Name: Transsynaptische Tracing von Peripherie Targets mit Pseudorabies-Virus durch Cholera Toxin und biotinyliertes Dextran Amine Doppelmarkierung Gefolgt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Erfahren Sie die transsynaptische Tracing-Methode mit Pseudorabies-Virus zur Kartierung zentraler prämotorischer Netzwerke, die periphere Ziele regulieren. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung neuronaler Schaltkreise im Gehirn.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Dr. Toshio Terashima der Universität Kobe, Japan, für die Lehre des Kehlkopfoperationstechnik und Dr. Lynn Enquist von der Princeton University für die Versorgung PRV-Bartha. Forschung wurde von NIH Pioneer Award DP1 OD000448 Erich D. Jarvis und ein NSF Graduate Research Fellowship Award an Gustavo Arriaga unterstützt. Zahlen entsprechend gutgeschrieben früheren Arbeiten werden unter der PLoS ONE offenen Zugang Creative Commons-Lizenz (CC-BY) gemäß redaktionelle Politik der Zeitschrift verwendet.

HINWEIS: Alle tierischen Verfahren wurden überprüft und von der Duke University Institutional Animal Care &amp; Use Committee genehmigt. 1. Speichern Pseudorabiesvirus <ol><li> Wir erhalten Lebendvirus (PRV152) aus dem Labor von Dr. Lynn Enquist an der Princeton University mit einem Titer von 1 × 10 9 pfu / m. Das Protokoll, das Virus zu erzeugen, ist veröffentlicht worden 2. </li><li> Aliquot des Virus bei 20 &amp; mgr; l pro Röhrchen in einem BSL-2 Biosicherheitswerkbank und bei -80 ° C unter angemessenen Biosicherheitsbedingungen. </li><li> Tauwetter ein Aliquot PRV unmittelbar vor der Injektion. </li></ol> 2. Chirurgische Vorbereitung für Injektionen in den Muskel <ol><li> Induzieren Narkose durch intramuskuläre Injektion von Ketamin-Xylazin (100 mg / kg Ketamin, 10 mg / kg Xylazin) und Aufrechterhaltung eines geeigneten Anästhetikums Ebene mit Isofluran. </li><li> Schützen die Hornhaut mit einer ophthalmischen Salbe. </li><li> Bereiten ter Operationsstelle nach aseptischen Bedingungen durch Trimmen Haare und Desinfektion des Operationsstelle mit alternierenden Peelings von Betadine und 70% Alkohol (mindestens 3 Zyklen). Achten Sie darauf, sterilen Tüchern zu verwenden, um chirurgische Bereiche abdecken. Achten Sie darauf, um sterile Techniken in den Verfahren einzuhalten. </li><li> Machen Sie einen Hautschnitt und zeigen die Muskeln von Interesse. Zum Beispiel, um den Kehlkopf cricothyroideum Muskel Zugriff ist es erforderlich, zunächst die darüberliegende Teil des M. sternohyoideus entfernen. </li><li> Verschließen Sie alle durchtrennten Muskeln mit Vetbond Gewebekleber. </li></ol> 3. Injektion von PRV in Muscle <ol><li> Laden Sie die 10 &amp; mgr; NanoFil Mikrosystem mit frisch aufgetauten PRV-Lösung, fügen Sie eine 34 G Nadel aus rostfreiem Stahl, und sorgfältig montieren Sie ihn auf der stereotaktischen Gerät. </li><li> Langsam löschen Sie den toten Raum und prüfen, ob Lösung tritt aus der Mikrospitze. Entsorgen Flüssigkeit als bioharzard Abfälle. </li><li> Unter Verwendung eines stereotaktischen microPositionierung Gerät stellen sorgfältig die Mikrospitze in den Muskel von Interesse und langsam füllen die Muskeln bis leichte Schwellung sichtbar ist. Die Einspritzrate in Abhängigkeit von der Größe des Muskels und das Volumen zu variieren, um injiziert werden. So sollte beispielsweise fünf Injektionen von 200 nl (1 ul insgesamt) bei einer Rate von 4 nl / sec 1 min auseinander am gleichen Ort, um die cricothyroideus füllen. Bewegen Sie die Spritze in die nächste Muskel von Interesse (die seitliche cricoarytenoideus in diesem Fall) und wiederholen Sie den Einspritzvorgang. Jeden Muskel nur einmal zu durchstechen. </li><li> Ziehen Sie die Mikrospritze nach fünf Minuten. </li><li> Verschließen Sie den Bruch in der Faszie mit Vetbond Gewebekleber. </li><li> Nachdem alle Injektionen abgeschlossen sind, schließen Sie die Wunde mit Vetbond Gewebekleber. Abhängig von Ihrer lokalen institional Tiernutzung Richtlinien, Nähten oder Wundklammern verwendet werden. </li><li> Überwachen Sie das Tier bis zum Brustlage und bieten Analgesie, Nahrung, Wasser, und die Fürsorge, durch y erforderlichunsere institutionellen Tiernutzung Richtlinien. </li><li> Nach dem experimentell ermittelten Überlebenszeit (in diesem Fall 90 h bis zu markieren 2. Ordnung kortikalen Neuronen), opfert das Tier Pentobarbitalüberdosis und transkardial perfundiert mit 0,9% Salzlösung, gefolgt von 4% Formaldehyd in 0,1 M PBS. </li><li> Entfernen und nach der Fixierung des Gehirns in 4% Formaldehyd für 24 Stunden. </li><li> Cryoprotect das Gehirn in Phosphatpuffer, enthaltend 30% Sucrose für mindestens 48 Std. </li></ol> 4. immunchemischen Nachweis von eGFP <ol><li> Zuschnitte bei 40 &amp; mgr; m auf einem Schlittenmikrotom und speichern schwebenden Abschnitte, in 0,1 M PBS. Dünneren Abschnitten, beispielsweise 30 &amp; mgr; m kann beim Beizen Einbaufelder verwendet werden. </li><li> Stillen Abschnitte für 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS vor Licht geschützt. </li><li> Blockieren nicht-spezifischer Antigene in den Abschnitten für 30 min in PBS mit 0,3% Tween 20 mit normalem Ziegenserum vom VECTASTAIN Elite Kit (VE-Kit). </li><li&gt; Inkubation blockiert Abschnitte für 3,5 Stunden in Kaninchen-anti-eGFP (1: 1.000) bei RT. </li><li> Dreimal in PBS waschen Abschnitte für 5 min, dann inkubiert sie für 1 Stunde in Ziegen-Anti-Kaninchen sekundären Antikörpers von dem VE Kit bei RT. </li><li> Vorbereitung der ABC-Lösung von der VE-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Dreimal in PBS waschen Abschnitte für 5 min, dann reagieren sie für 1 Stunde in ABC-Lösung von der VE Kit bei RT. </li><li> Dreimal waschen Abschnitte in Phosphatpuffer für 10 min, und zu entwickeln, für 8 min in Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,05% DAB (3, 3&#39;-Diaminobenzidin) und 0,015% H 2 O 2. </li><li> Montageabschnitte auf Superfrost Plus Rutschen und entwässern sie durch eine abgestufte Alkoholserie (70%, 95%, 100% und 100% für jeweils 