Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat
11. September 2013
Erstellen experimentellen Netzhautablösungen mit einer reproduzierbaren und anhalt Höhe Ablösung, und ohne subretinalen Blutung, ist wichtig für die Erforschung der Pathophysiologie der Photorezeptorzellverlust in der Netzhauterkrankungen und Bewertung potenzieller therapeutischer Interventionen. Hier ist ein solches Verfahren im Detail beschreiben wir.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, experimentelle Netzhautablösungen mit einer reproduzierbaren und anhaltenden Ablösungshöhe ohne subretinale Blutung zu erzeugen. Dies wird durch die erste Inci, die temporale Bindehaut am hinteren Limbus, erreicht, um die Bindehaut von der Sklera zu trennen. Im zweiten Schritt wird die Spitze einer 30-Gauge-Nadel verwendet, um einen selbstverschließenden Skleralschnitt und eine Hornhautpunktion durchzuführen.
Als nächstes wird Natriumurinat in den subretinalen Raum injiziert, um die neurosensorische Netzhaut vom darunter liegenden retinalen Pigmentepithel zu lösen. Im letzten Schritt wird Cyanacrylatkleber auf die Sklerallunde aufgetragen und die Bindehaut wieder in ihrer ursprünglichen Position befestigt, wodurch das Risiko eines Austretens von Natriumhallurin verringert wird. Abschließend wird der Fundus mit Hilfe eines Deckglases untersucht, um die Entstehung einer Bolus-Netzhautablösung ohne subretinale Blutung zu bestätigen.
Bestehende Methoden zur Verringerung der Netzhautablösung bei Nagetieren können zu einer Variabilität in der Höhe und Persistenz der Netzhautablösung führen, was zu inkonsistenten Zelltodraten führt. Mit dieser Technik kann eine reproduzierbare bullöse und persistierende Netzhautablösung mit einem reduzierten Risiko für subretinale Hämorrhoiden erzeugt werden, was ein zuverlässiges Modell der Netzhautablösung bei Nagetieren ermöglicht. Die experimentelle Netzhautablösung bei Nagetieren ist relativ einfach durchzuführen, hat einen angemessenen Zeitverlauf und ist der menschlichen Krankheit sehr ähnlich.
Es ist also ein großartiges Modell für die Untersuchung von Mechanismen des Photorezeptor-Zelltods und Therapien zur Verhinderung von Sehverlust. Bei degenerativen Erkrankungen der Netzhaut ist es vorteilhaft, eine reproduzierbare Ablösung ohne subretinale Blutung zu erzeugen. Dies liegt daran, dass die verlängerte Dauer der Netzhautablösung oder das Auftreten einer subretinalen Blutung den Zelltod der Photorezeptoren beeinflussen kann.
Nach der Betäubung einer acht Wochen alten Maus trimmen Sie die Schnurrhaare des Tieres und erweitern Sie die Pupille mit einer Lösung, die 5 % Phenylrinen und 0,5 % Tropic enthält, unter einem Operationsmikroskop. Schneiden Sie die tierische Clia ab, tragen Sie eine topische Anästhesie, 0,5% Propanhydrochlorid ophthalmische Lösung, auf. Platzieren Sie die Maus in einer seitlichen Position mit der Nase in Richtung des Chirurgen und schneiden Sie dann die Schläfenbindehaut am hinteren Limbus an, indem Sie die Bindehaut mit einer Zange von der Sklera trennen.
Fassen Sie die Bindehaut am Limbus, um das Auge zu kontrollieren. Halten Sie dann eine 30-Gauge-Nadel mit einer Fase nach oben. Mache mit der Spitze der Nadel einen Tunnel durch die Sklera und dringe die Sklera in die Aderhaut ein, ohne die Netzhaut zu durchdringen.
Halten Sie dann die 30-Gauge-Nadel parallel zur Iris und punktieren Sie die Hornhaut, um den Augeninnendruck zu senken. Zeigen Sie nun die Fase nach unten. Führen Sie eine 33-Gauge-Nadel, die mit einer 10-Mikroliter-Spritze von Hamilton verbunden ist, in den subretinalen Raum ein und injizieren Sie 3,5 Mikroliter Natriumurinat.
