Name: Ein Dezellularisierung Methodik für die Herstellung von Naturdarm Azelluläre Matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-07T22:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Erfahren Sie eine Dezellularisierungsmethode zur Herstellung natürlicher azellulärer Darmmatrizen aus Rattenintestinum. Diese Technik bewahrt die Gefäßarchitektur und ermöglicht neue Ansätze in der Geweberegeneration.

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Die Autoren danken der Wake Forest Institut für Regenerative Medizin für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken für die Unterstützung durch Zuschüsse aus dem Great Ormond Street Hospital Nächstenliebe, die Stiftung Eugenio Litta (Genf, Schweiz), das Medical Research Council, dem Royal College of Surgeons of England, die Funken für Kinderheilnächstenliebe, des britischen Außenministeriums für die UK / USA Stammzell Collaboration Award und dem Forschungsfonds Mittal. Wir möchten auch, um die Royal Society / Wolfson-Stiftung für die für die Kinderchirurgie-Abteilung im Institut der Kind-Gesundheit erhalten Tissue Engineering Labor Sanierung Zuschuss danken. PDC und SE werden von der Great Ormond Street Hospital Kinderhilfswerk unterstützt.

1. Isolierung von Ratten-Darm <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung aus 1 L Phosphate Buffered Saline (Sigma, UK) mit 1% Antibiotikum / Antimykotikum (Sigma, UK) (PBS / AA). Setzen Sie die Schlauchpumpe (Masterflex L / S mit variabler Geschwindigkeit) mit zwei Röhren. Laufen 70% Ethanol (EtOH) durch die Rohre der peristaltischen Pumpe für 15 min bei maximaler Geschwindigkeit, gefolgt von PBS / AA für weitere 15 min. </li><li> Euthanize erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von ca. 250 bis 350 g CO 2 durch Einatmen und Genickbruch in Übereinstimmung mit den örtlichen Tier Richtlinien und Zulassungen (in Großbritannien, Home Office Leitlinien unter den Animals (Scientific Procedures) Act 1986). </li><li> Autoklaven werden die chirurgischen Instrumente vor dem Gebrauch. Spray und wischen Sie den Bauch des Tieres mit 70% EtOH. </li><li> Führen Sie eine xifo-Scham laparotomic Einschnitt auf dem Bauch, um eine klare OP-Feld zu gewährleisten. </li><li> Ausweiden des Dünndarms auf der rechten Seite des Tieres auf ein Papiertuch mit 70% EtOH besprüht. Take darauf, den Darm mit PBS / AA kontinuierlich zu benetzen, so daß die Dehydratisierung des Gewebes und Denaturierung der extrazellulären Matrix (ECM) zu vermeiden. </li><li> Finde die Arteria mesenterica superior (SMA), die sich in einem Winkel von 90 ° von der Aorta zu den Darm. Verwenden Sie eine 27 G Kanüle, um die SMA aus der Aorta geben und schnell die Nadel zurückziehen, um nicht zu zerreißen die Wand des Gefäßes. Schieben Sie die Kunststoffrohr der Kanüle in der SMA und sichern mit Nähten (Vicryl 5/0). </li><li> Kanülierung bestätigen durch die Injektion von 1 ml PBS / AA. Verwenden Feder Schere, um die Aorta proximal und distal zu dem SMA einzuschneiden, so daß die Kanüle freizugeben. </li><li> Leckage von Fäkalien zu verhindern, wenn die Zerlegung Dickdarm auftreten, legen (Seide 5/0) Nahtknoten auf dem proximalen Ende des ileocaecal-Übergang und einer an dem distalen Ende des Sigmas. Dann schneiden Sie die terminalen Ileum und Dickdarm zwischen den beiden Knoten und entfernen den Dickdarm. </li><li> Schneiden Sie den Darm an der jejuno-Zwölffingerdarm-Kreuzung einnd befreien den Darm von allen Bindegewebe es Verbindungen mit dem Bauch haben könnte. </li><li> Übertragen Sie den Dünndarm in einer Petrischale mit PBS / AA. Kanülieren den proximalen Darmabschnitt mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette (LSL Laborverbrauchsmaterialien) und befestigen Sie sie mit Nähten. Schneiden Sie die Pipette, damit es die Luer-Lok einer 60-ml-Spritze (BD