5 Minuten). </li><li> Deaktivieren Sie die Schnitte durch zwei Wäschen Xylol (5 min jeweils) und Deckglas die Folien mit Permount Eindeckmedium. </li><li> Bild die montierten Teile auf einem Mikroskop. Die DAB Reaktionsprodukt inside die Zellen sollten braun erscheinen. Digitalisierte Bilder können Farben umgekehrt, um feine Prozesse hervorzuheben ist. </li></ol> 5. Chirurgische Vorbereitung für die Injektion von Tracern in Hirnregionen Entdeckt von PRV Tracing <ol><li> Induzieren Narkose durch intramuskuläre Injektion von Ketamin-Xylazin (100 mg / kg Ketamin, 10 mg / kg Xylazin) und Aufrechterhaltung eines geeigneten Anästhetikums Ebene mit Isofluran. </li><li> Schützen die Hornhaut mit einer ophthalmischen Salbe. </li><li> Befestigen Sie den Kopf in einem geeigneten stereotaktischen Rahmen. </li><li> Bereiten Sie die Operationsstelle nach aseptischen Bedingungen durch Trimmen Haare und Desinfektion der Website mit alternierenden Peelings von Betadine und 70% Alkohol (mindestens 3 Zyklen). </li><li> Machen Sie einen Kopfhauteinschnitt und Einfahren der Haut über der Hirnregion von Interesse. </li><li> Führen Sie eine kleine Kraniotomie bei den entsprechenden stereotaktischen Koordinaten. Zum Beispiel werden die Koordinaten für laryngeally verbunden motorischen Kortex von PRV-Tracing in einer identifiziertenn erwachsenen Maus sind 1,2 mm lateral und 0,2 mm rostral Bregma. </li></ol> 6. Die Injektion von biotinylierten Dextran Amine in Gehirn- <ol><li> Bereiten Sie 7,5% biotinylierten Dextran Amine (BDA) durch Lösen von 25 mg des BDA (10.000 MW) in 333 ul steriler Kochsalzlösung. </li><li> Laden Sie die Mikropipette System Nanoject II mit ausreichender BDA-Lösung für die geplanten Injektionen. </li><li> Langsam löschen Sie den toten Raum und prüfen, ob Lösung Verlassen der Mikropipettenspitze. </li><li> Unter Verwendung eines stereotaktischen Mikropositionierung Gerät vorsichtig niedriger die Mikropipettenspitze in das Gehirn Region von Interesse und langsam injizieren BDA. Stellen Sie die Einspritzrate in Abhängigkeit von der Größe der Region, um zu kennzeichnen. Zum Beispiel sollten 12 Injektionen von 4,6 NL hat an vier verschiedenen Standorten 0,2 mm auseinander (rostro-kaudal), um die laryngeally verbunden motorischen Kortex in erwachsenen Mäusen zu decken. Das endgültige Injektionsvolumen sollte entsprechend der Größe der Hirnregion von Interesse angepasst werden, Wenn man bedenkt, dass Etikett kann aus der Spritzkern durch Diffusion durch Hirngewebe und entlang den Prozessen der markierten Neuronen ausgebreitet. </li><li> Verschließen Sie die Kraniotomie mit Zahnzement, und schließen Sie die Kopfhaut Wunde mit Vetbond Gewebekleber. </li><li> Überwachen Sie das Tier bis zum Brustlage und bieten Analgesie, Nahrung, Wasser, und die Fürsorge, die von Ihrem institutionellen Tiernutzung Richtlinien erforderlich. </li></ol> 7. Die Injektion von Cholera Toxin-Untereinheit b in Muscle <ol><li> Vorbereitung 1% Cholera Toxin-Untereinheit B (CTB), die durch Auflösen von 1 mg CTb in 100 ul steriler Kochsalzlösung. </li><li> Sechs Tage nach BDA Injektion in das Gehirn, führen die chirurgische Vorbereitung wie oben für PRV Injektionen beschrieben in den Muskel. </li><li> Laden Sie die 10 &amp; mgr; NanoFil Mikrosystem mit CTb Lösung, fügen Sie eine 34 G Nadel aus rostfreiem Stahl, und sorgfältig montieren Sie ihn auf der stereotaktischen Gerät. </li><li> Führen die Mikroinjektion in den Muskel (n) von Interesse, wie vorstehend dePRV beschrieben. </li><li> Überwachen Sie das Tier bis zum Brustlage und bieten Analgesie, Nahrung, Wasser, und die Fürsorge, die von Ihrem institutionellen Tiernutzung Richtlinien erforderlich. </li><li> Drei Tage nach CTb Injektion, zu opfern das Tier durch Überdosis Pentobarbital und perfundieren transkardial mit 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Formaldehyd in 0,1 M PBS. </li><li> Entfernen und nach der Fixierung des Gehirns in 4% Formaldehyd für 24 Stunden. </li><li> Cryoprotect das Gehirn in Phosphatpuffer, enthaltend 30% Sucrose für mindestens 48 Std. </li></ol> 8. Nachweis der BDA und CTB in dieselben Abschnitte <ol><li> Zuschnitte bei 40 &amp; mgr; m auf einem Mikrotom und speichern schwebenden Abschnitte, in 0,1 M PBS. </li><li> Stillen Abschnitte für 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS vor Licht geschützt. </li><li> Vorbereitung der ABC-Lösung von der VE-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Dreimal waschen Schnitte in PBS für 5 min, dann reagieren sie für 1 Stunde in ABC-Lösung bei RT. </li&gt; <li> Dreimal waschen Abschnitte in Phosphatpuffer für 10 min, und zu entwickeln, für 8 min in Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,05% DAB (3, 3&#39;-Diaminobenzidin), 0,015% H 2 O 2 und 0,05% Nickelchlorid. Die DAB Reaktionsprodukt innerhalb der Zellen sollte erscheinen schwarz. </li><li> Blockabschnitte für 30 min in PBS mit 0,3% Tween 20 mit normalem Kaninchenserum aus dem VECTASTAIN Elite Kit. </li><li> Inkubieren blockiert Abschnitten 2 h in Ziegen-Anti-CTb (1: 10.000) bei RT. </li><li> Dreimal waschen Schnitte in PBS für 5 min und dann inkubiert sie für 1 h in Kaninchen-anti-Ziege-sekundärem Antikörper von dem VE Kit bei RT. </li><li> Vorbereitung der ABC-Lösung von der VE-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Dreimal waschen Schnitte in PBS für 5 min, dann reagieren sie für 30 min in ABC-Lösung bei RT. </li><li> Dreimal in Phosphatpuffer gewaschen Schnitte für 10 min, und die Entwicklung bis zu 8 min in Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) und 0,015% H 2 O 2. Die DAB Reaktionsprodukt innerhalb der Zellen sollte braun erscheinen. </li><li> Montageabschnitte auf Superfrost Plus Rutschen und entwässern sie durch eine abgestufte Alkoholserie (70%, 95%, 100% und 100% für jeweils 5 Minuten). </li><li> Deaktivieren Sie die Schnitte durch zwei Wäschen Xylol (5 min jeweils) und Deckglas die Folien mit Permount Eindeckmedium. </li><li> Bild die montierten Teile auf einem Mikroskop. </li></ol>

