Transsynaptische Tracing von Peripherie Targets mit Pseudorabies-Virus durch Cholera Toxin und biotinyliertes Dextran Amine Doppelmarkierung Gefolgt
14. September 2015
Transsynaptisches Tracing ist zu einem mächtigen Werkzeug für die Analyse zentraler Efferenten geworden, die periphere Ziele durch multisynaptische Schaltkreise regulieren. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das das transsynaptische Pseudotollwutvirus ausnutzt, um einen funktionsfähigen Gehirnschaltkreis zu identifizieren und zu lokalisieren, gefolgt von klassischen Traktverfolgungstechniken, um spezifische Verbindungen im Schaltkreis zwischen identifizierten Gruppen von Neuronen zu validieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das zentrale prämotorische Netzwerk der verteilten Zellen zu entdecken, die auf ein bestimmtes peripheres Ziel treffen, und dann die spezifischen Verbindungen zwischen diesen Zellen im Gehirn zu bestätigen. Dies wird erreicht, indem zunächst die prämotorischen Schaltkreise retrograd mit einem transsynaptischen viralen Vektor infiziert werden, der peripher durch den Muskel abgegeben wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die infizierten Zellen mit einer Lichtfluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen.
Der dritte Schritt besteht darin, spezifische Verbindungen im Gehirn zu bestätigen, indem monos-synaptische Tracer injiziert werden, die auf zuvor identifizierte Knoten in einem prämotorischen Schaltkreis abzielen. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, wie Zellen in einem verteilten prämotorischen Netzwerk durch eine Kombination aus transsynaptischer Virusverfolgung und traditionellen monossynaptischen neuroanatomischen Techniken miteinander verbunden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem traditionellen monos-synaptischen Neurotracing besteht darin, dass die Knoten eines verteilten Neuronetzwerks identifiziert werden können und die spezifischen Verbindungen zwischen Zellen in diesem Netzwerk an einer anästhesierten Maus aufgelöst werden können.
Bereiten Sie die Operationsstelle vor, indem Sie die Haare kürzen und die Haut mit mindestens drei abwechselnden Peelings mit Betadin und 70% Alkohol desinfizieren. Machen Sie nun einen Hautschnitt im Rachenbereich und legen Sie den interessierenden Muskel frei. Um beispielsweise Zugang zum Krippenkehlkopfmuskel zu erhalten, ist es notwendig, zuerst den darüber liegenden Teil des Zungenbeinmuskels Sterno zu entfernen und alle durchtrennten Muskeln mit Vet Bond Gewebekleber zu versiegeln.
Laden Sie anschließend das 10-Mikroliter-Nanofill-Mikrospritzensystem mit frisch aufgetauter PR RV-Lösung. Reinigen Sie langsam den Totraum und vergewissern Sie sich, dass die Lösung aus der Mikrospritzenspitze austritt. Entsorgen Sie die Flüssigkeit als biologisch gefährlichen Abfall und montieren Sie sie vorsichtig auf dem stereotaktischen Gerät.
Platzieren Sie die Nadelspitze mit der Mikropositionierungsvorrichtung vorsichtig in den interessierenden Muskel. Dann füllen Sie den Muskel langsam, bis eine leichte Schwellung sichtbar wird. Bewegen Sie nun die Spritze zum nächsten interessierenden Muskel, in diesem Fall dem lateralen Cricoarytenoid, und wiederholen Sie den Vorgang.
Bei der Injektion wird nur jeder Muskel punktiert. Einmal variiert die Injektionsrate je nach Größe des Muskels und dem zu injizierenden Volumen. Zum Beispiel sollten fünf Injektionen von 200 Nanolitern im Abstand von vier Nanolitern pro Sekunde im Abstand von einer Minute an derselben Stelle durchgeführt werden, um den Konikothyreosemuskel zu füllen.