Dadurch werden etwa 50 % der neurosensorischen Netzhaut vom darunter liegenden retinalen Pigmentepithel abgelöst. Schieben Sie die Hornhaut mit einer Pinzette um die Hornhautpunktion, damit das Kammerwasser aus der Hornhautpunktion fließen kann, und verwenden Sie dann einen chirurgischen Zellulosespeer, um zu bestätigen, dass aus der Skleralwunde kein Leck vorhanden ist, um das Risiko eines Natriumurinataustritts zu verringern. Geben Sie Cyanacrylatkleber auf die Sklerallunde und befestigen Sie dann die Bindehaut wieder an ihrer ursprünglichen Position.
Verwenden Sie ein Deckglas, um den Fundus zu kontrollieren und die Entstehung einer Bolus-Netzhautablösung ohne subretinale Blutung zu bestätigen. Tragen Sie zum Schluss eine antibiotische Salbe auf das Auge auf, um das Infektionsrisiko zu verringern. Bewahren Sie die Maus auf einem Heizkissen auf, um eine niedrige Körpertemperatur zu vermeiden.
Nach niedrigem Blutdruck. Bringen Sie das Tier zurück in seinen Käfig, nachdem es aus der Narkose erwacht ist. Um die Persistenz der Netzhautablösung durch dieses Protokoll zu beurteilen, wurden an den Tagen drei, sieben und 14 nach Einleitung der Ablösung Kryoschnitte durchgeführt.
Für jeden Zeitpunkt wurden sechs Augen verwendet, Hämatin und Eosin. Die Färbung wurde verwendet, um die Schnitte sichtbar zu machen, die jeweils einen Bolus zeigten. Netzhautablösung in Annäherung an die Linse.
Keine Augen zeigten Anzeichen einer Infektion oder Linsenverletzung. Sobald diese Operation gemeistert ist, kann sie in etwa fünf Minuten durchgeführt werden. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, jeden Schritt sanft durchzuführen, um ein Austreten von Natrium, eine stark beleuchtete subretinale Blutung oder eine Linsenverletzung zu vermeiden, die sich auf den Zelltod des Rezeptors in der abgelösten Netzhaut auswirken können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine experimentelle Netzhautablösung bei Nagetieren mit einer reproduzierbaren und anhaltenden Ablösungshöhe ohne subretinale Blutung erstellt.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Erzeugung experimenteller Netzhautablösungen bei Nagetieren vor, die eine reproduzierbare und anhaltende Höhe ohne subretinale Blutung erreichen. Diese Technik ist entscheidend für die Untersuchung des Verlusts von Photorezeptorzellen bei Netzhauterkrankungen und die Bewertung potenzieller Therapien.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Augenheilkunde
- Experimentelle Biologie
Hintergrund
- Netzhautablösungen sind wichtig für die Erforschung von Netzhauterkrankungen.
- Bestehende Methoden können zu Variabilität bei der Ablösungshöhe und -dauer führen.
- Eine subretinale Blutung kann die Beurteilung des Photorezeptorzellsterbens erschweren.
- Für konsistente Forschungsergebnisse wird ein zuverlässiges Modell benötigt.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer reproduzierbaren Methode zur Erzeugung von Netzhautablösungen.
- Minimierung des Risikos einer subretinalen Blutung während des Eingriffs.
- Schaffung eines zuverlässigen Modells zur Untersuchung des Absterbens von Photorezeptorzellen und potenzieller Therapien.
Verwendete Methoden
- Einchnitt der temporalen Bindehaut am hinteren Limbus.
- Erstellung eines selbstabdichtenden skleralen Schnitts und einer kornealen Punktion.
- Injektion von Natriumurat in den subretinalen Raum.
- Aufbringung von Cyanoacrylat-Kleber zur Sicherung der skleralen Wunde.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung bullöser Netzhautablösungen ohne Blutung.
- Höhe und Persistenz der Ablösung waren über alle Versuche hinweg konsistent.
- Es wurden keine Anzeichen einer Infektion oder Linsenverletzung nach dem Eingriff beobachtet.
- Die Methode kann in etwa fünf Minuten durchgeführt werden.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik ermöglicht eine zuverlässige Modellierung der Netzhautablösung bei Nagetieren.
- Sie erleichtert die Untersuchung der Mechanismen, die dem Absterben von Photorezeptorzellen zugrunde liegen.