<ol><li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22Transneuronal+circuit+analysis+with+pseudorabies+viruses.Multiple+values+selected%22">Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected</a>. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).</li>
<li>Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein%3A+a+tool+for+in+vitro+electrophysiological+analysis+of+transsynaptically+labeled+neurons+in+identified+central+nervous+system+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).</li>
<li>Aston Jones, G., Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+pseudorabies+virus+to+delineate+multisynaptic+circuits+in+brain+opportunities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li>
<li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li>
<li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).</li>
<li>Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).</li>
<li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single+and+double+labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li>
<li>Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+a+versatile+anterograde+and+retrograde+neuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer.</a> Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).</li>
<li>Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+cholera+toxin+B+subunit%3A+comparison+of+three+different+visualization+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods.</a> Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).</li>
<li>Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+circuitry+involved+in+the+regulation+of+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements.</a> The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).</li>
<li>Bartha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+reduction+of+virulence+of+Aujeszkys+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Magy+Allatorv+Lapja%22%5BJournal%5D)">Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus.</a> Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).</li>
<li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+as+transneuronal+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li>
<li>Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+pathway+from+rat+vibrissa+motor+cortex+to+facial+motor+neurons+revealed+by+lentivirus-based+axonal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).</li>
<li>Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input+output+organization+of+the+rat+vibrissal+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Input output organization of the rat vibrissal motor cortex.</a> Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).</li>
<li>Hsu, S. M., Soban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+modification+of+diaminobenzidine+%28DAB%29+precipitation+by+metallic+ions+and+its+application+for+double+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).</li>
<li>Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+avidin+biotin-peroxidase+complex+%28ABC%29+in+immunoperoxidase+techniques+a+comparison+between+ABC+and+unlabeled+antibody+%28PAP%29+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).</li>
<li>Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine+comparison+with+the+tracer+Phaseolus+vulgaris+leucoagglutinin+in+preparations+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).</li>
<li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+architecture+of+nucleus+ambiguus+motoneurons+projecting+to+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).</li>
<li>Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+birds+and+men+the+mouse+ultrasonic+song+system+has+some+features+similar+to+humans+and+songlearning+birds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds.</a> PLoS ONE. 7 (10), e46610(2012).</li>
<li>Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+the+use+of+pseudorabies+virus+in+transneuronal+studies+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).</li>
<li>Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+glycoprotein+gIII+is+a+major+target+antigen+for+murine+and+swine+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).</li>
<li>Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinvasiveness+of+pseudorabies+virus+injected+intracerebrally+is+dependent+on+viral+concentration+and+terminal+field+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density.</a> The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).</li>
<li>Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+the+attenuated+pseudorabies+virus+PRV+Bartha+results+in+infection+of+the+hamster+suprachiasmatic+nucleus+only+by+retrograde+transsynaptic+transport+via+autonomic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).</li>
<li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Es gibt eine Reihe von Fragen, die berücksichtigt bei der Planung eines Experiments unter Verwendung PRV152 4,21 getroffen werden müssen. Am wichtigsten ist, Pseudorabies-Virus tödlich. Wie zuvor erwähnt, Menschenaffen, einschließlich Menschen, sind nicht anfällig für Infektionen, sondern müssen entsprechende Sorgfalt auf andere Tiere zu schützen. Erwachsene Mäuse überleben in der Regel fünf bis sieben Tage nach der Impfung mit attenuierten PRV152 Belastung. Daher ist PRV152 nicht für Experimente, die Überleb...

