Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, nanoporöse Gold-Mikromuster herzustellen und ihre Verträglichkeit mit Zellkulturen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Schablonen- oder fotolithografische Masken erstellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Gold und Silber durch die Masken zu sputtern, um die Vorläuferlegierung für nanoporöses Gold zu strukturieren.

Als nächstes werden die Gold-Silber-Legierungsmuster in Salpetersäure delegiert, um nanoporöse Goldbeschichtungen herzustellen. Der letzte Schritt besteht darin, Zellen über die nanoporösen Goldmikromuster zu kultivieren und sie immunzu färben; schließlich werden Fluoreszenz- und Rasterelektronenmikroskopie in Verbindung mit der Bildanalyse verwendet, um Zellmaterialinteraktionen zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden zur Herstellung nanostrukturierter Beschichtungen, wie z. B. Kohlenstoffnanoröhren, besteht darin, dass nanoporöses Gold von der Kompatibilität der Mikrofabrikation, der hohen effektiven Oberfläche, der einfachen Funktionalisierung mit kachelbasierter Chemie, der elektrischen Leitfähigkeit und der Biokompatibilität profitiert.

Diese Methode kann Schlüsselfragen in den Materialwissenschaften und Bioingenieurwissenschaften beantworten, wie z. B. die Wirkung der Nanostruktur von Materialien auf elektrische, mechanische, biologische und chemische Eigenschaften. Diese Methode gibt jedoch Aufschluss über die Wirkung der Nanostruktur auf die Zellmorphologie. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Entwicklung von Biosensoren, Medikamentenverabreichungssystemen und Energiespeicherplattformen.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie einen x drei Zoll großen Objektträger und kleine Deckgläser mit einer Piranha-Lösung reinigen, die kleinen Deckgläser in ein Porzellan-Immunfärbeschiffchen legen und das Boot und den Objektträger in die Piranha-Lösung tauchen. Einzelheiten zum Reinigungsverfahren finden Sie im Textprotokoll. Nach der Reinigung werden die Proben in Kristallisationsschalen umgefüllt und drei Minuten lang mit Wasser abgespült.

Legen Sie die Proben auf fusselfreie Handtücher und föhnen Sie sie mit einer Stickstoffpistole, um Muster im Millimetermaßstab zu erzeugen. Stanzen Sie 250 Mikrometer dicke Silikonelastomerplatten mit einer Biopsiestanze. Reinigen Sie die verarbeiteten Elastomerplatten, indem Sie sie in 70%iges Isopropanol tauchen und anschließend mit einer Stickstoffpistole trocknen.

Legen Sie dann das Lochblatt auf ein fusselfreies Handtuch und richten Sie die gereinigten Deckgläser über der Schablone so aus, dass die Musterfläche der Schablone zugewandt ist. Übertragen Sie die Schablone mit den Deckgläsern auf einen Trägerwafer, um Muster im Submillimeterbereich zu erstellen. Stellen Sie ein gereinigtes Mikroskop auf, schieben Sie es auf ein rotierendes Futter und blasen Sie alle Partikel mit einer Stickstoffpistole ab.

Sie 1,5 Milliliter Hexamethyldilan auf den Objektträger. Verteilen Sie das Hexamethyldilan mit einer Kunststoffpipette, indem Sie den Objektträger nacheinander fünf Sekunden lang mit 500 U/min und 30 Sekunden lang mit 1500 U/min drehen. Wenn du fertig bist, backst du die Folie auf einer heißen Platte bei 115 Grad Celsius sieben Minuten lang und lässt sie dann fünf Minuten abkühlen.

Geben Sie als Nächstes vier Milliliter eines positiven Fotos ab. Resistieren Sie auf dem Glasschieber. Verteilen Sie den Fotolack, indem Sie die Folie unter den zuvor beschriebenen Bedingungen drehen.

Die Folie auf einer heißen Platte bei 115 Grad Celsius 1,5 Minuten backen und nach der UV-Einwirkung und dem Backen herausnehmen. Löse das belichtete Foto auf. Widerstehen Sie, indem Sie das Dia in ein positives Foto eintauchen.