Nach dem Zurückziehen der Mikrospritze den Bruch in der Faszie mit Vet Bond Tissue Adhesive verschließen. Sobald alle Injektionen abgeschlossen sind, verschließen Sie die Wunde mit Vet Bond Tissue-Kleber. Überwachen Sie das Tier, bis es das Brustbein liegend zeigt.
Stellen Sie dann Analgesie, Futter, Wasser und Pflege bereit, wie es Ihr Heimtier benötigt. Verwenden Sie die Richtlinien. Das Verfahren zur Analyse der EGFP-Expression und PRV-infizierter Neuronen wird im Textprotokoll ausführlich behandelt.
Die Gewebeaufbereitung ist der weiter unten in diesem Video behandelten sehr ähnlich. Beginnen Sie damit, eine erwachsene Maus zu betäuben, ihre Augen zu schützen und die Position ihres Kopfes zu fixieren. Bereiten Sie dann die Operationsstelle, wie zuvor beschrieben, abwechselnd mit Betadin und 70% Alkohol vor.
Machen Sie nun einen Schnitt in der Kopfhaut und ziehen Sie die Kopfhaut über das Gehirn zurück. Region von Interesse. Führen Sie eine kleine Kraniotomie mit dem Bohrer an den entsprechenden stereotaktischen Koordinaten durch.
Zum Beispiel liegen die Koordinaten für den mit dem Kehlkopf verbundenen motorischen Kortex, der durch PRV-Tracing bei einer erwachsenen Maus identifiziert wurde, 1,2 Millimeter lateral und 0,2 Millimeter rostral zum bgma. Bereiten Sie anschließend eine 7,5%ige Lösung aus biotinylierten Dextranaminen in sterilem Wasser vor. Beladen Sie dann das nano jet two micro pipettensystem mit ausreichend BDA-Lösung für die geplanten Injektionen.
Beseitigen Sie langsam den Totraum und vergewissern Sie sich, dass die Lösung aus der Mikropipettenspitze austritt. Senken Sie die Mikropipettenspitze mit dem Mikropositionierungsgerät vorsichtig in die gewünschte Gehirnregion ab und injizieren Sie langsam die BDA-Lösung. Passen Sie die Rate je nach Größe des zu beschriftenden Bereichs an.
Zum Beispiel sollten 12 Injektionen von 4,6 Nanolitern an vier verschiedenen Stellen im Abstand von 0,2 Millimetern durchgeführt werden. Stro verhätscheln, um den mit dem Kehlkopf verbundenen motorischen Kortex bei einer erwachsenen Maus abzudecken.
Das endgültige Injektionsvolumen sollte entsprechend der Größe des interessierenden Bereichs angepasst werden. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Markierung vom Injektionskern durch das Hirngewebe und entlang der Prozesse der markierten Neuronen diffundieren kann. Reinigen und befeuchten Sie die Kraniotomie mit steriler Kochsalzlösung und verschließen Sie die Kopfhautwunde mit Vet Bond Tissue Adhesive.
Überwachen Sie das Tier, bis es das Brustbein liegend zeigt. Stellen Sie dann Analgesie, Futter, Wasser und Pflege bereit, wie es Ihr Heimtier benötigt. Verwenden Sie die Richtlinien.
Sechs Tage später kann das Choleratoxin Untereinheit B in den Muskel des Tieres injiziert werden. In drei Tagen sollte das Tier dann für die Analyse geopfert werden. Schneiden Sie Schnitte bei 40 Mikrometern auf einem Kryostaten und speichern Sie Schwimmabschnitte in 0,1 molaren PBS. Abschrecken Sie die Schnitte mit 0,3 % Wasserstoffperoxid in PBS 30 Minuten lang unter Schütteln und vor Licht geschützt ab.
Waschen Sie die Abschnitte dreimal fünf Minuten lang pro Waschgang in PBS. Dann reagieren sie eine Stunde lang in frisch zubereiteter A, B, C-Lösung bei Raumtemperatur. Waschen Sie nun die Abschnitte dreimal pro Waschgang 10 Minuten lang in Phosphatpuffer.
