-Monolayer auf Transwell-Einlagen mit radiojodmarkierten (¹²⁵I) Anti-ICAM-Nanotransportern in der apikalen Kammer inkubiert.

Der Iod-125-Gehalt in der basolateralen Kammer wurde zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen, um die pro Zelle transportierte Menge an Nanoträgern zu berechnen, wie in der oberen Darstellung gezeigt. In der unteren Darstellung wurde der Prozentsatz der transportierten Nanoträger als Verhältnis der in der basolateralen Fraktion gefundenen Träger zur Gesamtmenge in der kombinierten basolateralen und Zellfraktion berechnet. Diese in diesem Beispiel für Iod-125-markierte anti-ICAM-Nanoträger ermittelten Parameter wurden ebenfalls mit denen der Kontrolle, Iod-125-markierten IgG-Nanoträgern, verglichen, um die Transporteffizienz im Vergleich zu einem nicht gezielten Gegenstück zu demonstrieren; die Ergebnisse sind in der oberen Darstellung dargestellt.

Es wurden ebenfalls scheinbare Permeabilitätskoeffizienten berechnet, die die Transportraten von Iod-125-markierten anti-ICAM-Nanoträgern oder Iod-125-markierten IgG-Nanoträgern widerspiegeln, wie in der unteren Darstellung gezeigt, wenn die radioaktive Markierung am Nanoträger-Gut angebracht ist. Die beschriebenen Parameter spiegeln den Transport des Guts wider, welches in diesem Beispiel das alpha-GA-Enzym darstellt, das zur Behandlung einer genetischen lysosomalen Speicherkrankheit, bekannt als Fabry-Krankheit, verwendet wird. Der Radioisotopengehalt der apikalen, basolateralen und zellulären Fraktionen wurde nach drei und 24 Stunden gemessen und in verschiedene für den Transport relevante Werte umgerechnet, wie in dieser Tabelle dargestellt.

Zusätzlich zur Berechnung des Nanocarrier-Transports durch Verfolgung der Fracht kann die trans epitheliale Freisetzung dieses therapeutischen Enzyms geschätzt werden, indem sie als Moleküle oder Pikogramm transportiertes Alpha-Gal pro Zelle ausgedrückt wird. Der Transportmechanismus von Anti-ICAM-Nanocarriern über Caco-Monolagen wurde ebenfalls untersucht. Der transzelluläre Transport von Iod-125-markierten Anti-ICAM-Nanocarriern über konfluente Caco-2-Monolagen wurde nach 24 Stunden in Abwesenheit oder Gegenwart der folgenden Inhibitoren bewertet: EIPA, Filipin, MDC oder Wirtmanin. EIPA ist ein Inhibitor der Makropinozytose und caveolaven Endozytose. Filipin, MDC und Wirtmanin sind Inhibitoren der clathrinvermittelten Endozytose, caveolaven Endozytose bzw. Makropinozytose.

Wie in diesem Diagramm dargestellt, verringerte EIPA den Transport von Iod-125-markierten anti-IAM-Nanoträgern über CACO-2-Zellmonolayer, während Philippine MDC und Wirt Menin die Transportniveaus im Vergleich zur Kontrollbedingung nicht reduzierten. Dies deutet darauf hin, dass anti-ICAM-Nanoträger die chimärvermittelte Endozytose für den transzellulären Transport nutzen, nicht jedoch CLIC-, Clathrin- oder makropinozytoseassoziierte Transzytose.

Um den parazellulären Transport zu bewerten, wurde der TEER-Wert während des Transports von Iod-125-markierten Anti-ICAM-Nanoträgern über Caco-2-Monolayer gemessen. Zwei Monolayer-TEER-Werte in Abwesenheit von Nanoträgern sind als Kontrollen dargestellt, und das gestrichelte Intervall markiert das Standardfehler des Mittelwerts (SEM) der Inkubation mit fünf Millimolar. Die Inkubation mit Wasserstoffperoxid diente als positive Kontrolle für die Öffnung der interzellulären Junctionen, was sich in der Abnahme des TEER-Werts auf Basalniveau widerspiegelt.

Zusätzlich wurde der parazelluläre Proteinaustritt, gemessen als scheinbarer Permeabilitätskoeffizient von Iod-125-Albumin, das die Zellmonolage in Abwesenheit oder Anwesenheit von fünf Millimolar Wasserstoffperoxid, IgG-Nanoträgern oder anti-ICAM-Nanoträgern durchquert, ermittelt und berechnet. Wasserstoffperoxid verstärkte signifikant den Austritt von Iod-125-Albumin in die basolaterale Kammer und diente als positiver Kontrollwert, wie in diesen Grafiken dargestellt. Die Inkubation mit anti-ICAM-Nanoträgern veränderte weder Tränenflüssigkeit noch den parazellulären Austritt von Iod-125-Albumin über einen Zeitraum von 48 Stunden, vergleichbar mit den Kontroll-IgG-Nanoträgern, die nicht transportiert werden.

Diese Ergebnisse schließen einen parazellulären Transport aus und stimmen mit früheren Ergebnissen überein, die darauf hindeuten, dass Anti-ICAM-Nanotransporter den cam-vermittelten Endozytoseweg für den transzellulären Transport nutzen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine oder mehrere geeignete Zelltypen sowie einen permeablen Filter mit geeigneter Porengröße, Materialdurchmesser usw. für das Transwell-Modell sowie Markierungstechniken zur effektiven Quantifizierung Ihres Arzneimitteldeliverysystems nach diesem Verfahren auszuwählen. Andere Methoden wie Fluoreszenz- oder Transmissions-Elektronenmikroskopie können verwendet werden, um den Ort der transportierten Materialien zu bestimmen und zusätzlich den Zustand der transportierten Materialien zu überprüfen.

Mittels Western Blot kann der Proteinabbau gemessen werden. Mit EISA lässt sich die Zielgerichtetheit transportierter Trägersysteme bestimmen, und die Aktivität der Wirkstofffracht kann mithilfe spektrophotometrischer Assays oder anderer geeigneter Techniken gemessen werden.