Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Infinium-Assay erfolgreich einzusetzen, um einen Genotypisierungs-Bead-Chip zu verarbeiten. Dies wird erreicht, indem die DNA zunächst amplifiziert, fragmentiert und isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, den denaturierten DNA-Strang mit Oligonukleotiden zu hybridisieren, die an Kügelchen auf dem Array gebunden sind.

Als nächstes wird das an die Perle gebundene Oligonukleotid gefärbt und selektiv um eine Base verlängert. Der letzte Schritt besteht darin, die Bead-Chips zu scannen, um das markierte Nukleotid nachzuweisen. Letztendlich werden die Genotyp-Ergebnisse verwendet, um die Allele zu bestimmen, die an der interessierenden Stelle vorhanden sind.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da viele der Schritte zum Färben und Laden der Bienenchips schwer zu erlernen sind. Viele der Manöver sind in anderen Genotypisierungsmethoden nicht zu finden, und viele der Geräte haben sehr ähnlich klingende Namen. Bereiten Sie die DNA einen Tag vor der Amplifikation vor und geben Sie 200 Nanogramm DNA pro Vertiefung in eine Deep-Well-Platte mit 96 Proben.

Mindestens 96 Proben müssen plattiert werden, um sicherzustellen, dass kein Reagenz verschwendet wird. Beschriften Sie die Platte mit einem Barcode-Aufkleber, der im Lieferumfang des Kits enthalten ist, und zentrifugieren Sie sie, um die Volumina zu normalisieren. Lassen Sie die Proben über Nacht in einer Schublade oder einem Abzug, um die Flüssigkeit zu verdampfen.

Decken Sie den Teller locker mit einem Deckel oder Küchenpapier ab, um am nächsten Morgen Staub fernzuhalten. Vergewissern Sie sich, dass es sich bei den Vertiefungen um ein trockenes Reagenzienbecken und eine 10-Mikroliter-Achtkanalpipette handelt, um vier Mikroliter DNA-Resus-Puffer in jede Vertiefung zu dosieren, um die Proben zu rehydrieren. Wenn darauf geachtet wird, die Flüssigkeit nicht zu berühren, ist es nicht notwendig, die Pipettenspitzen zwischen den einzelnen Säulen zu entsorgen.

Geben Sie anschließend 20 Mikroliter MA, ein Reagenz, mit einer Achtkanalpipette und einem frischen Reagenzbecken in jede Vertiefung der Platte. Decken Sie die Platte mit einer wiederverwendbaren Dichtung ab, zentrifugieren Sie sie und wirbeln Sie sie eine Minute lang bei 1600 U/min auf einem Mikrotiterplatten-Shaker ab und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die restlichen Schritte zur Amplifikation werden in diesem Video nicht gezeigt, aber das Protokoll ist im begleitenden Manuskript zu finden.

Nachdem alle Reagenzien hinzugefügt wurden, stellen Sie die Platte für 20 bis 24 Stunden in einen ordnungsgemäß kalibrierten Ofen, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Nach der Amplifikation werden die DNA-Proben nach der Ausfällung in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge fragmentiert und ausgefällt, wie im Manuskript beschrieben. Überprüfen Sie die Unterseite der Platte, ohne sie umzudrehen.

Um zu bestätigen, dass die Proben in einem blauen Pellet ausgefällt wurden, entsorgen Sie den Deckel und entfernen Sie die Flüssigkeit schnell, indem Sie die Platte umdrehen und kräftig auf die mit Papiertüchern bedeckte Tischplatte klopfen. Sobald die Platte umgedreht ist, achten Sie darauf, dass Sie sie nicht umkehren. Während die Flüssigkeit zurückbleibt, klopfen Sie die Platte wiederholt gegen die Tischplatte, bis die gesamte Flüssigkeit entfernt ist.

Stellen Sie die Platte auf ein umgedrehtes Reagenzglasgestell, um eine Stunde lang bei Raumtemperatur trocken zu inkubieren. Anschließend wird die DNA resuspendiert, um den Hybridisierungsprozess zu beginnen. Legen Sie eine 96-Well-Platte mit resuspendierter DNA für 20 Minuten bei 95 Grad Celsius auf einen Wärmeblock.

Um die DNA nach 20 Minuten zu denaturieren, nehmen Sie die Probenplatte aus dem Wärmeblock und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, während die Probenplatte abkühlt, und bereiten Sie die Bienenstockkammer vor. Für jeweils vier verarbeitete Bienenchips wird eine Kammer benötigt. Lege eine Gummimatte auf die Oberseite des Bienenstockkammerbodens und richte das dickere Loch mit der Vorderseite des Bodens aus.

Das in den Sockel geätzte Barcode-Symbol sollte noch sichtbar sein. Geben Sie mit einer 1000-Mikroliter-Pipette 400 Mikroliter PB in jedes der acht Befeuchtungsreservoirs ab, die in den Boden eingeritzt sind. Setzen Sie den Hi-Chamber-Deckel auf den Boden und schließen Sie beide Enden, indem Sie zwei Verschlüsse auf diagonal gegenüberliegende Seiten legen.