Dann entwickeln Sie die Schnitte acht Minuten lang unter Rühren in Phosphatpuffer. pH 7,4 mit DAB-Wasserstoffperoxid und Nickelchlorid. Das DAB-Reaktionsprodukt in den Zellen sollte schwarz erscheinen.
Blockieren Sie anschließend die Abschnitte unter 30-minütigem Schütteln in PBS mit 0,3 % Tween 20 mit normalem Kaninchenserum aus dem Vector Stain Elite Kit. Als nächstes inkubieren Sie die blockierten Abschnitte in Ziegen-Anti-CTB unter Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Abschnitte dann noch dreimal für fünf Minuten pro Waschgang in PBS.
Tragen Sie den Kaninchen-Antigo-Sekundärantikörper aus dem VE-Kit auf und inkubieren Sie die Schnitte unter einstündigem Schütteln bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Abschnitte dreimal pro Waschgang fünf Minuten lang in PBS und reagieren Sie dann 30 Minuten lang in frisch zubereiteter A-, B-, C-Lösung bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Schnitte dreimal 10 Minuten lang in Phosphatpuffer und inkubieren Sie die Schnitte acht Minuten lang.
In der Entwicklungslösung sollte das DAB-Reaktionsprodukt im Inneren der Zellen braun erscheinen. Montieren Sie nun die Schnitte auf Superfrösten plus Objektträger auf die Objektträger, dehydrieren Sie das Gewebe durch abgestufte Alkoholserien, gefolgt von zwei Reinigungswaschungen in Xylol. Decken Sie dann die Objektträger mit Paramount ab und fahren Sie mit der Bildgebung fort.
Die Färbung auf EGFP sollte 72 Stunden nach der Injektion von P RV 1 52 beginnen, ein schwaches Signal in primären Motoneuronen zu zeigen, wobei die Färbung nach 90 Stunden robust wird. Dieser Nucleus ambiguous, in dem sich die Kehlkopfmotoneuronen befinden, ist 94 Stunden nach der Injektion von P RV 1 52 in zwei der sieben Kehlkopfmuskeln zu sehen. Denn das Virus gelangte über Neuronen, die die infizierten Muskeln innervieren, in das Gehirn.
Andere atorische Motoneuronenpools, wie z. B. der Nucleus hypoglossus, exprimieren nach 90 Stunden kein EGFP. EGFP ist in Zellen zweiter Ordnung zu sehen. Diese Hirnstammneuronen wurden nach der Primärinfektion im Zellkern mehrdeutig gefärbt.
Die Injektion erfolgte einseitig und das resultierende Markierungsmuster im Hirnstamm zeigt eine Infektion des ipsilateralen Kerns. Mehrdeutige und solitäre retikuläre Interneurone des Kerns wurden ebenfalls infiziert und färbten sich stark für EGFP. Diese Interneuronen verbinden verschiedene Strukturen, einschließlich der atorischen Motoneuronenpools und des kontralateralen Kerns. Zweideutig.
Ihre efferenten Ziele bleiben jedoch unmarkiert, da sich das Virus nur in retrograder Richtung ausbreitet. Die Überlebenszeit mit PRV ist begrenzt, kann aber eine EGFP-Färbung in Zellen dritter und höherer Ordnung zeigen, die prämotorische Neuronen im motorischen Kortex exprimieren, die EGFP kontralateral zur peripheren Injektionsstelle exprimieren. Vermutlich war nur die Population von Zellen infiziert, die die motorische kortikale Repräsentation der Kehlkopfmuskulatur bildeten.
