Ein Dezellularisierung Methodik für die Herstellung von Naturdarm Azelluläre Matrix

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein natürliches azelluläres Gerüst für das Darmgewebe-Engineering zu schaffen. Dies wird erreicht, indem zuerst eine obere Mesenterialarterie (SMA) der Ratte kanüliert und der Dünndarm zusammen mit dem Gefäßzugang entnommen wird. Im zweiten Schritt werden die intraluminalen Trümmer ausgewaschen und die intraluminalen und Gefäßkanülen mit einer Schlauchpumpe verbunden.

Anschließend wird der Dünndarm 24 Stunden lang mit entionisiertem Wasser bei vier Grad Celsius durchblutet. Im letzten Schritt wird der Dünndarm bei Raumtemperatur mit Natriumdesoxy, Mantel und DNA durchblutet. Letztendlich kann die vollständige Dezellularisation des Dünndarms sowie seine Architektur und Bestandteile durch Histologie bzw. Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Wir sind derzeit mit dem klinischen Problem des Darmversagens konfrontiert, einer verheerenden Erkrankung, die sowohl Kinder als auch Erwachsene betrifft. Die Ernährung der Eltern und die konventionelle Transplantation bieten keine vollständige Heilung. Die Herstellung von dreidimensionalen vaskularisierten Darmgerüsten, wie im folgenden Video gezeigt, erstreckt sich auch auf die Therapie der Darminsuffizienz.

Das Bemerkenswerte an dieser Technik ist, dass durch den Einsatz schonender Digitalisierungschemikalien die Mikroarchitektur des Darms erhalten bleibt, wie die elektronenmikroskopischen Ergebnisse zeigen. Darüber hinaus ermöglicht die Aufrechterhaltung eines hierarchischen Gefäßnetzwerks, das der Zivilisation folgt, die Aussaat einer Struktur, die wieder mit dem Wirt verbunden werden kann. Blutversorgung Beginnen Sie mit dem Einsetzen einer Schlauchpumpe mit zwei Schläuchen, lassen Sie dann 70 % Ethanol 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit durch die Schläuche der Schlauchpumpe laufen, gefolgt von frisch zubereitetem PBS AA für weitere 15 Minuten.

Nach dem Spülen des Pumpes den Bauch einer euthanasierten 250 bis 350 Gramm schweren Spra Dolly Ratte mit 70%Ethanol einsprühen und abwischen. Führen Sie dann mit autoklavensterilisierten chirurgischen Instrumenten einen XO-Schamlaparotomieschnitt am Bauch durch, um ein klares Operationsfeld zu gewährleisten, und nehmen Sie den Dünndarm auf der rechten Seite des Tieres auf ein Papiertuch aus, das mit 70 % Ethanol besprüht ist. Achten Sie darauf, den Darm kontinuierlich mit P-B-S-A-A zu benetzen, um eine Austrocknung des Gewebes und eine Denaturierung der extrazellulären Matrix zu vermeiden.

Lokalisieren Sie als Nächstes das SMA, das in einem 90-Grad-Winkel von der Aorta zum Darm hin entsteht. Legen Sie eine Naht um die SMA und bereiten Sie einen Knoten vor. Verwenden Sie eine 27-Gauge-Kanüle, um das SMA aus der Aorta einzuführen, und ziehen Sie dann die Nadel schnell zurück, um ein Reißen der Gefäßwand zu vermeiden.

Schieben Sie nun den Kunststoffschlauch der Kanüle in die SMA vor, sichern Sie den Schlauch mit Vicryl five oh Nähten und injizieren Sie dann 10 Milliliter P-B-S-A-A, um die Kanülierung zu bestätigen. Als nächstes verwenden Sie eine Schere, um die Aorta proximal und distal der SMA zu schneiden, um die Kanüle zu lösen, um ein Austreten von Kot beim Präparieren des Dickdarms zu vermeiden, platzieren Sie einen Seidenknoten mit fünf oh Nähten am proximalen Ende des ileozökalen Übergangs und einen am distalen Ende des Sigmas. Schneiden Sie dann das terminale Ileum und den Dickdarm zwischen den beiden Knoten ab und entfernen Sie den Dickdarm.

Durchtrennen Sie nun den Dünndarm am Juno-Zwölffingerdarmübergang und befreien Sie den Darm von eventuellen Bindegewebsverbindungen mit dem Bauchraum. Übertragen Sie den Dünndarm in eine Petrischale, die PBS aa enthält. Verwenden Sie dann eine hintere Kunststoffpipette, um den proximalen Abschnitt des Darms zu kanülieren und ihn mit Nähten zu befestigen.