Legen Sie zunächst vier Hi-Kammer-Einsätze für jede Hi-Kammer, die kurz vor Ablauf der 30 Minuten verwendet wird, auf die Bank. Abkühlen. Öffnen Sie die Silberperlen-Chippackungen.

Entfernen Sie die Chips aus den durchsichtigen Kunststoffhüllen, ohne die Perlen zu berühren. Legen Sie jeden Bienenchip auf einen Hi-Chamber-Einsatz. Ausrichten des Chip-Barcodes mit dem Barcode-Symbol, das in die Oberseite des Einsatzes geätzt ist.

Der nächste Schritt, nämlich das Laden der Bienenchips, ist möglicherweise der kritischste Schritt des Protokolls. Um es richtig zu machen, müssen Sie den Probentransfer von der DNA-Platte zum Bienenchip im Voraus visualisieren, den Deckel der Probenplatte abziehen und entsorgen. Eine Mehrkanalpipette kann verwendet werden, um Flüssigkeit auf die Chips zu dispensieren, aber es muss vorausgesehen werden, nur die Anzahl der Proben zu aspirieren, die sicher auf dem Bienenchip platziert werden können, da die Anzahl der Reihen auf einer Platte nicht immer mit der Anzahl der Reihen auf einem Chip übereinstimmt.

Entnehmen Sie 15 Mikroliter Probe aus der Probenplatte und geben Sie sie langsam über den Einlass in das Array. Es muss außerordentlich darauf geachtet werden, dass die richtige Probe auf dem richtigen Bienenchip in der richtigen Position platziert wird, die zum Bead-Chip passt. Zuvor aufgezeichneter Auftrag.

Öffnen Sie die Hi-Kammer und legen Sie die Einsätze über die Befeuchtungsbehälter. Der Barcode des Chips sollte über die Barcode-Ätzung in den Boden der Bienenstockkammer gelegt werden. Bringen Sie die Abdeckung der Bienenstockkammer wieder an und schließen Sie alle vier Verschlüsse, indem Sie die Verschlüsse an diagonal gegenüberliegenden Seiten schließen.

Inkubieren Sie zunächst die Hi-Kammer nach Abschluss der Hybridisierung 16 bis 24 Stunden lang in einem 48 Grad Celsius heißen Ofen, die Hi-Kammern werden aus dem Ofen genommen und 25 Minuten lang bei Raumtemperatur zum Abkühlen inkubiert. Wenn die Hi-Kammern abgekühlt sind, öffnen Sie eine Hi-Kammer. Entfernen Sie die Deckeldichtung von einem Bienenchip, indem Sie die Dichtung an einer Ecke greifen und vorsichtig diagonal abziehen.

Sobald die Dichtung entfernt ist, legen Sie den Chip sofort auf eine Bienenchip-Schale und tauchen Sie ihn in PB one ein, ohne die Perlen zu berühren. Wiederholen Sie den Vorgang, bis das Tablett mit Raupensplittern gefüllt ist. Achten Sie darauf, dass keine Späne trocknen.

Rühren Sie das Tablett vorsichtig um, um Blasen zu entfernen, und lassen Sie die Chips eine Minute lang unter Wasser. Rühren Sie das Tablett erneut um. Schieben Sie das Tablett mit den Bienenchips in eine zweite Waschschüssel, die mit PB gefüllt ist. Rühren Sie vorsichtig um und lassen Sie es eine Minute lang seifen.

Dann erneut im Flüssigkeitsstrom durch die Montagestation rühren. Platzieren Sie vier schwarze Kunststofffließbänder durch Streben in den Rillen. Füllen Sie die Station mit PB one, bis die Flüssigkeit nacheinander fast die Höhe der acht Montagehalterungen erreicht.

Entfernen Sie die Raupenspäne aus der Schale und legen Sie sie auf einer Kunststoff-Durchflussstrebe in die Montagestation, der Chip-Barcode sollte über dem Barcode-Symbol ausgerichtet sein, das in die Montagestation geätzt ist. Sobald sich vier Späne in der Montagestation befinden, platzieren Sie einen durchsichtigen Kunststoffabstandshalter auf jedem Raupenchip. Die Außenkanten des Abstandhalters sollten die Halterungen innerhalb der Montagestation umgeben.

Platzieren Sie die Montageschiene aus Kunststoff in der Montagestation, indem Sie sie über die Nuten legen. Platzieren Sie vorsichtig einen Glasobjektträger auf dem Kunststoffabstandshalter, indem Sie das hintere Ende des Objektträgers gegen die Montagestange drücken und das vordere langsam in die Flüssigkeit absenken. Die Rille an der Oberseite des Schiebers sollte direkt über dem Barcode des Chips nach unten zeigen, so dass am Barcode-Ende ein Spalt zwischen dem Bienenchip und dem Schieber entsteht.

