Name: Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Lernen Sie die Herstellung großer Mengen einheitlicher Tumorsphäroide mit Microwell-Platten. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Bildung tausender uniformer Zellaggregate für Krebsforschung und Arzneimitteltests.

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Diese Arbeit wurde von der University of Calgary unter einem neuen Ermittler Gründungszuschuss Dr. Ungrin finanziert.

HINWEIS: Die Mikrotiterplatten werden in verschiedenen Formaten, je nach den gewünschten Ergebnissen. Spezifikationen sowie ungefähre Leitlinien für die minimale und maximale Anzahl von Zellen, die mit jedem Format verwendet werden soll, sind in Tabelle 1 gezeigt. Die kleineren Kavitäten verjüngen sich zu einer scharfen Spitze, und somit gibt es keine Größenbeschränkung niedriger, wenngleich Variabilität zwischen den Sphäroiden wird bei kleineren Größen mehr an Bedeutung. Routinemäßige Produktion von Sphäroiden von durchschnittlich weniger als 20 Zellen je 8 ist unkompliziert. Die größere Mikrowell-Größe ist nicht vollständig verjüngt, versucht daher zu Sphäroiden aus einer kleinen Anzahl von Zellen bilden können, in mehrere kleinere Kügelchen in jeder Vertiefung führen. Durch geringe Unterschiede in der Oberflächeneigenschaften, die Vorbereitung mit der Tensid-Lösung (Schritt 1.2) ist nicht optional, wenn Sie AggreWell 400Ex Platten. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung von AggreWell 400 Platten auf Basis - für andere Formate Nachteileult Tabelle 1. Die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung beladen ist, wird durch Multiplizieren der Anzahl der Vertiefungen und durch die Anzahl der Zellen, die für jeden Cluster-Sphäroid enthält bestimmt. Zum Beispiel, um Sphäroide von 1000 Zellen pro Stück zu erzeugen, muß jede Vertiefung (1.200 mal 1.000 Zellen Sphäroide jeweils =) 1,2 x 10 6 Zellen geladen werden. Gegeben, dass die Zellen in einem Volumen von 0,4 ml eingelegt werden muß Zelldichte berechnet werden. So zum Beispiel von Sphäroiden von jeweils 1000 Zellen gebildet wird, 1,2 x 10 6 Zellen in 0,4 ml entspricht einer Dichte von 3 × 10 6 Zellen pro ml enthält. 1. Vorbereiten Mikroschälchen in Zellen erhalten <ol><li> Microwell Platten sind steril, wie vorgesehen, und sollte nur aus der Verpackung in einer sterilen Umgebung wie einem Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank entfernt werden. Sterilität sollte in der gesamten Protokoll beibehalten werden. Die Sterilität beeinträchtigt werden, werden die Vertiefungen mit 70% Ethanol in Wasser unter Verwendung der erneut sterilisiertfolgenden optionalen Schritte. <ol><li> 0,5 ml 70% igem Ethanol zu jeder ungenutzte gut. Einige Mikrovertiefungen werden Lufteinschlüsse, obwohl dies kann durch Zugabe von Flüssigkeit auf der einen Seite, und ermöglicht es, über die Oberfläche verteilt, anstatt abzufallen senkrecht auf die Oberfläche reduziert werden. Deckel wieder. </li><li> Während Ethanoldampf sollte schnell alle Blasen durchdringen, wenn es eine große Anzahl kann es wünschenswert sein, sie zu entfernen. Zentrifuge für 2 min bei 2.000 x g. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Rotor korrekt mit dieser Geschwindigkeit ausgeglichen. </li><li> Mit einem Low-Vergrößerung inverse Mikroskop überprüfen Blasen aus den Kavitäten entfernt. </li><li> Inkubation für 5 min bei geschlossenem Deckel bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Ethanol. Platte kann nun mit sterilem Wasser oder PBS für die sofortige Verwendung gewaschen werden, oder für die Lagerung an der Luft getrocknet. </li></ol></li><li> Um zu gewährleisten, dass die Zellen nicht mit der Oberfläche wechselwirken Mikrotiterplatten, kann es unter Verwendung eines Tensids hergestellt werden. Im allgemeinen ist esempfiehlt sich, diesen Schritt selbst durchführen und anschließend vergleichen Sphäroiden mit und ohne Tensid-beschichtete Kavitäten erzeugt. <ol><li> In 0,5 ml Spüllösung in jede Vertiefung. Einige Mikrovertiefungen werden Lufteinschlüsse, obwohl dies kann durch Zugabe von Flüssigkeit auf der einen Seite, und ermöglicht es, über die Oberfläche verteilt, anstatt abzufallen senkrecht auf die Oberfläche reduziert werden. Deckel wieder. </li><li> Zentrifugieren für 2 min bei 2.000 × g, um Blasen zu entfernen. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Rotor korrekt mit dieser Geschwindigkeit ausgeglichen. </li><li> Mit einem Low-Vergrößerung inverse Mikroskop überprüfen Blasen aus den Kavitäten entfernt. </li><li> Inkubation für mindestens dreißig Minuten mit dem Deckel auf bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. Platten können bei vier Grad mit der Tensid-Lösung in die Vertiefungen erst benötigt, wenn ordnungsgemäß verschlossen austrocknen gespeichert werden. </li><li> Waschen Sie Platte mit sterilem Wasser oder PBS unmittelbar vor der Verwendung. Platten nicht zulassenAustrocknen nach der Beschichtung. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereiten Cells HINWEIS: Die Details der Zellpräparation wird etwas mit der spezifischen Zelltyp untersucht variieren. Allerdings haben wir diese Bedingungen beobachtet wirksam mit einer breiten Palette von Zellen, einschließlich der Linien hier diskutiert sowie humanen und murinen embryonalen Stammzellen (ESC), der Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), Fibroblasten, vermeintliche primitive Endoderm sein, und Stromazellen. Andere Gruppen haben dieses System erfolgreich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Chondrogenese aus mesenchymalen Stammzellen 9 eingesetzt, standardisierte Generation von neuralen Vorläuferzellen aus pluripotenten Stammzellen 10, analysiert toxikologischen in Hepatozyten 11 und Beurteilung der Rückenmarksregeneration in 12 Salamander. Das spezifische Protokoll für die Arbeit mit HT29-Zellen wird hier gezeigt. <ol><li> Beginnen Sie mit einem T75-Kolben von HT29 Zellen in DMEM+ 10% FBS </li><li> Saugen Wachstumsmedium von der Flasche, und 3 ml Trypsin. </li><li> Zellen 5 min bei 37 ° C. </li><li> Stoppen Trypsin Verdauung durch Zugabe von 3 ml Wachstumsmedium. Einen aliquoten zur Zellzählung und übertragen Sie den Rest in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 200 x g. </li><li> Während der Zentrifugation im Gange ist, zählen Zellen. </li><li> Saugen Trypsin / Medium-Gemisch und ersetzen mit frischem Wachstumsmedium, das Volumen durch die erforderliche Zelldichte wie oben berechnet bestimmt. </li><li> (Optional) Führen Sie die Zellsuspension durch ein Sieb, um eventuelle Klumpen zu entfernen. HINWEIS: Zellerntebedingungen wird etwas zwischen den Zeilen variieren. Wenn ein Protokoll für die Dissoziation zB Passagieren der Zellen von Interesse ist, sollte diese als Ausgangspunkt verwendet werden. Bei empfindlichen Zelllinien Verwendung von Trypsin kann in übermäßigen Zelltod führen. In diesen Fällen haben wir gute Ergebnisse beobachtet mit TrypLE als Alternative dissociatiReagenz auf acht. Wenn die Zellen während der Dissoziation verklumpten und verlieren die Lebensfähigkeit kann die Zugabe von DNAse der Enzymlösung dieses Problem zu beheben. Reduzierung Dissoziation Zeiten und Einsatz eines Verreiben Schritt zu brechen Zellklumpen kann auch erhöhen Rentabilität. </li></ol> 3. Sphäroidbildung HINWEIS: Sphäroide können in einer Vielzahl von Formulierungen Medium erzeugt werden, aber die ersten Versuche sind nach dem Medium, in dem die Zellen kultiviert wurden, um Folgen der Übergang zu einem 3-dimensionalen Kultursystem von Folgen der Änderung der Zusammensetzung des Mediums unterscheiden, durchgeführt werden. <ol><li> Hinzufügen von 0,4 ml Wachstumsmedium in jede Vertiefung. </li><li> Zentrifugieren für 2 min bei 2.000 × g, um Blasen zu entfernen. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Rotor korrekt mit dieser Geschwindigkeit vor der Zentrifugation ausgewogen. </li><li> Mit einem Low-Vergrößerung inverse Mikroskop überprüfen Blasen aus den Kavitäten entfernt. </li><li> In 0,4 mlZellsuspension mit der erforderlichen Dichte (oben berechnet). Vorsichtig mischen durch Pipettieren von oben und unten, ohne dabei Luftblasen in die Vertiefungen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über den gut verteilt, um eine einheitliche Kügelchen zu erhalten. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 200 x g. Wenn die Platte nicht selbst Niveau während der Zentrifugation kann Konvektionsströme dieses Ergebnis in ungleichmäßige Verteilung der Zellen in die Vertiefungen entstehen. Daher sollte die Platte nach innen und gegen die andere Platte ausgeglichen werden, so dass das Gewicht gleichmäßig auf beide Seiten der Trägerplatte verteilt sind. </li></ol> HINWEIS: Wenn Hinweise auf unebenen Zellverteilung zu sehen ist, kann es notwendig sein, eine kleine Menge der Schmierung der Drehpunkte auf der Platte Träger gelten - konsultieren Zentrifugenhersteller für Anweisungen. HINWEIS: Sobald die Zellen in die Vertiefungen zentrifugiert wurden, sind sie einigermaßen Widerstandtig, Auswaschen von geringfügigen Bewegungen der Platte. Abrupte Bewegungen, die in Schwappen des Mediums führen sollte vermieden werden, aber Transfer von der Platte aus der Zentrifuge an Mikroskop oder Inkubator sollte nicht in signifikanten Zell Verschiebung führen. <ol start="6"><li> Mit einem inversen Mikroskop sicher, dass Zellen in die Kavitäten gruppierten, und dass sie gleichmäßig über die gut verteilt. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Mit einem inversen Mikroskop beobachten den Prozess der Sphäroid-Bildung. Einige Zelllinien kompakten Kügelchen innerhalb von 24 Stunden zu bilden, andere können länger dauern. Die Progression von Cluster in HT29-Zellen aggregieren, ist in Fig. 2 gezeigt. </li><li> Recover Sphäroiden aus den Kavitäten und Transfer zum Suspensionskultur durch vorsichtiges Strahlen sie mit einer Pipette. Alternativ halten Sphäroiden in situ mit Mediumwechsel 8 - die Dauer hängt von ihrer ursprünglichen Größe und Wachstumsrate, die define der Zeit, bis sie die Vertiefungen, in denen sie gebildet wurden hinauswachsen. <ol><li> Um mittel, ohne Sphäroiden, absaugen Medium am Rand des Brunnens mit einer Pasteurpipette ersetzen. Langsam bringen die Spitze nach unten, bis es beginnt, Flüssigkeit aus dem Meniskus zu ziehen, und folgen Sie den Meniskus nach unten, wie es fällt. Dann fügen Sie frisches Medium gegen die Wand und an der gleichen Stelle. Einige Sphäroide können verloren werden, wenn jedoch Medium abgesaugt und immer in derselben Position ersetzt wird, wird diese Zahl klein im Vergleich zu der großen Zahl im Bohrloch verbleiben. </li></ol></li></ol>

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<li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739(2011).</li>
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<li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li>
</ol>

Dr. Ungrin hat ein finanzielles Interesse an der Technologie AggreWell als Erfinder.

Wir haben ein System, bei dem eine große Anzahl von gleichförmigen Kügelchen können aus mehreren Zelllinien von verschiedenen Quellen erzeugt werden, hergestellt. Wir haben noch eine haftende Zelllinie, die nicht Sphäroiden unter diesen Bedingungen bilden nicht begegnen. Wir haben schon früher beobachtet Zellverlust in der Bevölkerung anfällig für Anoikis 5,8 jedoch bisher diese Frage nicht mit Tumorlinien entstanden. Das System ist beliebig skalierbar Oberfläche, mit dem Verhalten konsistent Mikrotiterplatte im 24-Well-und 6-Well-Format, sowie Prototypen Bioreaktoren mit je 50.000 Mikrovertiefungen, die derzeit entwickelt. Sphäroid Asymmetrie sollte ein Problem sein, kann die Inkubationszeit in Schritt 4.8, zwei oder drei Tage verlängert werden. Spheroids kann auch für einen Zeitraum nach der Extraktion aus den Vertiefungen, um die Symmetrie zu erhöhen inkubiert werden, aber in diesem Fall darauf zu achten, Kultur Dichten so gering, Sphäroiden in Kontakt miteinander zu halten wi, werdenll verschmelzen oft zu größeren Strukturen. Aus diesem Grund haben wir bisher Kulturen in den Vertiefungen, in denen die Aggregate gebildet wurden, wobei die Hauptbeschränkung wobei die Größe des Sphäroids gehalten. Dies wiederum ist eine Funktion sowohl der Wachstumsrate und der anfänglichen Größe 8, und wenn erweiterte Kultur innerhalb der Mikrotiterplatte soll, sollte diese im voraus berücksichtigt werden. Optionen, um übermäßiges Wachstum zu verhindern, sollte es dazu kommen, sind entweder beginnend mit kleiner Kügelchen, oder den Einsatz der größeren Vertiefungen der AggreWell 800 Platte. Sollte Sphäroiden nicht, in Kohärenz mit der Zeit zu erhöhen, kann eine mögliche Ursache sein Zelltod. Besonders in größeren Aggregaten hoch metabolisch aktiven Zellen können Massentransportbeschränkungen über die Lieferung von Sauerstoff und wichtigen Nährstoffen in einem nekrotischen Kerns 2 führen - und damit ein nicht-zusammenhängende