Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, experimentelle Netzhautablösungen mit einer reproduzierbaren und anhaltenden Ablösungshöhe ohne subretinale Blutung zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die temporale Bindehaut am hinteren Limbus eingeschnitten wird, um die Bindehaut von der Sklera zu lösen. Im zweiten Schritt wird die Spitze einer 30-Gauge-Nadel verwendet, um einen selbstversiegelnden skleralen Schnitt und eine Hornhautpunktion anzulegen.

Anschließend wird Natrium-Urinit in den subretinalen Raum injiziert, um die neurosensorische Retina vom darunterliegenden retinalen Pigmentepithel zu lösen. Im letzten Schritt wird Cyanoacrylat-Kleber auf die sklerale Wunde aufgebracht und die Bindehaut wieder in ihre ursprüngliche Position zurückverlegt, wodurch das Risiko eines Leckens von Natrium-Hall-Urinit verringert wird. Abschließend wird der Fundus mithilfe eines Deckgläschens untersucht, um die Entstehung einer bolusförmigen Netzhautablösung ohne subretinale Blutung zu bestätigen.

Bestehende Methoden zur Verringerung der Netzhautablösung bei Nagetieren können zu einer Variabilität in Höhe und Dauerhaftigkeit der Netzhautablösung führen, was zu inkonsistenten Messungen der Zelltodraten führt. Mit dieser Technik können reproduzierbare bullöse und persistierende Netzhautablösungen mit einem verringerten Risiko für subretinale Hämorrhoiden erzeugt werden, was ein zuverlässiges Modell der Netzhautablösung bei Nagetieren ermöglicht. Die experimentelle Netzhautablösung bei Nagetieren ist relativ einfach durchzuführen, weist einen angemessenen zeitlichen Verlauf auf und ähnelt stark der menschlichen Erkrankung.

Daher eignet es sich hervorragend als Modell zur Untersuchung der Mechanismen des Photorezeptorzelltods sowie von Therapien zur Verhinderung des Sehverlusts. Bei degenerativen Netzhauterkrankungen weiß man, dass die variierende Photorezeptorzellsterblichkeit in der abgelösten Netzhaut dazu führt, dass es vorteilhaft ist, eine reproduzierbare Ablösung ohne subretinale Blutung zu erzeugen. Der Grund hierfür ist, dass eine verlängerte Dauer der Netzhautablösung oder das Auftreten einer subretinalen Blutung den Photorezeptorzelltod beeinflussen können.

Nach der Anästhesie eines acht Wochen alten Mäuschen schneiden Sie die Vibrissen des Tieres, weiten dann die Pupille mit einer Lösung, die 5 % Phenylephrin und 0,5 % Tropikamid enthält, unter einem Operationsmikroskop. Schneiden Sie die Konjunktiva des Tieres, applizieren Sie eine topische Anästhesie mit einer 0,5 %igen Prokainhydrochlorid-Augenlösung. Legen Sie die Maus in Seitenlage mit der Nase zum Chirurgen hin und schneiden Sie anschließend die temporale Konjunktiva am hinteren Limbus ein, wobei Sie die Konjunktiva mit einer Pinzette von der Sklera lösen.

Greifen Sie die Bindehaut am Limbus an, um das Auge zu fixieren. Halten Sie dann eine Nadel mit 30 Gauge, wobei die Schräge nach oben zeigt. Verwenden Sie die Nadelspitze, um einen Tunnel durch die Sklera zu bilden, indem Sie die Sklera durchdringen und in die Aderhaut eindringen, ohne die Netzhaut zu verletzen.

Als Nächstes halten Sie die Nadel mit 30 Gauge parallel zur Iris und punktieren die Hornhaut, um den intraokularen Druck zu senken. Dabei zeigen Sie die Schräge nach unten. Führen Sie eine 33-Gauge-Nadel, die mit einer Hamilton-Spritze von 10 Mikroliter verbunden ist, in den subretinalen Raum ein und injizieren 3,5 Mikroliter Natriumurat.

Dadurch wird etwa 50 % der neurosensorischen Netzhaut von dem darunterliegenden retinalen Pigmentepithel gelöst. Mit einer Pinzette die Hornhaut um die Hornhautpunktion herum verschieben, um das Austreten des Kammerwassers durch die Hornhautpunktion zu ermöglichen, und anschließend einen chirurgischen Zellulosespieß verwenden, um das Fehlen einer Flüssigkeitsaustritts aus der skleralen Wunde zu bestätigen, um so das Risiko eines Austritts von Natriumurat zu verringern. Cyanoacrylat-Kleber auf die sklerale Wunde auftragen und dann die Bindehaut wieder an ihre ursprüngliche Position anheften.

Verwenden Sie ein Deckglas, um den Augenhintergrund zu überprüfen und die Bildung einer bolusförmigen Netzhautablösung ohne subretinale Blutung zu bestätigen. Tragen Sie abschließend einen antibiotischen Augensalbe auf, um das Infektionsrisiko zu verringern. Halten Sie die Maus auf einer Wärmematte, um eine Untertemperatur des Körpers zu verhindern.

Im Anschluss an eine niedrige Blutdruckphase. Bringen Sie das Tier zurück in seinen Käfig, nachdem es aus der Narkose erwacht ist. Um die Persistenz der durch dieses Protokoll erzeugten Netzhautablösung zu beurteilen, wurden Kryoschnitte am dritten, siebten und 14. Tag nach der Induktion der Ablösung angefertigt.

Sechs Augen wurden für jeden Zeitpunkt verwendet, Hämatoxylin und Eosin. Die Färbung diente der Sichtbarmachung der Schnitte, von denen jeder einen Bolus zeigte. Netzhautablösung, die sich der Linse nähert.

Es zeigte sich kein Anzeichen einer Infektion oder einer Linsenverletzung. Wenn die Operation einmal beherrscht ist, kann sie in etwa fünf Minuten durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, jeden Schritt vorsichtig auszuführen, um ein Austreten von Natrium, eine starke Beleuchtung, eine subretinale Blutung oder eine Linsenverletzung zu vermeiden, da all diese Faktoren den Zelltod von Rezeptorzellen in der abgelösten Netzhaut beeinflussen können. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine experimentelle Netzhautablösung bei Nagetieren mit einer reproduzierbaren und dauerhaften Ablöshöhe ohne subretinale Blutung erzeugt.