Transsynaptische Verfolgung hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug zur zentralen Efferenzen, die periphere Ziele durch Multi-synaptischen Schaltungen zu regulieren zu analysieren. Dieser Ansatz wurde sehr ausgiebig im Gehirn von Nagetieren durch die Nutzung der Schweine pathogen Pseudorabies-Virus (PRV), vor allem die abgeschwächten Stamm PRV-Bartha erstmals 1961 beschrieben, verwendet 12. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Identifizierung der Motor kortikalen Repräsentation von spezifischen Muskeln oder Muskelgruppen unter Verwendung eines rekombinanten Pseudorabies-Virus-Stamm (PRV152) die verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP) Reporter-Gen 2 zum Ausdruck. Das beschriebene Verfahren nutzt das Verhalten der neurotropen Viren, die infektiösen Nachkommen, dass grenz Synapsen zu anderen Neuronen innerhalb einer Funktionsschaltung 3,4,13 infizieren zu produzieren. PRV152, die isogen mit PRV-Bartha ist, kreuzt nur Synapsen retrograd durch die hierarchische Reihenfolge der synaptischen Verbindungen von der Infektionsstelle 3,5 &lt;/ sup&gt;. Durch präzises Steuern der peripheren Stelle der Infektion ist es möglich, den Eintritt des Virus in das Gehirn durch eine spezifische Untergruppe von Motoneuronen zu begrenzen. Da das Virus infiziert Ketten sequentiell verbundenen Neuronen, wird das sich ergebende Muster eGFP Signal gesamten Gehirn dann lösen das Netzwerk von Neuronen, die zu den ursprünglich infizierten Zellen verbunden sind. Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung von Virus für neuronale Verfolgung ist die Amplifikation des Reporter-Protein (eGFP in diesem Fall) in infizierten Zellen. Diese Signalverstärkung bietet ein Maß an Sensibilität, die Detektion auch spärlich Projektionen ermöglicht. Zum Beispiel wurde eine spärliche Projektion aus vibrissa motorischen Cortex zu den Gesichtsmotoneuronen Steuern der Whisker in Ratten unter Verwendung viral exprimierten green fluorescent protein 14 gefunden; früheren Studien konnte diesen Vorsprung mit klassischen Tracern ohne Reporter-Gen-Amplifikation 11,15 zu finden. leiderViele virale Verfolgung Vektoren, wie das in der zitierten Studie verwendeten nicht kreuzen Synapsen, wodurch ihre Verwendung für die Rückverfolgung Mehrsynapsenschaltungen einschränkend. Während der Präsentation deutliche Vorteile für die Identifizierung der Netzwerk von Zellen, die an einem Motorstromkreis, der verteilten Natur transsynaptische Tracing mit PRV-152 macht die Interpretation von spezifischen Verbindungen innerhalb der Schaltung schwierig. Daher präsentieren wir ein einfaches Verfahren für die Validierung von spezifischen Verbindungen innerhalb Schaltungen identifiziert mit PRV-152 durch Doppelklick Etikettierung unter Verwendung von biotinylierten Dextran Amine (BDA) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTB). Der kombinierte Einsatz von BDA und CTB ist ein etablierter Ansatz zur Verfolgung Verbindungen zwischen bestimmten Gruppen von Neuronen 6-8,11. Wenn sie zusammen verwendet werden, können diese beiden Tracer in demselben Abschnitt unter Verwendung eines Zweifarben DAB (3, 3&#39;-Diaminobenzidin) Prozedur 16 visualisiert werden. Hochmolekulare BDA (BDA10kDa) wurde für dieses Protokoll ausgewählt, weil es yields detaillierte Kennzeichnung von neuronalen Prozessen 6,7,9. Zusätzliche Vorteile BDA10kDa gehören die folgenden: Es ist bevorzugt in der anterograde Richtung 6-8 transportiert wird; sie kann durch iontophoretische oder Druckeinspritzung 6-8 geliefert werden; sie kann durch einen einfachen Avidin-biotinyliertem HRP (ABC) Verfahren 17 dargestellt werden; und es kann durch Licht- oder Elektronenmikroskopie 6,7,18 abgebildet werden. Immunchemischen Nachweis von CTb mit Peroxidase und DAB wurde für retrograde Markierung von Motoneuronen gewählt, weil es effektiv bei enthüllt zelluläre Prozesse einschließlich distalen Dendriten 10,19 ist. Vor kurzem haben wir diesen Ansatz verwendet, um die Stimmkraftwegs in Mäusen zu identifizieren und ein Sparse-Verbindung vom primären Motorkortex den Kehlkopfmotorneurone, was bisher angenommen wurde 20 abwesend sein offenbaren.