Sphäroid kann einfach eine Folge der übermäßigen Zelltod sein. Alternativ Messungen der mechanischen Zusammenhaltsion von Sphäroiden wurden verwendet, um die interzelluläre Bindungskräfte zu bewerten, in Beziehung zu dem metastatischen Potential einer gegebenen Zelllinie 13. Es wäre interessant, die Beziehung zwischen Form und Sphäroid metastatische Potential zu untersuchen, vielleicht mit morphometrischen Parameter wie Rundheit und Umkreis, zum Flächenverhältnis. Zusätzlich zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften und morphometrische von Sphäroiden, Mikrovertiefungsanordnung in dem System ermöglicht die Großproduktion von gemischten Zusammensetzung Sphäroiden, bestehend aus Kombinationen von mehreren Zelltypen und / oder Biomaterialien 6,7. Die Tumorzellen in Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen wichtig sind, um das Verhalten von Tumoren genauer modellieren in vivo 14, so kann es von Interesse sein, Sphäroiden von Tumorzellen in Kombination mit Fibroblasten und Endothelzellen zu erzeugen, zum Beispiel. Mikropartikel verschiedener Biomaterialien können ebenfalls eingearbeitet werden, und kann beeinflussen spheroid Eigenschaften sowohl direkt durch ihre Wechselwirkungen mit Zellen 7,15 und auch als Reservoir für die kontrollierte Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen in das Innere des Sphäroids 16. Wenn es einen Besorgnis über Sterilität, zum Beispiel bei der Arbeit mit einer Mikrotiterplatte, in der einige Brunnen vorher benutzt worden, die einige Zeit im Brutschrank als Teil einer vorhergehenden Versuch verbracht haben kann, die Brunnen kann mit 70% Ethanol sterilisiert werden im Wasser. Sobald Sphäroide gebildet worden sind, können sie auch aus Restpersonen Zellen, indem die Suspension über eine Zelle Sieb abgetrennt werden. Einzelne Zellen werden durchlaufen, während die Sphäroide wird beibehalten. Wenn der Sphäroid vergießen potentiell metastatischen Zellen im Laufe der Kultur vermutet, kann es wünschenswert sein, diese Prozedur mehrmals durchführen zu können - zunächst auf rechtsfähige Zellen zu entfernen, und anschließend zu isolieren purified Populationen von Zellen durch den Sphäroiden gegeben.

Es gibt eine zunehmende Zahl von Hinweisen, dass Tumorzellen verhalten sich anders im dreidimensionalen Kulturen, als sie tun, wenn sie auf Kunststoff kultiviert, und das auf herkömmlichen Gewebekultur-Plattformen identifiziert Therapeutika Wirksamkeit verlieren, wenn zu einer physiologisch relevanten System 1 umgestellt. Es ist daher wünschenswert, das Verhalten der Krebszellen unter diesen Bedingungen zu untersuchen, sowohl, um Einblicke in die zugrunde liegenden Biologie zu gewinnen, und die Erfolgsrate des Übergangs neue therapeutische Mittel aus dem Screening-Anlage in die Klinik zu erhöhen. Ein nützliches Modellsystem mit einer langen Geschichte beschäftigt dreidimensionale Cluster von Krebszellen als Tumorsphäroide 1,2 bekannt. Idealerweise würde Techniken Sphäroidformation Produktion einer großen Zahl von gleichförmigen Kügelchen, deren Größe und Zusammensetzung des Experimentators gesteuert ermöglichen. Während Hanging-Drop-und Well-Platte nähert 3,4 sind in der Lage, einige dieser Wieder erfüllenAnforderungen, Durchsatz der Regel begrenzt ist, und die Erzeugung einer großen Anzahl von Sphäroiden wird eine arbeitsintensive Aufgabe. Wir haben vor kurzem ein System, um ähnliche Herausforderungen in der regenerativen Medizin zu lösen 5 entwickelt. Der Einsatz gezwungen Aggregation innerhalb einer Serie von dicht gepackten Mikrometermaßstab Brunnen (siehe Abbildung 1), ermöglicht dieser Ansatz die Erzeugung von Sphäroiden aus beliebigen Anzahl von Zellen, einschließlich Gemische von mehreren Zelltypen 6, sowie den Einbau von verschiedenen Biomaterialien 7. Tausende bis Hunderttausende oder mehr - - Sphäroide werden in großer Zahl gebildet und kann sofort entnommen oder in den Vertiefungen, in denen sie waren mit Mediumaustausch für mindestens eine 8 bis zwei (unveröffentlichte Beobachtung) gebildet Wochen aufrechterhalten werden. Dieses System ist daher gut zur Erzeugung einer großen Zahl von gleichmäßigen und reproduzierbaren Tumorsphäroide für die Beurteilung der effe geeignetctiveness von neuartigen Antitumor-Wirkstoffe oder biologische Grundlagenuntersuchungen.