Schneiden Sie zum Schluss die Pipette so ab, dass sie in den Köderverschluss einer 60-Milliliter-Spritze passt, und spülen Sie dann das Darmlumen mit zwei Waschgängen von 60 Millilitern P-B-S-A-A, um Kot und Ablagerungen zu entfernen. Bevor Sie mit dem Dezellularisierungsprozess beginnen, stellen Sie sicher, dass keine Blasen im Darmlumen und in den Gefäßkanülen vorhanden sind. Verbinden Sie dann einen Drei-Wege-Absperrhahn mit der Gefäßkanüle und stellen Sie die Petrischale in einen Behälter, um überlaufende Lösung aufzufangen. Beginnen Sie als Nächstes, deionisiertes Wasser mit 0,6 Millilitern pro Stunde durch die Master flex LS Rollenpumpe mit variabler Drehzahl laufen zu lassen.

Behandeln Sie das Gewebe vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Blasen aus dem distalen Ende austreten. Sobald alle Blasen von den Kanülen entfernt wurden, bringen Sie das Gerät in den Kühlraum. Beginnen Sie dann den Dezellularisierungsprozess, indem Sie sowohl das Darmlumen als auch den Gefäßbaum in der ersten Stunde 24 Stunden lang mit fließendem deionisiertem Wasser bei 0,6 Millilitern pro Stunde perfundieren.

Überprüfen Sie das Gerät regelmäßig, um sicherzustellen, dass alle Verbindungen sicher sind. Die Leckage ist minimal und es sind keine Blasen im Darm vorhanden. Nach 24 Stunden das Dezellularisierungsgerät wieder auf Raumtemperatur bringen.

Die Farbe des Darms sollte sich unter einer Absaughaube in ein helles Rosa geändert haben. Wiegen Sie genug Natriumdesoxycoat, um eine 4%ige Lösung in 300 Millilitern entionisiertem Wasser herzustellen. Mischen Sie die Lösung mit einem Wirbel, bis sie klar ist.

Ersetzen Sie nun die deionisierte Lösung durch das Natriumdesoxy-Kollat. Überprüfen Sie die Verbindungen. Entfernen Sie alle Blasen und perfundieren Sie den Dünndarm vier Stunden lang mit 0,6 Millilitern pro Stunde.

Nach dem Schritt der Natriumdesoxy-Kollatierung wird das Gewebe transparent. Die Aufrechterhaltung des Gefäßnetzes zeigt sich auch nach der Zugabe von PBS AA zur Pumpe. Waschen Sie den Darm mit PBS AA für 30, um Wechselwirkungen zwischen Natriumdesoxy, Mantel und DNA zu vermeiden.

Anschließend durchbluten Sie das Gewebe mit frisch präparierten DNAs, eine davon bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 0,6 Millilitern pro Stunde. Übertragen Sie das Gerüst nach drei Stunden in eine Gewebekulturhaube und wechseln Sie die Platte mit einer septischen Technik. Sterilisieren Sie die Schläuche der Schlauchpumpe erneut, indem Sie Ethanol durchlaufen lassen.

Waschen Sie den Darm ein letztes Mal 30 Minuten lang mit P-B-S-A-A, um sicherzustellen, dass alle Reste der Dezellularisierungslösungen entfernt werden. Übertragen Sie schließlich das Gerüst auf einen UV-Vernetzer und führen Sie zwei Sterilisationszyklen durch. Lagern Sie dann das Gerüst in P-B-S-A-A.

Wechseln Sie die Lösung alle drei Tage. Nach erfolgreicher Dezellularisierung sollte das Gerüst ein makroskopisches Aussehen haben, das dem des nativen Darms ähnelt, jedoch mit durchscheinenden Wänden. Der Erhalt der Makroarchitektur sollte sich auch in der Durchgängigkeit des Gefäßbaums bemerkbar machen.

Wenn Farbstoff durch die SMA-Kanüle injiziert wird, sollte er sich gleichmäßig im Gerüst verteilen und den Kapillarbaum erreichen. Das Gerüst sollte frei von Kern- und zytoplasmatischem Material sein, was beurteilt werden kann. Unter Verwendung eines DNA-Quantifizierungskits und einer einfachen histologischen Analyse sollte die Hämatin- und Eoin-Färbung das Fehlen von nukleärem und zytoplasmatischem Material nachweisen, während die Dünndarmschichten, wie in diesem Bild gezeigt, erhalten bleiben.

Insbesondere sollte der Erhalt der Zotten und Crips auf der luminalen Seite nach der Rasterelektronenmikroskopie erkennbar sein. Eine weitere Konservierung der extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagen, Elastin und Glyko-Amin-Glykane sollte ebenfalls erwartet werden, wie hier gezeigt. Die Massen Tri CHRO-Färbung ermöglicht beispielsweise den Nachweis des intakten Bindegewebes im Gerüst.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das natürliche zelluläre Darmgerüst erstellen.