BDA-markierte Axone auf der Ebene des Kerns, die mehrdeutig sind und durch Pfeilspitzen gekennzeichnet sind, nehmen Kontakt mit den CTB-positiven Motoneuronen auf, die durch Injektionen in die Kehlkopfmuskulatur retrograd gekennzeichnet sind, die in Braun zu sehen sind. Die Axone bilden Varikositäten und mutmaßliche terminale Stäbe in der Nähe der Dendriten der Kehlkopfmotoneuronen und in der Nähe des Somas der Kehlkopfmotoneuronen. Weitere Experimente mittels Elektronenmikroskopie oder Elektrophysiologie sind erforderlich, um festzustellen, ob diese Krampfadern synaptisch sind. Eine bilaterale Injektion von BDA, die in den mit dem Kehlkopf verbundenen motorischen Kortex platziert wird, ist schwarz zu sehen, da BDA nicht richtungsspezifisch ist, können sowohl afferente als auch efferente Verbindungen markiert sein.
Zum Beispiel sind sowohl ein Projektionsfeld mit anterograder Markierung als auch Zellkörper, die retrograd markiert sind, im Thalamus zu sehen. Thalamuszellen sind durch die Pfeilspitze gekennzeichnet und die innere Kapsel ist zur Orientierung markiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Pseudotollwutviren und DAB äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Sterilisieren.
Alle Materialien, die mit PRV oder DAB in Berührung gekommen sind, verwenden eine 10%ige Bleichlösung. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte immer eine angemessene Entsorgung von biogefährlichen festen und flüssigen Abfällen gemäß den Vorschriften Ihrer Einrichtung erfolgen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Analyse zentraler Efferenzen vor, die periphere Zielstrukturen über mehrsynaptische Schaltkreise regulieren, unter Verwendung einer transsynaptischen Tracing-Methode. Die Methode nutzt ein transsynaptisches Pseudorabies-Virus, um Gehirnschaltkreise zu identifizieren und zu lokalisieren, gefolgt von klassischen Tractus-Tracing-Techniken zur Validierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neuroanatomie
- Virale Tracing-Methoden
Hintergrund
- Das transsynaptische Tracing ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Kartierung neuronaler Schaltkreise.
- Die Verwendung viraler Vektoren ermöglicht die Identifizierung verteilter neuronaler Netzwerke.
- Klassische Tractus-Tracing-Methoden liefern die Validierung von Verbindungen.
- Diese Methode verbessert das Verständnis prämotorischer Netzwerke und ihrer peripheren Zielstrukturen.
Zweck der Studie
- Um das zentrale prämotorische Netzwerk von Zellen zu entdecken, die spezifische periphere Bereiche ansprechen.
- Um spezifische Verbindungen zwischen identifizierten Neuronen im Gehirn zu bestätigen.
- Um eine Kombination aus viraler Tracer-Technik und traditionellen Methoden für eine umfassende Kartierung zu nutzen.
Verwendete Methoden
- Retrograde Infektion prämotorischer Schaltkreise mithilfe eines transsynaptischen viralen Vektors.
- Sichtbarmachung infizierter Zellen durch fluoreszenzmikroskopische Lichtmikroskopie.
- Injektion monosynaptischer Tracer zur Bestätigung von Verbindungen im Gehirn.
- Analyse der Konnektivität innerhalb eines verteilten prämotorischen Netzwerks.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von Knoten im prämotorischen Netzwerk.
- Visualisierung spezifischer Verbindungen zwischen Neuronen.
- Aufzeigen der Vorteile der transsynaptischen Verfolgung im Vergleich zu traditionellen Methoden.
- Erkenntnisse zur Organisation prämotorischer Schaltkreise, die periphere Zielstrukturen beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bildet effektiv komplexe neuronale Schaltkreise ab.
- Die transsynaptische Verfolgung ermöglicht ein klareres Verständnis der neuronalen Vernetzung.