<table><tbody><tr><td>AggreWell 400 Platte</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27845/27945</td><td></td></tr><tr><td>Spüllösung</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>Zellensieb (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px; font-family:Arial; Farbe:#000000; Hintergrundfarbe:#ffffff; font-weight:normal; font-style:normal; font-variant:normal; text-dekoration:keine; vertical-align:Grundlinie; ">&micro; m)</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-676</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene (EDTA)</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-660</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12002-212</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA-95042-112</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Inversmikroskop</td><td>VWR / Motic</td><td>CA19000-610</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R Zentrifuge mit Trägern für Standard-Well-Platten</td><td>VWR / Beckman</td><td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank</td><td>ESBE / Baker</td><td>BKR-SG603AHEUVSP</td><td></td></tr></tbody></table>

die produktion der großen zahlen von größe gesteuerte tumorsphäroide mit microwell platten

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumorsphäroide werden zunehmend als wichtiger in vitro-Modell für das Verhalten von Tumorzellen in drei Dimensionen erfasst. Mehr als herkömmliche physiologisch relevanten haft-Blatt-Kulturen, sie genauer zu rekapitulieren, die Komplexität und in Echt Tumoren Wechselwirkungen. Um dieses Modell zu nutzen, um eine bessere Beurteilung der Tumorbiologie oder die Wirksamkeit von neuen therapeutischen Mittel, ist es notwendig, um Sphäroide reproduzierbar zu erzeugen, in einer kontrollierten Art und Weise und in großer Zahl sein. Die AggreWell System besteht aus einer hochdichten Anordnung von pyramidenförmigen Vertiefungen, in dem eine Suspension von einzelnen Zellen zentrifugiert. Die Nummern der Zellen Clustern am Boden jeder Vertiefung und die Anzahl und das Verhältnis der unterschiedlichen beteiligten Zelltypen hängen nur von den Eigenschaften der vom Experimentator Suspension eingeführt. So sind wir in der Lage, Tumorsphäroide beliebiger Größe und Zusammensetzung mit erzeugenSie benötigen, um die zugrunde liegende Technologie-Plattform ändern. Die Hunderte von Mikro pro Quadratzentimeter Fläche der Kultur wiederum sorgen dafür, dass extrem hohe Produktionsniveau kann über eine einfache, nonlabor intensiver Prozess erreicht werden. Wir erwarten daher, dass dieses Protokoll wird im Großen und Ganzen sinnvoll, Forscher in der Sphäroid Feld Tumor sein.