<table><tbody><tr><td>Name des Reagenzes/Materials</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Bemerkungen</td></tr><tr><td>NanoFil Mikroinjektionssystem</td><td>World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 G Option</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modell 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injektor</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Gleitmikrotom</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Isofluoran (Foran)</td><td>Baxter&nbsp;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>Betadine Swab Stick</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 count</td></tr><tr><td>Permount Eindeckmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierte Dextran-Amine</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10.000 MW</td></tr><tr><td>Pseudotollwutvirus</td><td>Labor von Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td><td>PRV152</td><td>Titer >1 x 107</td></tr><tr><td>Anti-Cholera-Toxin B-Untereinheit (Ziege)</td><td>Liste Biologische Laboratorien</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Cholera-Toxin B-Untereinheit</td><td>Liste Biologische Laboratorien</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Offene Biosysteme</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-Diaminobenzidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>10 mg Tabletten</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Verdünnt auf 4%</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr><tr><td>Ketamin HCl & Xylazin HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml & 6 mg/ml</td></tr><tr><td>Nickelchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1,0 M; pH 7,4</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7,4</td></tr><tr><td>Natrium-Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>50 mg/ml Dosis</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Histologische Qualität</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (Kaninchen); PK-6105 (Ziege)</td><td></td></tr><tr><td>Optixcare Augensalbe</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transsynaptische tracing von peripherie targets mit pseudorabies-virus durch cholera toxin und biotinyliertes dextran amine doppelmarkierung gefolgt

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptische Verfolgung hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug zur zentralen Efferenzen, die periphere Ziele durch Multi-synaptischen Schaltungen zu regulieren zu analysieren. Dieser Ansatz wurde sehr ausgiebig im Gehirn durch die Nutzung der Schweine pathogen Pseudorabies-Virus (PRV) 1 verwendet. PRV nicht infizieren, Menschenaffen, einschließlich des Menschen, so dass es am häufigsten in Studien von kleinen Säugetieren, vor allem Nagetiere. Die Pseudorabies-Stamm PRV152 drückt das enhanced green fluorescent protein (eGFP) Reportergen und kreuzt nur funktionierender Synapsen retrograd durch die hierarchische Sequenz der synaptischen Verbindungen von der Infektionsstelle 2,3. Andere PRV-Stämme haben unterschiedliche mikrobiologischen Eigenschaften und kann in beiden Richtungen (PRV-Becker und PRV-Kaplan) 4,5 transportieren. Dieses Protokoll wird ausschließlich mit PRV152 umzugehen. Durch die Bereitstellung der Virus bei einer peripheren Stelle, wie Muskeln, ist es möglich, den Eintritt des Virus in T GrenzEr Gehirn durch eine bestimmte Gruppe von Neuronen. Das resultierende Muster der eGFP-Signal über das gesamte Gehirn löst dann die Nervenzellen, die zu den ursprünglich infizierten Zellen verbunden sind. Da die verteilte Natur transsynaptische Tracing mit Pseudorabies-Virus macht die Interpretation spezifischen Verbindungen innerhalb eines identifizierten Netzwerk schwierig, präsentieren wir eine empfindliche und zuverlässige Verfahren, bei dem biotinylierte Dextran Amine (BDA) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) zur Bestätigung der Verbindungen zwischen Zellen identifiziert Verwendung PRV152. Immunochemische Detektion BDA und CTB mit Peroxidase und DAB (3, 3&#39;-Diaminobenzidin) wurde gewählt, weil sie effektiv bei der Aufklärung von zellulären Prozessen, einschließlich distalen Dendriten 6-11.

Färbung für eGFP sollten anfangen, die schwaches Signal in primären Motoneuronen in etwa 72 Stunden nach der Injektion in den Muskel PRV152. Replikation und transsynaptische Transport von Virus titer- und zeitabhängige 4. Etwa 90 Stunden nach der Injektion wird eGFP-Färbung zeigen robuste Signal in 2. Ordnung infizierten Zellen. Längere Überlebenszeiten werden offenbaren 3. und höherer Ordnung Zellen, aber die Überlebenszeiten durch die Letalität von PRV auf etwa 5 Tage nach der Impfung ...

Transsynaptisches Tracing ist zu einem mächtigen Werkzeug für die Analyse zentraler Efferenten geworden, die periphere Ziele durch multisynaptische Schaltkreise regulieren. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das das transsynaptische Pseudotollwutvirus ausnutzt, um einen funktionsfähigen Gehirnschaltkreis zu identifizieren und zu lokalisieren, gefolgt von klassischen Traktverfolgungstechniken, um spezifische Verbindungen im Schaltkreis zwischen identifizierten Gruppen von Neuronen zu validieren.