Plastikpak) passen. Spülen Sie das Darmlumen 2x mit 60 ml PBS / AA Kot und Schmutz zu entfernen. </li></ol> 2. Dezellularisierung Methodik <ol><li> Verbinden des Gefäßkanüle nach einem Drei-Wege-Hahn. Dies wird Handhabung zu erleichtern, Spannung auf dem Gefäßbaum zu minimieren und Entfernung von Luftblasen aus dem Schlauch. </li><li> Start läuft VE-Wasser (Widerstand 18,2 MOhm / cm) durch die Masterflex L / S mit variabler Geschwindigkeit Rollenpumpe bei 0,6 ml / h. Achten Sie darauf, keine Blasen im Schlauch vor dem Verbinden mit dem Darmlumen Hahn vorhanden sind. Einige Blasen können im Lumen von Schritt vorhanden sein1.9, die die Dezellularisierung Prozess beeinträchtigen können. Variieren der Geschwindigkeit der Pumpe und der Griff des Gewebes mit einer Pinzette vorsichtig, um die Blasen Ausgang von dem distalen Ende zu gewährleisten. Den Kreislauf-Kanüle an, solange dieser Prozess abgeschlossen ist, da hohe Drehzahlen können die Gefäßbaum zu beschädigen. </li><li> Übertragungsvorrichtung in den Kühlraum, da der nachfolgende Schritt der Dezellularisierung wird bei 4 ° C durchgeführt wird Die niedrige Temperatur erlaubt die Entfernung von Zellen, Gewebe, während Zersetzung zu minimieren. Legen Sie die Petrischale in einem Container, der die überquell Lösung sammeln. Perfusion sowohl das Darmlumen und Gefäßbaumes mit entionisiertem Wasser (spezifischer Widerstand 18,2 M &amp;OHgr; / cm) für 24 Stunden bei 0,6 ml / Std. Für die erste Stunde überprüfen das Gerät regelmäßig, um sicherzustellen, dass alle Verbindungen sicher sind, ist Leckage minimal und keine Luftblasen im Darm vorhanden sind. </li><li> Nach 24 Stunden der Behandlung mit VE-Wasser, bewegen Dezellularisierung Gerät außerhalb des Kühlraums wie der Rest der die Schritte sindin Raumtemperatur (RT) durchgeführt. </li><li> Wiegen Natriumdeoxycholat (Sigma, UK) zu 300 ml einer 4% igen Lösung in VE-Wasser vorzubereiten. Wiegen Natriumdeoxycholat unter einer Abzugshaube, da es eine mündliche und Augenreizstoff. Mischen Sie mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Die Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 1 Monat aufrechterhalten werden. </li><li> Ändern Sie den VE-Lösung Natriumdeoxycholat, überprüfen Sie die Verbindungen, entfernen Sie alle Blasen und Perfusion bei 0,6 ml / h für 4 Stunden. </li><li> Nach dem Natriumdesoxycholat Waschschritt mit PBS / AA für 30 min, um die Interaktion zwischen dem Natriumdesoxycholat und DNase-I zu vermeiden. </li><li> Wiegen Sie Desoxyribonuclease-I (DNase-I, Sigma) und bereiten 250 ml einer 2.000 kU Lösung in 1 M Natriumchlorid, pH 7,4. Mischen Sie mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Diese Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden und können nicht gespeichert werden. </li><li> Perfusion mit DNase-I für 3 Stunden bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 0,6 ml / Std. </li><li> Nach der DNase-I-Stufe, die übertragenGerüst in einer Gewebekultur Kapuze und ändern Platten und Instrumente. Es wird vorgeschlagen, aseptisch. </li><li> Waschen mit PBS / AA 30 min zu gewährleisten, dass alle Reste der Dezellularisierung Lösungen entfernt werden. Legen Sie das Gerüst in eine neue Petrischale übertragen und mit einer UV-Crosslinker (Spectroline, US). Führen Sie zwei Sterilisationszyklen. Bewahren Sie in 5% PBS / AA und ändern Sie die Lösung alle 3 Tage. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die schwierigsten Schritte bei der Einrichtung dieses Experiment beinhalten die Kanülierung der SMA und die Errichtung und Wartung von Sterilität. Kanülierung des SMA bei Nagern ohne Zerreißen der Wand kann ziemlich schwierig aufgrund der Größe und Position des Schiffes sein. Alternativ kann ein Nahtmaterial um den proximalen Aorta vor der SMA Herkunft angeordnet werden, gefolgt durch Kanülierung der Aorta selbst distal Leiten des Kunststoffkanüle in die SMA. Während Dezellularisierung eine Kombination von schlechter Kanüle Platzierung und hohe Durchflussraten in den Gefäßzugang zu verlieren, führen. Sterilität ist ein großes Problem wegen der Menge der im Dünndarm vorhanden Bakterienflora. Waschen mit PBS / AA nach der Ernte ist sehr wichtig, und jedes Zeichen von Fäkalien oder Verunreinigungen müssen aus dem Hohlraum entfernt werden. Anordnen eines Teils des Gerüstes in ein Falcon-Röhrchen mit DMEM in den Inkubator nach UV-Sterilisation sollte ein Indikator sein, wenn Sterilität erreicht. Im Falleder bakteriellen Besiedlung, wird die Medien den pH-Wert mit seiner Farbe Drehen von rot nach gelb ändern. Um damit umzugehen, sind weitere UV-Zyklen, wie gut beraten wie Waschen mit PBS, das eine hohe Konzentration an Antibiotikum / Antimykotikum. Eine mögliche Änderung an ein Gerüst sowohl mit Gefäß-und Venenzugang zu erhalten, wäre es, die untere Hohlvene (IVC) sowie die SMA kanülieren. Dezellularisierung aus den Venen-und Gefäß Seiten sollten intermittierend für alle drei Lösungen versucht. Kontinuierliche Dezellularisierung können die Kapillaren mit positiven Druck auf beiden Seiten platzen. Im Laufe der Jahre gab es zahlreiche Versuche im Darm TE unter Verwendung verschiedener Zellgerüst-Kombinationen in vitro und in vivo 6,9,12. Der Großteil der Arbeit wurde durchgeführt unter Verwendung von rohrförmigen Vliesstoff 95% PGA-5% PLGA Gerüste mit Kollagen Typ I beschichteten 6,7,13,22. Nach der Aussaat mit DarmEpithelzellen organoiden Einheiten (OU) und eine Periode der Implantation in das Netz von Mäusen, Zysten bilden sie mit Muskel auf der Außenseite und Epithel auf der Innenseite der dann tubularized werden können. Allerdings ist die Porosität und die Einfachheit in der Konstruktion dieser Gerüste ermöglicht nicht für die Erzeugung von großen Stücken von Kunstdarm in einem in vitro-Umgebung wie der eines Bioreaktors. Zusätzlich kann das Fehlen einer angeborenen Gefäßnetz, die an den Empfänger weiter verbunden werden können, begrenzt die Verwendung dieses Gerüst für klinische Übersetzung. Neben den Versuchen mit den PGA-PLGA Gerüste haben andere Gruppen SIS Kollagen oder Gerüste, die beide nicht die Komplexität des Darmtrakts verwendet replizieren. SIS ist vor allem der bisher einzigen veröffentlichten Methodik der Darmgewebetechnik und hat in mehr als 150 medizinischen Einrichtungen eingesetzt worden, was die Fähigkeit der dezellularisiertes Gerüste auf mechanische Stabilität und fördern das Zellwachstum, während Bleiten zu keiner Immunreaktion. Doch der Mangel an passenden Makro-und Mikro-Architektur, hat schlechte Ergebnisse in ihrem &quot;Einsatz für die Darm TE Zwecke 9-11,23 geführt. Die Vorteile der Dezellularisierung Methodik, die wir beschrieben haben, gehören die Erhaltung der mikroskopischen Eigenschaften wie der Lumen Krypta-Zotten-Architektur, die ein geeignetes Umfeld für die Wiederbevölkerung repräsentieren durch die Darmstammzellnische. Im makroskopischen Aspekt wird das Vorhandensein eines hierarchischen Gefäßnetz ermöglichen die Befestigung an den Empfänger, so dass Bereitstellung von Nährstoffen und Sauerstoff zu allen Schicht des TE 21-Darm. Darüber hinaus hat die Aufrechterhaltung der ECM-Komponenten wie Kollagen, Elastin und glyocosaminoglycans eine wichtige Rolle nicht nur mechanische Eigenschaften, sondern auch die zelluläre Proliferation und Differenzierung lenken. Am wichtigsten ist, die Fähigkeit der Dezellularisierung Methodik in große skaliertr Gewebe unter Beibehaltung der gleichen Eigenschaften ist ein wichtiges Merkmal für die klinische Umsetzung von TE. Die Entwicklung eines natürlichen Darmmatrix mit einer Gefäßnetz ermöglicht die Erstellung von größeren Segmente der künstlichen Darm, die mit dem Host verbunden werden.

