Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine große Anzahl von einheitlich größenkontrollierten Tumorsphäroiden zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Mikrotiterplatten vorbereitet werden, um die Zellen zu gruppieren, die zu Steroiden geformt werden sollen. In einem zweiten Schritt wird eine Kultur des gewünschten Zelltyps geerntet, die die Zellsuspension liefert, die die Größe und Zusammensetzung der OIDs bestimmt.

Die Zellsuspension wird dann in die Mikrovertiefungen zentrifugiert und inkubiert, damit sich nach der Inkubation Steroide bilden können. Die resultierenden Steroide sind sehr gleichmäßig und können in den Mikrovertiefungen, in denen sie gebildet wurden, gesammelt oder kultiviert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Verfahren besteht darin, dass sehr große Mengen gleichförmiger Zuschlagstoffe gleichzeitig hergestellt werden können.

Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können feststellen, dass ihr Kraftstoff sehr groß ist. Es ist darauf zu achten, dass die Zellsuspension gleichmäßig über die Platte verteilt ist und dass sich die schwingenden Plattenträger in der zentralen Fuge frei bewegen, so dass die Kraft senkrecht zur Oberfläche steht. Bereiten Sie zunächst eine sterile Agro Well 400-Platte vor, indem Sie 0,5 Milliliter tensidhaltige Spüllösung in jede Vertiefung geben.

Die Verwendung von Tensid stellt sicher, dass die Zellen nicht mit der Mikrowell-Oberfläche interagieren. Um zu vermeiden, dass Luftblasen in den Mikrovertiefungen eingeschlossen werden, fügen Sie Flüssigkeit an einer Seite hinzu und lassen Sie sie über die Oberfläche verteilen, anstatt sie vertikal auf die Oberfläche fallen zu lassen. Nachdem Sie die Lösung in die Vertiefungen gegeben haben, setzen Sie den Deckel wieder auf.

Stellen Sie sicher, dass der Rotor richtig ausbalanciert ist, bevor Sie die Platten zwei Minuten lang mit dem 2000-fachen zentrifugieren, G.To entfernen Sie Blasen mit einem inversen Mikroskop mit geringer Vergrößerung und stellen Sie sicher, dass die Blasen aus den Mikrovertiefungen entfernt wurden. Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang mit geschlossenem Deckel bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Saugen Sie die Spüllösung aus den Vertiefungen ab und waschen Sie die Platte unmittelbar vor der Verwendung mit sterilem Wasser oder PBS.

Lassen Sie die Platten nach dem Codieren nicht austrocknen. Die Details der Zellvorbereitung variieren je nach untersuchtem Zelltyp. Wir haben jedoch beobachtet, dass dieser Zustand für ein breites Spektrum von Zellen wirksam ist, einschließlich der Linien, die wir hier besprochen haben, sowie für embryonale Stammzellen von Menschen und Neuronen, humane induzierte pluripotente Stammzellen, Fibroblasten, putative, primitive Endo- und Stromazellen. Um Zellen vorzubereiten, beginnen Sie mit dem T-75-Kolben mit HT-29-Zellen.

Das Wachstumsmedium wird aus dem Kolben abgesaugt und drei Milliliter Trypsin zugegeben. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie die Trypsinverdauung, indem Sie drei Milliliter Wachstumsmedium hinzufügen.

Den Rest in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen. Nehmen Sie dann aus einem 15-Milliliter-Röhrchen ein Aliquot für die Zellzählung. Die Zellen werden während der Zentrifugation fünf Minuten lang bei 200 G zentrifugiert.

Zählen Sie die Zellen. Aspirieren Sie anschließend die Tryin-Medium-Mischung und ersetzen Sie sie durch frisches Wachstum. Medium in einem Volumen, das durch die zuvor berechnete erforderliche Zelldichte bestimmt wird, wie im Textprotokoll als optionaler Schritt beschrieben.

Die Zellsuspension durch ein Sieb passieren, um eventuelle Klumpen zu entfernen. Sphäroide können, können in einer Vielzahl von Mediumformulierungen erzeugt werden, jedoch sollten erste Versuche unter Verwendung des Mediums durchgeführt werden, in dem die Zellen kultiviert wurden. Um die Folgen des Übergangs zu einem dreidimensionalen Kultursystem von den Folgen einer veränderten Medienzusammensetzung zu unterscheiden, beginnen Sie mit der Zugabe von 0,4 Millilitern Wachstumsmedium zu jeder Well-Zentrifuge für zwei Minuten im 2000-fachen G.To entfernen Sie Blasen mit einem inversen Mikroskop mit geringer Vergrößerung und stellen Sie sicher, dass die Blasen aus den Mikrowells entfernt wurden.