Transsynaptische Tracing von Peripherie Targets mit Pseudorabies-Virus durch Cholera Toxin und biotinyliertes Dextran Amine Doppelmarkierung Gefolgt

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das zentrale prämotorische Netzwerk aus verteilten Zellen zu identifizieren, die auf ein bestimmtes peripheres Ziel einwirken, und anschließend die spezifischen Verbindungen zwischen diesen Zellen im Gehirn zu bestätigen. Dies wird erreicht, indem zunächst die prämotorischen Schaltkreise retrograd mit einem transsynaptischen viralen Vektor infiziert werden, der peripher über den Muskel appliziert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die infizierten Zellen mittels fluoreszenzmikroskopischer Lichtmikroskopie sichtbar zu machen.Der dritte Schritt besteht darin, spezifische Verbindungen im Gehirn zu bestätigen, indem monosynaptische Tracer in zuvor identifizierte Knotenpunkte eines prämotorischen Schaltkreises injiziert werden. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, wie Zellen in einem verteilten prämotorischen Netzwerk über eine Kombination aus transsynaptischem viralem Tracing und traditionellen monosynaptischen neuroanatomischen Techniken miteinander verbunden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem traditionellen monosynaptischen neuroanatomischen Tracing besteht darin, dass die Knotenpunkte eines verteilten neuronalen Netzwerks identifiziert und die spezifischen Verbindungen zwischen den Zellen dieses Netzwerks an einem anästhesierten Mausmodell aufgeklärt werden können.Bereiten Sie die Operationsstelle vor, indem Sie das Haar abschneiden und die Haut mit mindestens drei abwechselnden Einreibungen mit Betadine und 70 %igem Alkohol desinfizieren. Führen Sie nun einen Hautschnitt im Halsbereich durch und legen Sie den Muskel von Interesse frei. Um beispielsweise auf den krikothyreoiden Kehlkopfmuskel zuzugreifen, ist es notwendig, zunächst den daraufliegenden Teil des Sternohyoidmuskels zu entfernen und durchtrennte Muskeln mit dem Gewebekleber Vet Bond zu versiegeln.Laden Sie als Nächstes das 10-Mikroliter-Nanofüll-Mikrospritzensystem mit frisch aufgetauter PR-RV-Lösung auf. Entfernen Sie langsam die Totraumflüssigkeit und vergewissern Sie sich, dass die Lösung an der Mikrospritzen Spitze austritt. Entsorgen Sie die Flüssigkeit als biohazardösen Abfall und befestigen Sie die Spritze vorsichtig am stereotaktischen Gerät.Platzieren Sie mit Hilfe der Mikropositioniervorrichtung die Nadelspitze vorsichtig in dem gewünschten Muskel. Füllen Sie den Muskel dann langsam, bis eine leichte Schwellung sichtbar ist. Bewegen Sie nun die Spritze zu dem nächsten interessierenden Muskel, im vorliegenden Fall zum lateralen cricoarytenoideus, und wiederholen Sie den Vorgang.Das Injektionsverfahren durchsticht lediglich jeden Muskel. Die Injektionsgeschwindigkeit variiert je nach Größe des Muskels und dem zu injizierenden Volumen. Zum Beispiel sollten fünf Injektionen von jeweils 200 Nanolitern mit einer Geschwindigkeit von vier Nanolitern pro Sekunde im Abstand von einer Minute an derselben Stelle vorgenommen werden, um den Musculus cricothyroideus zu füllen.Nach dem Zurückziehen der Mikrospritze versiegeln Sie die Unterbrechung der Faszie mit dem Gewebekleber Vet Bond. Sobald alle Injektionen abgeschlossen sind, schließen Sie die Wunde mit dem Gewebekleber Vet Bond. Überwachen Sie das Tier, bis es in Sternumliegeposition geht.Dann verabreichen Sie nach den Vorgaben der Richtlinien Ihrer Institution Analgetika, Futter, Wasser und die erforderliche Pflege. Das Verfahren zur Analyse der EGFP-Expression und der PRV-infizierten Neuronen ist in der schriftlichen Anleitung ausführlich beschrieben.Die Gewebeaufbereitung ähnelt stark der, die später in diesem Video beschrieben wird. Beginnen Sie damit, eine erwachsene Maus zu anesthetisieren, wobei die Augen geschützt und die Kopfposition fixiert werden. Bereiten Sie anschließend den Operationsbereich wie zuvor beschrieben durch abwechselndes Einreiben mit Betadine und 70 %igem Alkohol vor.Führen Sie nun einen Hautschnitt an der Kopfhaut durch und klappen Sie die Kopfhaut über dem Gehirn zurück. Bereich von Interesse. Führen Sie mit dem Bohrer an den entsprechenden stereotaktischen Koordinaten eine kleine Kraniotomie durch.Beispielsweise liegen die Koordinaten für den laryngealen verbundenen motorischen Kortex, der mittels PRV-Tracing in einer erwachsenen Maus identifiziert wurde, 1,2 Millimeter lateral und 0,2 Millimeter rostral zur bgma. Bereiten Sie anschließend eine 7,5%-ige Lösung von biotinylierten Dextranaminen in steriler Wasser vor. Füllen Sie dann das NanoJet-Zwei-Mikropipettensystem mit ausreichend BDA-Lösung für die geplanten Injektionen.Löschen Sie langsam den Totraum und vergewissern Sie sich, dass die Lösung die Mikropipettenspitze verlässt. Senken Sie mithilfe des Mikropositioniergeräts die Mikropipettenspitze vorsichtig in die gewünschte Hirnregion ab und injizieren Sie langsam die BDA-Lösung. Passen Sie die Injektionsgeschwindigkeit je nach Größe der zu markierenden Region an.Zum Beispiel sollten 12 Injektionen von jeweils 4,6 Nanolitern an vier verschiedenen Stellen durchgeführt werden, die jeweils 0,2 Millimeter voneinander entfernt liegen, um den laryngeal verbundenen motorischen Kortex in einer erwachsenen Maus abzudecken.Das endgültige Injektionsvolumen sollte entsprechend der Größe des interessierenden Bereichs angepasst werden. Beachten Sie, dass die Markierung vom Injektionskern durch das Hirngewebe und entlang der Fortsätze markierter Neuronen diffundieren kann. Reinigen und benetzen Sie die Kraniotomie mit steriler Kochsalzlösung und verschließen Sie die Kopfhautwunde mit Vet-Bond-Gewebekleber.