Widerstehen Sie dem Entwickler mindestens 3,5 Minuten lang. Wenn Sie fertig sind, spülen Sie den Objektträger gründlich mit DI-Wasser ab und untersuchen Sie die entwickelten Muster unter einem Lichtmikroskop. Laden Sie anschließend die Proben in eine Sputtermaschine, die unabhängig voneinander Gold-, Silber- und Chromsputter abscheiden kann.

Reinigen Sie die Proben 90 Sekunden lang bei 50 Watt unter einer 25 Millitorr Argonnen-Verarbeitungsatmosphäre, bevor Sie die Metallabscheidung unter 10 Millitorr Argonnen-Sputter-Chrom für 10 Minuten bei 300 Watt beginnen. Dann stottern Sie 90 Sekunden lang Gold bei 400 Watt, gefolgt von Co-Sputtern von Gold und Silber für 10 Minuten mit Silber bei 200 Watt und Gold bei 100 Watt. Schalten Sie die Gold-Sputterquelle etwa 10 Sekunden vor dem Ausschalten der Silber-Sputterquelle aus.

Entnehmen Sie die Proben aus der Sputtermaschine, nachdem Sie die Proben aus der Sputtermaschine entnommen haben. Beschallen Sie sie in etwa 180 Millilitern eines Positivfotos. Resistieren Sie den für 10 Zyklen der 22. Beschallung mit zweiminütigen Pausen zwischen den Zyklen.

Wenn Sie fertig sind, spülen Sie die Proben mit Wasser ab und trocknen Sie sie mit einer Stickstoffpistole. Untersuchen Sie die Metallmuster unter dem Mikroskop. Ziehen Sie dann die Elastomerschablone mit einer Pinzette von den nicht mit Fotolack beschichteten Proben ab, um das abgeschiedene Metall freizulegen.

Behandeln Sie die kleinen Deckgläser 30 Sekunden lang mit Luftplasma bei 10 Watt, bevor Sie sie in Salpetersäure tauchen. Delegieren Sie die Objektträger, indem Sie sie 15 Minuten lang in ein Becherglas mit 70%iger Salpetersäure bei 55 Grad Celsius tauchen. Nach Beendigung des Delegierens werden die Proben gespült, indem sie nacheinander dreimal in Bechergläser mit Wasser getaucht werden.

Legen Sie die Proben auf fusselfreie Handtücher und föhnen Sie sie mit einer Stickstoffpistole. Stellen Sie die Temperatur einer Kochplatte auf 150 bis 300 Grad Celsius ein. Senken Sie die Proben dann langsam auf die heiße Oberfläche ab, um plötzliche Temperaturänderungen zu minimieren.

Nehmen Sie die Proben nach fünf Minuten zum Abkühlen von der Heizplatte. Legen Sie die nanoporösen Goldproben in Styroporschalen und behandeln Sie sie 30 Sekunden lang mit Luftplasma bei 10 Watt. Übertragen Sie dann die Proben auf 24-Well-Gewebekulturplatten.

Geben Sie jeweils 500 Mikroliter vollständigen Nährmedium hinzu. Lagern Sie die Platten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, bis die Zellen ausgesät sind. Bewahren Sie murine Astrozytenzellen in T-75-Kolben mit Kulturmedien auf.

Sobald die Zellen zu 70 % konfluent sind, passieren Sie sie, indem Sie zuerst das alte Medium entfernen und die Zellen mit PBS waschen. Einzelheiten zu den Bedingungen für Passagiere finden Sie im Textprotokoll. Nachdem Sie die Kulturplatten aus dem Inkubator genommen haben, saugen Sie das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen ab und säen Sie die Zellen auf das Glas.

Deckgläser mit einer Dichte von 25.000 Zellen pro Quadratzentimeter mit einem Endvolumen von einem Milliliter. Schütteln Sie die Kulturplatte, um eine gleichmäßige Beschichtung der Zellen über den Proben zu gewährleisten, und stellen Sie die Kulturplatte in den Inkubator, wenn die Zellen zur Analyse bereit sind. Entfernen Sie die verbrauchten Medien aus den Vertiefungen und waschen Sie sie zweimal mit PBS.

Nachdem die Zellen in 4%para-Formaldehyd in PBS fixiert und zweimal gewaschen wurden, permeieren Sie sie fünf Minuten lang in 500 Mikrolitern 0,1%Triton X 100 in PBS. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche zweimal und übertragen Sie die Zellen in die sauberen Vertiefungen. Tupfen Sie 80 Mikroliter der Färbelösung auf die Proben und lagern Sie sie in Aluminiumfolie abgedeckt für 20 Minuten.