Geben Sie anschließend 0,4 Milliliter Zellsuspension mit der erforderlichen Dichte in die Mikrovertiefungen. Mischen Sie dann vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen in die Mikrovertiefungen einzuführen, und stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung verteilt sind. Um konsistente Steroide zu erhalten.

Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 200 Mal. G muss die Platte sowohl intern als auch gegen die andere Platte ausbalanciert werden, damit das Gewicht gleichmäßig auf beide Seiten des Plattenträgers verteilt wird. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Platte während der Zentrifugation selbst nivelliert, so dass keine Konvektionsströme entstehen und zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Zellen über die Mikrovertiefungen führen.

Überprüfen Sie mit einem inversen Mikroskop, ob sich die Zellen in den Mikrovertiefungen angesammelt haben und dass sie gleichmäßig über die Vertiefung verteilt sind, bevor Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Beobachten Sie den Prozess der Sphäroidbildung mit einem inversen Mikroskop. Einige Zelllinien bilden innerhalb von 24 Stunden kompakte Steroide.

Andere können auch länger brauchen. Hier ist der Verlauf vom Cluster zum Aggregat in HT 29-Zellen dargestellt. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, die Intex-Steroide herauszunehmen, ohne die Strukturen zu stören. Um Steroide aus Mikrovertiefungen zu extrahieren, pipettieren Sie sehr vorsichtig auf und ab, um die Sphäroide aus den Mikrovertiefungen herauskommen zu lassen.

Kippen Sie dann die Platte, um das mittlere Steroidgemisch abzusaugen. Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiter Öffnung für größere Steroide, um eine Zersetzung des Steroids zu vermeiden. Nachdem Sie das Steroid aus den Mikrovertiefungen gewonnen haben, übertragen Sie es in die Suspensionskultur, indem Sie es vorsichtig mit einer Pipette herausspritzen.

Alternativ kann die schwere Rose während des Anfalls mit einem mittleren Ersatz aufrechterhalten werden. Die Dauer hängt von der Anfangsgröße und der Wachstumsrate ab, die die Zeit definiert, bis sie aus den Mikrovertiefungen herauswachsen. Nun, sie wurden gebildet, um das Medium zu ersetzen, ohne Steroide zu verlieren.

Saugen Sie das Medium am Rand der Vertiefung an. Führe die Spitze mit einer Weidepipette langsam nach unten, bis sie anfängt, Flüssigkeit aus dem Meniskus zu ziehen, und folge dem Meniskus nach unten, während er nach unten fällt. Geben Sie dann frisches Medium gegen die Wellwand an der gleichen Stelle.

Denken Sie beim Hinzufügen des frischen Mediums daran, die Pipette vorsichtig zu drücken und die Spitze an die Wand zu halten, um eine Störung der PHE in den Mikrovertiefungen zu vermeiden. Ein paar Steroide können verloren gehen. Wenn jedoch immer Medium angesaugt und in der gleichen Position ausgetauscht wird, bleibt diese Zahl klein.

Im Vergleich zu den großen Zahlen in der Vertiefung können Steroide aus mehreren Tumorlinien unterschiedlicher anatomischer Herkunft leicht in Suspension extrahiert werden. Die konsistente Größenkontrolle, die mit dieser Methode erreicht werden kann, wird hier mit hochgradig uniformierten Steroidpopulationen demonstriert. Unter jeder Bedingung bilden sich 700 oder 1.500 Zellen.

Deutliche Unterschiede im Verhalten sind auch sichtbar, wenn HT 29 Dickdarmkrebszellen und TE sechs Speiseröhrenkrebszellen dicht gepackte Steroide mit scharf definierten Grenzen bilden. Umgekehrt führen Lin-Cap-Prostatakrebszellen zu weniger kohärenten Steroiden mit unregelmäßigen Grenzen. Die stärkeren Schnittgrößen in den kohärenteren Aggregaten führten auch zu einem Zusammenbruch in eine symmetrischere Form, selbst noch in den Mikrotöpfen, in denen sie gebildet wurden.

Die Lin-Cap-Aggregate, insbesondere bei der größeren Größe, behalten jedoch die quadratische Parametallgeometrie der Mikrovertiefungen sichtbar bei. Einmal gemeistert, kann dieser Prozess in etwa einer Stunde plus Inkubationszeit durchgeführt werden, die erforderlich ist, damit die Zellen adhäsieren und Flüssigkeiten herstellen können. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass eine andere Blasen durch die Mikrovertiefungen strömt, bevor Sie die Zellen hinzufügen.