Tissue Engineering (TE) bietet eine therapeutische Alternative zur Organtransplantation, unter Umgehung Fragen der Immunsuppression und Organknappheit. TE hat vor kurzem erfolgreiche Anwendungen in der Klinik, mit dem Austausch von Organen wie der Blase 1, 2 Harnröhre und der Luftröhre, sowohl bei Erwachsenen und Kindern 5 3,4. Aufbau einer Tissue-Engineering Organ erfordert die Kombination aus einem Gerüst mit den entsprechenden Zellen. Ein Gerüst kann unter Verwendung von natürlich-abgeleiteten (z. B. Kollagen) hergestellt werden, und synthetische (z. B. Poly-L-Glykolsäure; PLGA)-Materialien oder durch die Dezellularisierung von nativem Gewebe und Organen erhalten werden. Gerüste, die bisher für die Darm TE verwendet wurden, waren hauptsächlich entweder dezellularisierte (Dünndarm-Submukosa) oder synthetischen (Poly-L-Glykolsäure und Poly-Milchsäure) 6-13. Diese Biomaterialien sind sehr einfach sowohl in der Makro-und Mikro-Architektur, diemöglicherweise nicht ideal sein, wenn Gewebezüchtung Darm ist klinisch übersetzt werden. Eine optimale Biomaterial für den Darm sollte eine angeborene Gefäßbaum, die der Host-Blutversorgung, einer abgestuften Rohrwand mit unterschiedlichen Eigenschaften, die Schichten der Darmwand zu reflektieren und einer Zotten-crypt-Achse auf der luminalen Seite verbunden werden können, um mit Hilfe haben Wiederbesiedlung von epithelialen Stammzellen. Dezellularisierung ist eine neuartige Methode, die Gerüste produziert, indem sie Zellen aus Voll Organe unter Wahrung ihrer ursprünglichen Architektur 14. Dies ist bevorzugt, um bereits bestehende Gerüste, da sie nicht nur die Struktur des Organs zu replizieren, sondern auch enthalten chemische Signale in der extrazellulären Matrix (ECM), dass die Hilfe zelluläre Proliferation und Differenzierung eingebettet. Im Jahr 2008 wurde ein Leichenluftröhre dezellularisiert 14, mit patienteneigenen Zellen besiedelt und transplantiert werden, um die wichtigsten linken Bronchus bei einem jungen Mann zu ersetzen <sup&gt; 3. Seitdem haben eine Reihe von Gruppen die Produktion von dezellularisiertes Gerüste für das Herz 15, Leber 16,17 und Lunge 18-20 in kleinen und großen Tieren berichtet. Wir haben auch die gleiche Methode, um eine kleine Darm dezellularisiertes Gerüst 21 produzieren angepasst. Das Ziel der hierin beschriebenen Verfahren ist die dezellularisierte Darm Matrizen, die die makroskopischen Eigenschaften des ursprünglichen Gewebes, wie die Blutzufuhr als auch die mikroskopische Architektur der Zotten-Kryptenachse im Darmlumen aufrechtzuerhalten erzeugen. Wir glauben, dass diese Methode könnte letztlich für andere Organe angenommen, um die Effizienz der Dezellularisierung verbessern.

<table><tbody><tr><td>Ethanollösung, 70% in H20</td><td>Sigma</td><td>02877</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalztabletten</td><td>Sigma</td><td>79382</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotische Antimykotische Lösung (100x)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Reizend für Oral und Augen; Gebrauchsschutz</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr></tbody></table>

ein dezellularisierung methodik für die herstellung von naturdarm azelluläre matrix

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Erfolgreicher Gewebetechnik beinhaltet die Kombination von Gerüsten mit den entsprechenden Zellen in vitro oder in vivo. Gerüste können synthetisch, natürlich gewonnenen oder aus Geweben / Organen abgeleitet ist. Letztere werden unter Verwendung einer Technik, die Dezellularisierung erhalten. Dezellularisierung kann es sich um eine Kombination von physikalischen, chemischen und enzymatischen Methoden. Das Ziel dieser Technik ist es, alle zellulären Spuren unter Beibehaltung der Makro-und Mikroarchitektur des ursprünglichen Gewebes zu entfernen. Darmgewebetechnik bisher verwendeten relativ einfache Gerüste, die die komplexe Architektur der nativen Organ nicht replizieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit ist es, eine effiziente Technik zur Dezellularisierung Rattendünndarms zu beschreiben. Die Isolierung des Dünndarms, um die Aufrechterhaltung einer Gefäßverbindung sicherzustellen beschrieben. Die Kombination von chemischen und enzymatischen Lösungen, um die Zellen zu entfernen whilst Erhaltung der Zotten-crypt-Achse in der luminalen Aspekt des Gerüsts wird auch eingestellt. Schließlich Beurteilung der hergestellten Gerüste für entsprechende Eigenschaften wird diskutiert.