Nach einer weiteren PBS-Wäsche färben Sie die Zellen fünf Minuten lang mit drei Nanomolaren DPI in PBS gegen. Die Zellen noch einmal mit PBS waschen und darin eintauchen, dann die Zellen auf Glas montieren. Decken Sie die Dias mit Montagemedien ab und versiegeln Sie sie mit klarem Nagellackbild.

Die nanoporösen Goldoberflächen werden mit einem Rasterelektronenmikroskop mit 50.000-facher Vergrößerung bei 10 Kilovolt Elektronenenergie unter Verwendung eines Sekundärelektronendetektors untersucht. Anschließend werden Komposit-Zellbilder an verschiedenen Stellen der Proben mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung und den entsprechenden Filterwürfeln aufgenommen. Öffnen Sie die Bilder in Bild J.Teilen Sie die Bilder in einzelne Kanäle auf.

Wandeln Sie sie in acht Gebote um. Subtrahieren Sie den Hintergrund und glätten Sie ihn durch Medianfilterung. Passen Sie dann den Schwellenwert manuell an, um die Poren, Zellkörper und Zellkerne hervorzuheben.

Verwenden Sie den Befehl Wasserscheide, um verschmolzene Poren oder Zellen zu trennen. Legen Sie die Parameter für die Partikelanalyse fest und führen Sie den Befehl aus, um die Anzahl der Partikel, die durchschnittliche Fläche und die prozentuale Bedeckung durch Partikel zu extrahieren. Ändern Sie abschließend die enthaltenen Makrodateien, um eine Batch-Analyse mehrerer Bilder durchzuführen.

Hier wird die Farbänderung der abgeschiedenen Metallmuster vor und nach dem Legieren dargestellt. Das silbrige Finish ist auf den silberreichen Legierungsgehalt bei der Legierung zurückzuführen. Die Folie erhält einen sichtbaren orangebraunen Farbton.

Hier sind die feineren Merkmale gezeigt, die durch die Fotolithografie erzeugt werden. Musterung des Metalls. Unterschiedliche schlechte Morphologien können durch thermische Behandlung der nanoporösen Goldfilme erzielt werden.

Das Schnittbild zeigt, ob die Schichten durch die Schichtdicke gleichmäßig delegiert sind. Die Rasterelektronenmikroskop-Bilder können in binäre Bilder segmentiert werden, um die Größe und die prozentuale Bedeckung durch Hohlräume zu bestimmen. Der Code zum Generieren dieser Ausgabe kann von der JoVE-Webseite heruntergeladen werden.

Hier ist ein repräsentatives Fluoreszenzbild von adhärenten murinen Astrozytenzellen abgebildet, die auf einer nanoporösen Goldoberfläche kultiviert wurden. Die einzelnen Kanäle des Bildes können geteilt und segmentiert werden, um binäre Bilder zur Analyse der Zellmaterialinteraktion zu erzeugen. Segmentierte Zytoskelettbilder können zur Quantifizierung der Zellfläche und der Oberflächenbedeckung verwendet werden.

Während die segmentierten Zellkernbilder für die Zellzählung nützlich sind. Die Codes zur Generierung dieser Ausgaben können von der JoVE-Webseite heruntergeladen werden. Hier sehen Sie eine visuelle Zusammenfassung von Fehlern bei der Herstellung von nanoporösen Goldstrukturen, einschließlich PO-Filmhaftung, Abwesenheit von Porosität und übermäßiger Wärmebehandlung.

Im Anschluss an dieses Verfahren deuten andere Methoden darauf hin, dass eine elektrochemische Charakterisierung in der Waldmikroskopie, Zelllyse und PCR durchgeführt werden kann, um zusätzliche Fragen wie die Wirkung der Zelladhäsion und der Genexpression in der Nanostruktur weiter zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nanoporen-Goldmuster herstellt und ihre Wechselwirkungen mit Zellen durch digitale Bildanalyse oder Mikroskopie quantifiziert. Befund. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Salpetersäure, Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, einschließlich wachsender persönlicher Schutzausrüstung.