Nachdem Sie überprüft haben, dass sich keine Blasen zwischen Chip und Schieber befinden, lassen Sie zwei Metallverschlüsse um das Glas einrasten. Schieben Sie einen zum Barcode-Ende und einen nach hinten. Die Kanten der Kunststoffverschlüsse sollten den Kunststofffluss durch die Strebe unter dem Chip greifen.

Diese Abbildung zeigt ein vollständiges Durchflussdiagramm der Baugruppe. Sobald alle Kügelchen in ihrem Durchfluss sind, nehmen Sie eine chirurgische Schere und schneiden Sie beide Enden des Abstandshalters so nah wie möglich an der Glasschiene ab. Sobald das Kammergestell in einem Winkel von 44 Grad steht, beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie eine Bienenchip-Durchfluss-Baugruppe auf dem Kammergestell platzieren, indem Sie die Baugruppe nach unten schieben und die Strebe oben einhaken. Die Rückseite des Bienenchips sollte das Kammergestell berühren.

Der Objektträger sollte nach außen zeigen und die Rille nach oben zeigen, um ein Reagenzreservoir zu bilden. Nachdem alle Bienenchip-Baugruppen auf dem Kammergestell platziert wurden, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um 150 Mikroliter RA ein Reagenz zu den Durchflussbaugruppen hinzuzufügen. Durch die Abgabe der Flüssigkeit in das Glasreservoir fließt das Reagenz auf natürliche Weise den Objektträger hinunter und tritt an der Basis der Baugruppe aus, so dass zukünftige Reagenzien direkt in das Reservoir gegeben werden können.

Die verbleibenden Schritte zum Färben einer Extension werden nicht angezeigt. Bitte beachten Sie das Protokoll im begleitenden Manuskript nach Abschluss der Färbung und Verlängerung. Zerlegen Sie die Durchflussmontage, indem Sie einen dünnen Metallstab zwischen die Verschlüsse und die Strebe einführen.

Dann schwenkbar. Legen Sie den Glasschieber beiseite und entfernen Sie den Bienenchip, legen Sie sofort einen Bienenchip in eine vertikale Bienenchip-Schale und tauchen Sie ihn in PB eins, wiederholen Sie dies für jede Durchflussmontage. Achten Sie darauf, dass jeder Bienenchip in die gleiche Richtung gerichtet ist und dass sie der Luft so wenig wie möglich ausgesetzt sind.

Führen Sie anschließend diesen Vorgang aus. Gemäß dem Protokoll im Begleittext sollte ein ordnungsgemäß verarbeiteter Bienenchip beim Scannen helle und deutliche rote und grüne Laserlichtintensitäten aufweisen, da die markierten Nukleotide, die während der Verlängerungs- und Färbeschritte angehängt wurden, unter dem Licht der beiden Laser fluoreszieren. Hier ist eine genomische Standard-DNA-Probe zu sehen, die erfolgreich mit einem benutzerdefinierten Panel-SNP-Genotypisierungs-Array-Schnitt hybridisiert wurde, der die Intensität durchlässt.

QC wird auf dem Bienenchip-Display im linken Bereich grün hervorgehoben. Versagende Intensität. QC wird auf dem Bee-Chip-Display rot markiert.

Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, werden die roten und grünen Anzeigen überlagert. Hier ist ein vergrößertes Bild zu sehen, in dem diese Nukleotide die Oligonukleotidkette der Kügelchen, die mit dem fragmentierten DNA-Strang hybridisiert sind, selektiv verlängern. Und da die Nukleotidketten so konzipiert sind, dass sie an der Stelle der Variante enden, können die Farbe und Intensität des resultierenden Signals verwendet werden, um die an der SNP-Stelle vorhandenen Allele zu bestimmen.

Die Scanner-Ausgabedateien werden in die Genome Studio Analysis-Software importiert, die Cluster-Profile generiert. Dies ist ein Beispiel für einen gültigen SNP mit drei unterschiedlichen Clustern, die die Genotypen aa, A, B und B repräsentieren, wobei die B-Genotypen rot, violett bzw. blau gefärbt sind. Dieses Intensitätsdiagramm zeigt den SNP, der eine Bearbeitung des schwarzen mittleren Clusters erforderte, der homozygot sein sollte.

AB wird nicht angerufen. Der BB-Cluster wird fälschlicherweise als ab bezeichnet. Das letzte Intensitätsdiagramm zeigt einen SNP mit schlechter Leistung.

Aus diesem Intensitätsdiagramm können keine Genotypen gewonnen werden, da keine eindeutigen Cluster vorhanden sind. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Bienenchips schnell zu verarbeiten. Setzen Sie sie nicht über einen längeren Zeitraum der Luft aus.