Überwachen Sie das Tier, bis es in Sternumlage geht. Danach verabreichen Sie Analgetika sowie Nahrung, Wasser und die gemäß den Richtlinien Ihrer Institution erforderliche Pflege.Sechs Tage später kann das Cholera-Toxin-Untereinheit B in den Muskel des Tieres injiziert werden. Drei Tage darauf sollte das Tier zur Analyse getötet werden. Schneiden Sie Schnitte mit 40 Mikrometern Dicke an einem Kryostaten und bewahren Sie die schwimmenden Schnitte in 0,1 molarem PBS auf. Quenchen Sie die Schnitte durch 30-minütiges Schütteln in 0,3 % Wasserstoffperoxid in PBS, wobei sie vor Licht geschützt werden müssen.Die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur in frisch zubereiteter A b, C-Lösung umsetzen. Danach die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in Phosphatpuffer waschen.Anschließend entwickeln Sie die Schnitte acht Minuten lang unter Rühren in Phosphatpuffer, pH 7,4, der DAB, Wasserstoffperoxid und Nickelchlorid enthält. Das Reaktionsprodukt von DAB in den Zellen sollte schwarz erscheinen.Blockieren Sie anschließend die Schnitte unter Schütteln für 30 Minuten in PBS, das 0,3 % Tween 20 und normales Kaninchenserum aus dem Vector Stain Elite Kit enthält. Inkubieren Sie danach die blockierten Schnitte unter Schütteln zwei Stunden bei Raumtemperatur mit Ziegen-Anti-CTB. Waschen Sie anschließend die Schnitte dreimal erneut in PBS, jeweils fünf Minuten pro Waschgang.Die sekundären Antikörper aus Kaninchen aus dem VE-Kit auf die Schnitte auftragen und eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren. Die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen und anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur in frisch zubereiteter A, b, C-Lösung umsetzen. Die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in Phosphatpuffer waschen und anschließend acht Minuten lang inkubieren.Im Entwickler sollte das DAB-Reaktionsprodukt innerhalb der Zellen braun erscheinen. Nun bringen Sie die Schnitte auf Super-Frost-Plus-Objektträgern auf, dehydrieren das Gewebe durch eine alkoholische Abstufung und führen anschließend zwei Klärungsschritte in Xylol durch. Danach decken Sie die Objektträger mit Paraffin ab und führen die Bildgebung durch.Die Färbung für EGFP sollte 72 Stunden nach der Injektion von P RV 1 52 schwache Signale in primären motorischen Neuronen zeigen, wobei die Färbung nach 90 Stunden deutlich intensiver wird. Dieser Nucleus ambiguous, der die laryngealen motorischen Neuronen enthält, ist 94 Stunden nach der Injektion von P RV 1 52 in zwei der sieben laryngealen Muskeln sichtbar. Dies geschieht, weil das Virus über Neuronen in das Gehirn eingedrungen ist, die die infizierten Muskeln innervieren.Andere motorische Kerngebiete wie der Nucleus hypoglossus exprimieren nach 90 Stunden kein EGFP. EGFP ist in Nervenzellen zweiter Ordnung sichtbar. Diese Hirnstammneurone wurden nach der primären Infektion im Nucleus ambiguus angefärbt.Die Injektion war einseitig, und das resultierende Markierungsmuster im Hirnstamm zeigt eine Infektion des ipsilateralen Nucleus. Auch die retikulären Interneurone des Nucleus ambiguous und des Nucleus solitarius waren infiziert und färbten sich stark für EGFP. Diese Interneurone verbinden verschiedene Strukturen, einschließlich der motorischen Neuronenkerne des Nervus accessorius und des kontralateralen Nucleus ambiguous.Doch ihre efferenten Zielstrukturen bleiben unbezeichnet, da das Virus sich nur in retrograder Richtung ausbreitet. Die Überlebenszeit mit PRV ist begrenzt, kann jedoch EGFP-Färbung in Zellen dritter und höherer Ordnung zeigen, die von prämotorischen Neuronen in der motorischen Großhirnrinde infiziert wurden, wobei EGFP kontralateral zur peripheren Injektionsstelle exprimiert wurde. Vermutlich wurden nur diejenigen Zellpopulationen infiziert, die die motorische kortikale Repräsentation der Larynxmuskulatur bilden.BDA-markierte Axone auf der Ebene des Nucleus ambiguous, die durch Pfeilspitzen gekennzeichnet sind, kontaktieren die CTB-positiven Motoneurone, die retrograd durch Injektionen in die Kehlmuskulatur gefärbt wurden und in brauner Farbe erscheinen; die Axone bilden Varikositäten und putative terminale Batons in der Nähe der Dendriten der Kehlmotoneurone sowie in der Nähe des Soma der Kehlmotoneurone aus. Weitere Experimente unter Verwendung der Elektronenmikroskopie oder der Elektrophysiologie sind erforderlich, um zu bestimmen, ob diese Varikositäten synaptische Kontaktstellen darstellen. Eine bilaterale Injektion von BDA, die in den laryngealverbundenen motorischen Kortex vorgenommen wurde, ist in schwarz zu sehen; da BDA nicht richtungsspezifisch ist, können sowohl afferente als auch efferente Verbindungen markiert werden.Beispielsweise sind im Thalamus sowohl ein Projektionsfeld mit anterogradem Marker als auch Zellkörper mit retrogradem Marker zu sehen. Thalamische Zellen werden durch den Pfeil markiert, und die Capsula interna ist zur Orientierung gekennzeichnet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Pseudorabiesvirus und DAB äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Sterilisation erforderlich sind.Alle Materialien, die mit PRV oder DAB in Kontakt gekommen sind, wurden mit einer 10%igen Bleichlösung behandelt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte stets eine angemessene Entsorgung von biohazardösen festen und flüssigen Abfällen gemäß den Vorschriften Ihrer Institution erfolgen.