Nach erfolgreicher Dezellularisierung (Fig. 1) ist das Gerüst eine makroskopische Aussehen ähnlich dem des nativen Darm, aber mit durchlässige Wände (2A). Die Erhaltung der Makro-Architektur sollte auch klar sein, von der Durchgängigkeit der Gefäßbaum. Wenn Farbstoff wird durch die Kanüle injiziert SMA sollte gleichmäßig im Gerüst verteilt und erreichen die kapillare Struktur (2B). Das Gerüst sollte frei von Kern-und Zytoplasma-Material, etwas, das mit Hilfe eines DNA-Quantifizierung Kit und einfache histologische Analyse beurteilt werden kann. Hämatoxylin und Eosin-Färbung (H &amp; E) sollte die Abwesenheit von Kern-und Zytoplasma-Material unter Wahrung der Dünndarmschichten (3A) zu demonstrieren. Insbesondere sollte die Wartung der Zotten und Krypten auf der luminalen Seite ersichtlich ist folgende Rasterelektronenmikroskopie (Abbildung 4). AErhaltung der extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagen, Elastin und Glycosaminoglycane auch erwartet werden. Zum Beispiel Masson Trichrom-Färbung zeigt intakte Bindegewebe im Gerüst (Abbildung 3B). <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. . Versuchsplan Timeline der Dezellularisierung Verfahrens; PBS / AA: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Antibiotika-Antimykotikum, NaDeoxy: Natriumdeoxycholat, RT: Raumtemperatur, DNAse-I: Desoxyribonuclease-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> 2. Gerüst makroskopischmakroskopische Aussehen des Rattendünndarms nach erfolgreicher Dezellularisierung (A) c Eigenschaften.. Die Injektion von Farbstoff Ponceau Rosso durch die SMA zeigt eine intakte Gefäßnetz (B); SMA: A. mesenterica superior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> 3. . Histologie H &amp; E (A) und MT (B) Färbung zeigen die Abwesenheit von Zellmaterial mit der Erhaltung des Bindegewebes Architektur, H &amp; E: Hämatoxylin und Eosin, MT: Masson Trichrom. Maßstab:. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . </p&gt; <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> 4. . Elektronenmikroskopie Rasterelektronenmikroskopie zeigt die erhaltenen Zotten-crypt Architektur in den Gerüst Lumen; Maßstabsbalken:. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Der Artikel beschreibt eine Methode für die Herstellung einer azellulären Matrix aus Rattendarm. Die Ableitung von Darm Gerüste ist wichtig für zukünftige Anwendungen im Tissue Engineering, Stammzellbiologie und Drogentests.