- Dieser Ansatz kann auf verschiedene Studien neuronaler Netzwerke angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern in der Biopharmazeutik, verteilte prämotorische Netzwerke abzubilden, die periphere Zielstrukturen regulieren, und unterstützt so die Zielvalidierung bei der Entdeckung neurotherapeutischer Wirkstoffe. Durch die Kombination von transsynaptischem viralem Tracing mit klassischer neuroanatomischer Markierung wird die mechanistische Entschärfung zentraler Schaltkreishypothesen, die die periphere Physiologie beeinflussen, verbessert. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er die synaptische Konnektivität innerhalb funktional definierter Netzwerke aufklärt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem zentrale prämotorische Neurone identifiziert werden, die synaptisch mit peripheren Effektorstellen verbunden sind.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch retrograde transsynaptische Verfolgung von peripheren Muskelinjektionsstellen aus.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem die hierarchische Organisation verteilter neuronaler Netzwerke geklärt wird, die die periphere Physiologie modulieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte neuronale Populationen für die nachgeschaltete Untersuchung von Substanzen vor, die die zentral-periphere Schaltkreismodulation beeinflussen.
- Operativer Wert: Standardisiert die verbindungsspezifische Markierung mittels Doppelmarkierung mit BDA und CTb und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die erneute Nutzung der Plattform zur Kartierung mehrerer peripherer Zielstrukturen unter Verwendung identischer Tracer-Workflows.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Zuordnung von Schaltkreisen im Entdeckungsstadium mit der präklinischen Validierung, indem monosynaptische Verbindungen zwischen identifizierten prämotorischen Knoten und peripheren Zielstrukturen bestätigt werden.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Verringert die Unschärfe in Modellen zentraler Schaltkreise, indem geklärt wird, ob markierte Neurone direkte oder indirekte Verbindungen mit peripheren Effektoren eingehen.
- Krankheitsrelevanz: Unterstützt Untersuchungen zu neuromuskulären Erkrankungen, autonomen Regulationsstörungen und Pathologien der motorischen Kontrolle, bei denen die Integrität zentral-peripherer Schaltkreise entscheidend ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Entdeckung über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten bis hin zur präklinischen Validierung und ermöglicht eine iterative Verbesserung zentraler Schaltkreisziele, die die periphere Physiologie modulieren.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Identifizierung verteilter prämotorischer Netzwerke mittels retrograder transsynaptischer Virusmarkierung von peripheren Stellen aus.
- Screening: Ermöglicht die Versuchsbereitschaft durch standardisierte, quantitative Markierung synaptischer Verbindungen unter Verwendung von BDA und CTb mit DAB-Nachweis.
- Analytik: Erzeugt multiplexe Messgrößen (eGFP, BDA, CTb), die einen vergleichenden Analysen der Verbindungsstärke und -spezifität über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Ergebnisse der Virusmarkierung mit der präklinischen Kontinuität, indem monosynaptische Verbindungen zwischen zentralen Neuronen und peripheren Zielstrukturen validiert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Kapazität zur Abbildung zentral-peripherer Schaltkreise über mehrere Krankheitsmodelle und Target-Validierungskampagnen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in den Beziehungen zwischen zentralen Schaltkreisen und peripheren Effektoren reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch eine Doppellabel-Validierung transsynaptisch verfolgter Verbindungen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine Auflösung auf Schaltkreisebene bereitgestellt wird, die Strategien zur gezielten Beeinflussung zentraler Strukturen entrisst.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf bestätigter Stärke und Spezifität der zentral-peripheren Konnektivität.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Virusneurowissenschaft, stereotaktischen Chirurgie und neuroanatomischen Tracing-Techniken.
- Setzt eine Biosicherheitsinfrastruktur für die Handhabung von PRV152 und gefährlichen, auf DAB basierenden Nachweischemikalien voraus.
- Erfordert standardisierte Perfusions-, Schnitt- und immunhistochemische Protokolle zwischen verschiedenen Laboren, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung auf nicht-nagende Tiermodelle aufgrund der Wirtsspezifitätseinschränkungen von PRV.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die zeitlichen Überlebensbeschränkungen mit PRV sowie mögliche unspezifische Markierungen durch BDA-Diffusion entlang neuronaler Fortsätze.