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Unter Ausnutzung einer binären genetischen Strategie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verfolgung neuronaler Schaltkreise in Mäusen zur Verfügung, die komplementäre transsynaptische Tracer nach Cre-vermittelter Rekombination exprimieren. Da die zellspezifische Tracerproduktion genetisch kodiert ist, ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung des embryonalen Gehirns von Mäusen mit einer Einzelzellauflösung...

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Wir beschreiben eine Technik, um Neuronen und ihre Prozesse über anterograden oder retro Tracer Injektionen in Hirnkernen unter Verwendung eines in vitro-Präparat zu bezeichnen. Wir modifiziert eine vorhandene Methode der i n vitro Tracer Elektroporation durch die Nutzung von fluoreszenzmarkierte Mausmutanten und grundlegende optische Geräte, um die Kennzeichnung Genauigkeit zu erhöhen.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion selektiver neuronaler Populationen, etikettiert folgende retrograden Infektion mit einem modifizierten Tollwutvirus Fluoreszenzmarker exprimieren, und unabhängig, unvoreingenommen Clusteranalysen, umfassende Charakterisierung der morphologischen Metriken unter verschiedene neuronale Subklassen ermöglichen.

Großflächige Rekonstruktionen und Independent, Unvoreingenommene Clustering Basierend auf Morphologische Metriken Klassifizieren Neurons in Selective Populations

Hier präsentieren wir Ihnen eine raffinierte Protokoll um effektiv biotinylierte Dextran Amin (BDA) Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Färbung Methode durch eine wechselseitige neuronale Weg zu offenbaren. Es ist geeignet für die Analyse der Feinstruktur des BDA Etikettier- und unterscheidet sie von anderen neuralen Elemente unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop.

Verbesserung der Anwendung des hochmolekularen Biotinylierte Dextran Amin für Thalamocortical Projektion Tracing in der Ratte

Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

Das aktuelle Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Rückverfolgung von ventralen Tegmentalflächen (VTA) Glutamatprojektionen auf den Hippocampus. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen wurde mit CA1-Aufnahmen kombiniert, um zu zeigen, wie VTA-Glutamat-Terminals die mutmaßliche pyramidale CA1-Feuerrate in vivo modulieren.

Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Unter Verwendung transgener fluoreszierender Mäuse werden detaillierte Protokolle beschrieben, um den axonalen Transport von Signalendosomen und Mitochondrien innerhalb motorischer und sensorischer Axone des intakten Ischiasnervs bei lebenden Tieren in vivo zu beurteilen.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Die serielle Zwei-Photonen-Tomographie (STPT) ist eine Technik, bei der eine Gewebemasse in ihrer dreidimensionalen Form abgebildet wird, indem die Zwei-Photonen-Bildgebung mit der automatischen Tischsteuerung und dem Mikrotom-Schneiden kombiniert wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Implementierung für Weißbüschelaffengehirne, um ihre strukturellen Merkmale besser zu verstehen.

Serielle Zwei-Photonen-Tomographie des gesamten Weißbüschelaffen-Gehirns für neuroanatomische Analysen

Erfahren Sie die transsynaptische Tracing-Methode mit Pseudorabies-Virus zur Kartierung zentraler prämotorischer Netzwerke, die periphere Ziele regulieren. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung neuronaler Schaltkreise im Gehirn.

Transsynaptische Tracing von Peripherie Targets mit Pseudorabies-Virus durch Cholera Toxin und biotinyliertes Dextran Amine Doppelmarkierung Gefolgt (Video) | JoVE Journal

Transsynaptische Tracing von Peripherie Targets mit Pseudorabies-Virus durch Cholera Toxin und biotinyliertes Dextran Amine Doppelmarkierung Gefolgt

Weitere Videos entdecken