Sphäroide aus verschiedenen Tumorlinien unterschiedliche anatomische Herkunft leicht erzeugt und in Suspensionskultur gewonnen werden. Fig. 3 zeigt die einheitliche Größe Steuer erhältlich durch dieses Verfahren, mit sehr einheitlicher Sphäroid Populationen unter jeder Bedingung. Klar inter-line Unterschiede im Verhalten sind ebenfalls sichtbar, mit HT29-Darmkrebszellen und Speiseröhrenkrebs TE6 bildenden Zellen dicht gepackt Sphäroiden mit scharf definierten Grenzen, während LNCaP Prostata-Krebszellen führte zu weniger kohärent Sphäroiden mit unregelmäßigen Grenzen (siehe Beiträge zu möglichen Gründen ). Die stärkeren inneren Kräfte in den kohärenter Aggregate führte auch zu einem Zusammenbruch symmetrische Form auch noch in die Vertiefungen, in denen sie gebildet wurden, während die LNCaP Aggregate, insbesondere an der größeren Größe, sichtlich die quadratisch-pyramidale Geometrie der behalten Mikrovertiefungen. Die Beziehung zwischen Eingangs-Zellzahlen und der phys.<html> schen Größe der resultierenden Sphäroid wird von einer Anzahl von Variablen abhängen. Theoretische Volumen, bezogen auf das Produkt aus dem Volumen pro Zelle und der Anzahl von Zellen verwendet werden, können durch Zellverlust, der wiederum Verlust von Zellen in der Einzelzellsuspension Stufe sowie Verlust von zu kleinen Aggregaten aufgrund umfassen reduziert werden Aufgrund der unzureichenden Anzahl von Nachbarn und übermäßig große Aggregate aufgrund von Einschränkungen und Nekrosen in den Kern zu befördern. Größe wird auch durch jede Proliferation, die während des Aggregationsprozesses auftreten können, beeinflußt werden. Wie werden diese Parameter von Zelllinie zu Zelllinie unterschiedlich sein, wenn Sphäroiden von spezifischen physikalischen Abmessungen erwünscht sind, die richtige Anzahl von Zellen einführen müssen experimentell ermittelt werden. In erster Näherung wird Sphäroid Durchmesser erwartet, dass mit der dritten Wurzel der Anzahl der Zellen eingebaut zu erhöhen - zum Beispiel eine 8-fache Erhöhung der Anzahl der Zellen sollte zu einer Verdoppelung der Sphäroid Durchmesser führen. <html> _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der Sphäroid-Produktion. Die Mikrowell-System besteht aus einer Anordnung von dicht gepackten quadratisch-pyramidalen Mikrovertiefungen (625 pro cm 2 für die 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m Größe), in die Zellen zentrifugiert werden. Die Zellen werden durch die schrägen Seitenwände gebracht werden, und die Größe des resultierenden Sphäroid durch Variieren der Dichte der eingesetzten Zellsuspension gesteuert. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; 2. Versammlung der gruppierten Zellen in Sphäroiden. Spheroids wurden aus siebenhundert HT29 Zellen jeweils gebildet. Sofort nach der Zentrifugation (A) Zellen sind lose in dem Boden jeder Vertiefung geclustert. Beachten Sie, dass die Cluster gleichmäßig nach rechts unten in diesem Fall ausgeglichen. Dies ist akzeptabel, vorausgesetzt, Clustergrößen konsistent bleiben über das Array. Wenn bedeutende Unterschiede Cluster-Größe von einer Seite des Feldes auf die andere zu sehen, siehe Anmerkung in Schritt 3.5. Nach Inkubation für 24 h (B), wurden die interzelluläre Haftkräfte verursacht die Cluster zu aggregieren und bilden zusammenhängende Sphäroide, die dann herausgezogen werden kann (C). <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Abbildung 3. Sphäroide in Mikrotiterplatten erzeugt. Sphäroide wurden gebildet siebenhundert (A, C, E) oder eintausendfünfhundert (B, D, F) HT29-Dickdarmkrebszellen (A, B), LNCaP-Prostatakrebszellen (C, D) oder TE6 Speiseröhrenkrebs-Zellen (E, F). Beachten Sie die Konsistenz der Kügelchen innerhalb einer Vorbereitung, und auch die Unterschiede zwischen den Zelllinien - insbesondere die losen LNCaP Aggregate im Vergleich zu dem dichter gepackt und HT29 Zellen TE6. Maßstabsbalken entspricht 200 um. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Microwell-Format </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40ex </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Microwell Breite (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Mikrowells pro cm 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156,25 </td></tr><tr><td> Mikrowells pro Well </td><td> 1200 </td><td> 4700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Mindest Zellen pro Mikrowell * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Maximale Zellen pro Mikrowell * </td><td> 2000 </td><td> 2000 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> Mindest Zellen pro Vertiefung * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Maximale Zellen pro Vertiefung * </td><td> 2,4 x 10 6 </td><td> 9,4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70% Ethanol (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Spülen Lösungsvolumen (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 3.2 - Mittlere Vorspannung Volumen (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> 3.5 - Handy Ladevolumen (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Anzahl der Zellen pro Mikrovertiefung sind nur eine Annäherung, da dieser Wert wird mit der Größe der eingesetzten speziellen Zellen variieren und sollte empirisch bestimmt werden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. AggreWell Optionen und Modifikationen Protokoll.

Wir führen ein Protokoll für die Erzeugung einer großen Anzahl (Tausende bis Hunderttausende) von einheitlicher Größe und Zusammensetzung gesteuerten Tumorsphäroide mit handelsüblichen Mikrotiterplatten.

Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine große Anzahl von Tumorsphäroiden mit kontrollierter, einheitlicher Größe zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Mikrotiterplatten vorbereitet werden, um die Zellen zu aggregieren, aus denen die Sphäroide gebildet werden. Im zweiten Schritt wird eine Kultur des gewünschten Zelltyps geerntet, die die Zellsuspension liefert, welche Größe und Zusammensetzung der OID bestimmt.Die Zellsuspension wird anschließend in die Mikrovertiefungen zentrifugiert und inkubiert, um die Steroidbildung nach der Inkubation zu ermöglichen. Die resultierenden Steroide weisen eine hohe Uniformität auf und können in den Mikrovertiefungen, in denen sie gebildet wurden, gesammelt oder kultiviert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass gleichzeitig sehr große Zahlen einheitlicher Aggregate hergestellt werden können.Personen, die mit dieser Methode neu sind, könnten feststellen, dass ihr Brennstoff sehr in der Größe ist. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zellsuspension gleichmäßig über die Platte verteilt ist und dass die schwingenden Plattenhalter in der zentralen Zentrifuge sich frei bewegen, sodass die Kraft senkrecht zur Oberfläche wirkt. Beginnen Sie damit, eine sterile Agro-Well-400-Platte vorzubereiten, indem Sie 0,5 Milliliter Spüllösung mit Tensid in jedes Loch geben.Die Verwendung von Tensid stellt sicher, dass die Zellen nicht mit der Oberfläche der Mikrovertiefungen interagieren. Um die Bildung von Luftblasen in den Mikrovertiefungen zu vermeiden, fügen Sie die Flüssigkeit an einer Seite hinzu und lassen Sie sie über die Oberfläche fließen, anstatt sie senkrecht auf die Oberfläche tropfen zu lassen. Nach dem Hinzufügen der Lösung zu den Vertiefungen setzen Sie den Deckel wieder auf. Stellen Sie sicher, dass der Rotor vor dem Zentrifugieren der Platten für zwei Minuten bei 2000 × g ordnungsgemäß ausbalanciert ist. Überprüfen Sie mithilfe eines invertierten Mikroskops mit niedriger Vergrößerung, ob die Bläschen aus den Mikrowellplatten entfernt wurden. Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten mit Deckel bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie die Spüllösung aus den Vertiefungen und waschen Sie die Platte unmittelbar vor Gebrauch mit steriler Wasser oder PBS.Vermeiden Sie, dass die Platten nach der Codierung austrocknen. Die Einzelheiten der Zellpräparation variieren je nach der spezifischen Zellart, die untersucht wird. Wir haben jedoch beobachtet, dass dieser Zustand für eine breite Palette von Zellen wirksam ist, einschließlich der hier diskutierten Zelllinien sowie humaner embryonaler Stammzellen und Neuronen, humaner induzierter pluripotenter Stammzellen, Fibroblasten, putativer, primitiver Endone- und stromaler Zellen. Zur Zellpräparation beginnen Sie mit dem T-75-Fläschchen mit HT-29-Zellen.Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus dem Kolben und geben Sie drei Milliliter Trypsin hinzu. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie die Trypsin-Digestion durch Zugabe von drei Millilitern Wachstumsmedium.Überführen Sie den Rest in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nehmen Sie dann aus einem 15-Milliliter-Röhrchen eine Aliquotprobe zur Zellzählung. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 × g, während die Zentrifugation läuft.Zählen Sie die Zellen. Danach saugen Sie das Trypsin-Medium-Gemisch ab und ersetzen es durch frisches Wachstumsmedium in einem Volumen, das durch die zuvor berechnete erforderliche Zelldichte bestimmt wird, wie im Textprotokoll als optionaler Schritt beschrieben.Lassen Sie die Zellsuspension durch ein Sieb laufen, um eventuelle Klumpen zu entfernen. Sphäroide können in einer Vielzahl von Mediumzusammensetzungen erzeugt werden; anfängliche Versuche sollten jedoch mit dem Medium durchgeführt werden, in dem die Zellen kultiviert wurden. Um die Auswirkungen des Übergangs zu einem dreidimensionalen Kultursystem von den Auswirkungen einer Änderung der Mediumzusammensetzung zu unterscheiden, geben Sie zunächst 0,4 Milliliter Wachstumsmedium in jede Vertiefung und zentrifugieren Sie zwei Minuten bei 2000 ×g. Überprüfen Sie mithilfe eines invertierten Mikroskops mit niedriger Vergrößerung, ob die Blasen aus den Mikrovertiefungen entfernt wurden.Fügen Sie anschließend 0,4 Milliliter Zellsuspension mit der erforderlichen Dichte in die Mikrotiterplattenmulden hinzu. Mischen Sie dann vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, ohne Luftblasen in die Mulden einzubringen, und stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig in der Mulde verteilt sind. Um konsistente Steroide zu erhalten.Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang mit 200 × g. Die Platte muss sowohl intern als auch gegenüber der anderen Platte ausbalanciert sein, damit das Gewicht gleichmäßig auf beide Seiten des Plattenhalters verteilt ist. Dies gewährleistet, dass sich die Platte während der Zentrifugation selbst ausrichtet und Konvektionsströmungen vermieden werden, die zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Zellen in den Mikrovertiefungen führen könnten.Überprüfen Sie mithilfe eines umgekehrten Mikroskops, ob sich die Zellen in den Mikrowellen angesammelt haben und gleichmäßig über die Vertiefung verteilt sind, bevor Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Beobachten Sie den Prozess der Sphäroidbildung mit einem umgekehrten Mikroskop. Einige Zelllinien bilden innerhalb von 24 Stunden kompakte Sphäroide. Andere können länger dauern. Die Progression vom Cluster zum Aggregat in HT 29-Zellen wird hier gezeigt. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, die Intex-Steroiden herauszunehmen, ohne die Strukturen zu stören. Um Steroide aus Mikrovertiefungen zu extrahieren, pipettieren Sie sehr vorsichtig auf und ab, damit die Sphäroide aus den Mikrovertiefungen austreten können.Neigen Sie dann die Platte, um das Medium-Steroid-Gemisch abzusaugen. Verwenden Sie Pipettenspitzen mit großer Öffnung für größere Steroide, um eine Zerstörung der Steroide zu vermeiden. Nach dem Rückgewinnen der Steroide aus den Mikrogefäßen überführen Sie diese durch vorsichtiges Herausspritzen mit einer Pipette in die Suspensionkultur.Alternativ kann die schwere Rose im Anfall durch einen Mediumwechsel aufrechterhalten werden. Die Dauer hängt von der anfänglichen Größe und der Wachstumsrate ab, die den Zeitpunkt bestimmen, zu dem sie die Mikrovertiefungen überschreiten. Sobald sie gebildet sind, erfolgt der Mediumwechsel, um einen Verlust von Steroiden zu vermeiden.Aspirieren Sie das Medium am Rand der Vertiefung. Führen Sie mit einer Pasteurpipette die Spitze langsam nach unten, bis sie Flüssigkeit aus dem Meniskus aufnimmt, und folgen Sie dem absinkenden Meniskus. Anschließend frisches Medium an derselben Stelle an der Wand der Vertiefung hinzufügen.Beim Hinzufügen des frischen Mediums darauf achten, den Pipettierer sanft zu betätigen und die Spitze an der Wandung entlanglaufen zu lassen, um eine Störung der PHE in den Mikrobrunnen zu vermeiden. Einige Steroide könnten verloren gehen. Wenn das Medium jedoch stets an derselben Stelle abgesaugt und ersetzt wird, bleibt diese Zahl gering.Im Vergleich zu den großen Zahlen in der Vertiefung können Steroide aus mehreren Tumorzelllinien unterschiedlicher anatomischer Herkunft leicht in Suspension überführt werden. Die über dieses Verfahren erzielbare gleichmäßige Größenkontrolle wird hier anhand hochuniformer Steroidpopulationen gezeigt. Jede Bedingung wurde aus 700 bzw. 1.500 Zellen hergestellt.Deutliche Unterschiede zwischen den Zelllinien im Verhalten sind ebenfalls bei HT 29 Darmkrebszellen und TE six Speiseröhrenkrebszellen sichtbar, die dicht gepackte Steroide mit scharf definierten Grenzen bilden. Umgekehrt bilden Lin-Cap-Prostatakrebszellen weniger kohärente Steroide mit unregelmäßigen Grenzen. Die stärkeren inneren Kräfte in den kohärenteren Aggregaten führten außerdem dazu, dass sie bereits innerhalb der Mikroryungen, in denen sie entstanden waren, zu einer symmetrischeren Form kollabierten.Allerdings behalten die lin-cap-Aggregate, insbesondere in größerer Größe, deutlich die quadratische parametallische Geometrie der Mikrowellplatten bei. Sobald der Vorgang beherrscht ist, kann er innerhalb von etwa einer Stunde durchgeführt werden, zuzüglich der Inkubationszeit, die erforderlich ist, damit die Zellen anhaften und Flüssigkeiten bilden können. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass keine Blasen entstehen, die sich in den Mikrowellplatten ausbreiten, bevor die Zellen hinzugefügt werden.

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