- Die Methode ist einfach und reproduzierbar, wodurch sie für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen geeignet ist.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Erstellung reproduzierbarer Netzhautablösungsmodelle ohne störende Blutung ist entscheidend, um Zielvalidierungen bei degenerativen Netzhauterkrankungen risikoärmer zu gestalten. Diese Methode ermöglicht mechanistische Untersuchungen zum Photorezeptorzelluntergang und erlaubt eine konsistente Bewertung therapeutischer Interventionen in präklinischen Abläufen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem ein kontrolliertes Modell der Netzhautablösung bereitgestellt wird, um die überlebensfähigen Photorezeptoren in spezifischen Signalwegen zu bewerten.
- Operativer Wert: Verringert die biologische Variabilität durch Blutungen oder ungleichmäßige Ablösungshöhe und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem zuverlässige Vergleiche von Substanzen ermöglicht werden, die auf die durch Ablösung verursachte Degeneration abzielen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare histologische Endpunkte (z. B. Dicke der Photorezeptorschicht mittels Kryoschnittfärbung) für die Dosis-Wirkungs-Analyse.
- Operativer Wert: Standardisierte chirurgische Schritte (selbstabdichtende Inzision, Kleberauftrag) verbessern die Bereitschaft des Assays und verringern die Rate an Verfahrensfehlern.
- Skalierbarkeit: Kurze Dauer des Eingriffs (~5 Minuten) und geringer Ausrüstungsbedarf ermöglichen Hochdurchsatz-Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert die Pathophysiologie der rhegmatogenen Ablation, diabetischen Retinopathie und der altersbedingten Makuladegeneration, bei denen die Ansammlung von subretinalem Flüssigkeit die Degeneration vorantreibt.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die longitudinale Beurteilung der Dauer der Ablation (Tage 3, 7, 14), um klinischen Progressionszeitfenstern nachzubilden.
- Mechanistische Entlastung von Störgrößen: Trennt den Photorezeptorverlust von hämorrhagischen Störgrößen, wodurch die Zuverlässigkeit von Ergebnissen zur Zielstrukturenbindung verbessert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Modell fügt sich nahtlos in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase ein, unterstützt die Hypothesenprüfung in der frühen Entdeckungsphase und liefert quantitative histologische Auswertungen für die Optimierung von Leitstrukturen und die präklinische Validierung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem gezielte Induktion einer Netzhautablösung ermöglicht wird, um nachgeschaltete degenerative Prozesse zu untersuchen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Gewebeergebnisse (z. B. H&E-gefärbte Schnitte) zum Vergleich therapeutischer Wirkungen unter verschiedenen Bedingungen.
- Analytik: Erzeugt messbare strukturelle Endpunkte (Ablösungshöhe, Persistenz), die den statistischen Vergleich der Wirksamkeit von Interventionen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Anbindung an die präklinische Validierung durch zeitlich gesteuerte Beurteilung des Fortschritts der Ablösung und histologischer Ergebnisse, die für menschliche RD-Krankheitsbilder relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Der standardisierte chirurgische Protokollablauf erlaubt die Übernahme an verschiedenen Standorten als wiederverwendbare Plattform für das Screening von Netzhautdegenerationen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem biologisches Rauschen durch Blutung und variable Ablösungsdynamik minimiert wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Schnitt- und Versiegelungstechniken und verringert so die Variabilität zwischen Anwendern.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, indem zuverlässige Wirksamkeitssignale in Degenerationsmodellen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Therapeutika auf Grundlage konsistenter Daten zur Photorezeptorüberlebensrate.
Durchführungsaspekte
- Erfordert mikrochirurgische Fachkenntnisse in der ophthalmologischen Behandlung von Nagetieren und im Umgang mit Gewebe.
- Abhängig von mikrochirurgischen Instrumenten (30G/33G-Nadeln, Pinzette, chirurgische Spitze) sowie Klebstoffen (Cyanoacrylat-Kleber).
- Setzt eine Standardisierung des Injektionsvolumens (3,5 µL Natriumhyaluronat) und eine einheitliche postoperative Überwachung über verschiedene Teams hinweg voraus.
- Die Anpassung an größere眼-Modelle könnte eine Modifizierung der Nadelstärke und des Injektionsvolumens erfordern, wobei die Prinzipien der selbstabdichtenden Technik beibehalten werden müssen.
- Eingeschränkt durch die Fähigkeiten des Operateurs, eine Aderhautblutung während des Skleradurchbruchs zu vermeiden, wobei die Einschnürung mittels der Spitze das Risiko verringert.