Ein Dezellularisierung Methodik für die Herstellung von Naturdarm Azelluläre Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein natürliches, azelluläres Gerüst für die intestinale Gewebeengineering zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Arteria mesenterica superior (SMA) einer Ratte katheterisiert und das Dünndarmgewebe zusammen mit dem vaskulären Zugang entnommen wird. Im zweiten Schritt werden die intraluminalen Bestandteile ausgespült und die intraluminalen sowie vaskulären Kanülen mit einer peristaltischen Pumpe verbunden.Anschließend wird der Dünndarm 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius mit entionisiertem Wasser perfundiert. Im letzten Schritt erfolgt die Perfusion des Dünndarms bei Raumtemperatur mit Natriumdeoxy, Coate und DNAs. Letztendlich können die vollständige Entzellularisierung des Dünndarms sowie seine Architektur und Bestandteile jeweils mittels Histologie und Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden.Wir stehen derzeit vor dem klinischen Problem des Darmversagens, einer verheerenden Erkrankung, die sowohl Kinder als auch Erwachsene betrifft. Die parenterale Ernährung und die herkömmliche Transplantation bieten keine vollständige Heilung. Die Herstellung dreidimensionaler, vaskularisierter Darmgerüste, wie im folgenden Video gezeigt, stellt einen Schritt in Richtung einer Therapie des Darmversagens dar.Was an dieser Technik bemerkenswert ist, ist die Tatsache, dass die Verwendung sanfter Dezellularisierungschemikalien die mikroskopische Architektur des Darms erhält, wie die Ergebnisse des Elektronenmikroskops zeigen. Zusätzlich ermöglicht die Erhaltung des hierarchischen vaskulären Netzwerks nach der Dezellularisierung die Besiedlung einer Struktur, die an den Wirtsorganismus angebunden werden kann. Blutversorgung: Beginnen Sie damit, eine peristaltische Pumpe mit zwei Schläuchen auszustatten, und leiten Sie anschließend 15 Minuten lang 70 %igen Ethanol mit maximaler Geschwindigkeit durch die Schläuche der peristaltischen Pumpe, gefolgt von frisch zubereiteter PBS AA für weitere 15 Minuten.Nach dem Spülen des Pumpsprays, desinfizieren Sie den Bauch einer euthanasierten Sprague-Dawley-Ratte mit einem Gewicht von 250 bis 350 Gramm mit 70 %igem Ethanol. Führen Sie dann mit sterilen, autoklavierten chirurgischen Instrumenten einen XO-sförmigen, über dem Schambein liegenden Laparotomieschnitt am Bauch durch, um ein freies Operationsfeld zu schaffen. Entfernen Sie den Dünndarm und legen Sie ihn auf die rechte Seite des Tieres auf ein mit 70 %igem Ethanol besprühtes Papierhandtuch. Achten Sie darauf, den Darm kontinuierlich mit PBSAA zu benetzen, um eine Austrocknung des Gewebes und eine Denaturierung der extrazellulären Matrix zu vermeiden.Als Nächstes lokalisieren Sie die Arteria mesenterica superior (SMA), die im 90-Grad-Winkel zur Aorta in Richtung Darm entspringt. Führen Sie einen Faden um die SMA und bereiten Sie einen Knoten vor. Verwenden Sie eine 27-Gauge-Kanüle, um über die Aorta in die SMA einzudringen, und ziehen Sie die Nadel anschließend schnell zurück, um eine Beschädigung der Gefäßwand zu vermeiden.Nun führen Sie das Kunststoffrohr der Kanüle in die A. mesenterica superior (SMA) ein, sichern das Röhrchen mit Vicryl-5-0-Nähten und injizieren anschließend 10 Milliliter PBSAA, um die Kanülierung zu bestätigen. Schneiden Sie danach mit einer Schere die Aorta proximal und distal zur SMA auf, um die Kanüle freizulegen und so ein Austreten von Fäzes beim Herauspräparieren des Dickdarms zu vermeiden. Legen Sie einen Seiden-5-0-Nahtknoten am proximalen Ende der Ileozökalklappe und einen weiteren am distalen Ende des Sigma an. Durchtrennen Sie dann das terminale Ileum und den Kolon zwischen den beiden Knoten und entfernen Sie den Dickdarm.Schneiden Sie nun das Dünndarm an der Juno-duodenalen Verbindung durch und lösen Sie den Darm von eventuellen Bindegewebsverbindungen mit der Bauchhöhle. Überführen Sie den Dünndarm in eine Petrischale mit PBS aa. Verwenden Sie dann eine Kunststoff-Heberpipette, um den proximalen Abschnitt des Darms zu kanülieren, und fixieren Sie ihn mit Nähten an Ort und Stelle.Schneiden Sie schließlich die Pipette so zurecht, dass sie in die Lure-Verschlussvorrichtung einer 60-Milliliter-Spritze passt, und spülen Sie das intestinale Lumen mit zwei Portionen von jeweils 60 Milliliter P-B-S-A-A aus, um Fäzes und Ablagerungen zu entfernen. Stellen Sie vor Beginn des Dekellularisierungsprozesses sicher, dass sich keine Blasen im intestinalen Lumen und in den vaskulären Kanülen befinden. Verbinden Sie anschließend einen Dreiweg-Hahn mit der vaskulären Kanüle und stellen Sie die Petrischale in einen Auffangbehälter, um überschüssige Flüssigkeit aufzufangen. Danach beginnen Sie, deionisiertes Wasser mit einer Geschwindigkeit von 0,6 Millilitern pro Stunde durch die Masterflex LS-Regelpumpe mit variabler Geschwindigkeit fließen zu lassen.Behandeln Sie das Gewebe vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Luftblasen am distalen Ende austreten. Sobald alle Blasen aus den Kanülen entfernt wurden, bringen Sie die Apparatur in den Kühlraum. Beginnen Sie dann den Dekellularisierungsprozess, indem Sie sowohl das intestinale Lumen als auch den vaskulären Baum 24 Stunden lang mit fließendem deionisiertem Wasser bei 0,6 Milliliter pro Stunde während der ersten Stunde perfundieren.Überprüfen Sie das Gerät regelmäßig, um sicherzustellen, dass alle Verbindungen fest sitzen. Es tritt minimales Austreten auf und es sind keine Bläschen im Darm vorhanden. Nach 24 Stunden bringen Sie die Entzellularisierungsapparatur wieder auf Raumtemperatur.Die Farbe des Darms sollte sich unter einer Absaughaube zu einem hellen Rosa verändert haben. Geben Sie ausreichend Natriumdesoxycholat ab, um eine 4%ige Lösung in 300 Milliliter entionisiertem Wasser herzustellen. Mischen Sie die Lösung mit einem Vortex, bis sie klar ist.Ersetzen Sie nun die deionisierte Lösung durch Natrium-Deoxycholat. Überprüfen Sie die Anschlüsse. Entfernen Sie eventuelle Blasen und perfundieren Sie den Dünndarm vier Stunden lang mit 0,6 Milliliter pro Stunde.Nach dem Natrium-Deoxycholat-Schritt wird das Gewebe transparent. Die Erhaltung des vaskulären Netzwerks wird ebenfalls deutlich, nachdem PBS AA zur Pumpe hinzugefügt wurde. Waschen Sie den Darm 30 Minuten lang mit PBS AA, um Wechselwirkungen zwischen Natriumdeoxycholat und DNA zu vermeiden.Danach das Gewebe mit frisch zubereiteter DNA bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 0,6 Millilitern pro Stunde durchströmen lassen. Nach drei Stunden das Gerüst in eine Gewebekulturhaube überführen und unter aseptischen Bedingungen die Platte wechseln. Die Schläuche der peristaltischen Pumpe erneut sterilisieren, indem Ethanol hindurchgeleitet wird.Das Darmgewebe ein letztes Mal 30 Minuten lang mit P-B-S-A-A waschen, um sicherzustellen, dass alle Reste der Entzellularisierungslösungen entfernt sind. Abschließend das Gerüst in einen UV-Vernetzer überführen und zwei Sterilisationszyklen durchführen. Danach das Gerüst in P-B-S-A-A aufbewahren.Alle drei Tage wird die Lösung gewechselt. Nach erfolgreicher Entzellularisierung sollte das Gerüst ein makroskopisches Erscheinungsbild aufweisen, das dem des nativen Darms ähnelt, jedoch mit durchscheinenden Wänden. Die Erhaltung der Makroarchitektur sollte zudem an der Durchgängigkeit des Gefäßbaums erkennbar sein.Wenn Farbstoff über die SMA-Kanüle injiziert wird, sollte er sich gleichmäßig im gesamten Gerüst verteilen und den Kapillarbaum erreichen. Das Gerüst sollte frei von nukleären und zytoplasmatischen Bestandteilen sein, was beurteilt werden kann. Mithilfe eines DNA-Quantifizierungs-Kits und einer einfachen histologischen Analyse sollten die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung das Fehlen nukleärer und zytoplasmatischer Materialien nachweisen, wobei die Schichten des Dünndarms, wie in diesem Bild dargestellt, erhalten bleiben sollten.Insbesondere sollte die Erhaltung der Zotten und Krypten auf der luminalen Seite nach der Rasterelektronenmikroskopie erkennbar sein. Eine weitere Konservierung der Komponenten der extrazellulären Matrix wie Kollagen, Elastin und Glykoaminoglykane sollte ebenfalls erwartet werden, wie hier gezeigt. Beispielsweise ermöglicht die Masson-Trichrom-Färbung den Nachweis intakten Bindegewebes im Scaffold.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das natürliche zelluläre intestinale Gerüst herstellt.

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Forschung

JoVE Journal

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