Name: Ein In-vitro Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Neuronen und Gliazellen aus dem Plexus myentericus adulter Mäuse. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Studien und Untersuchungen zur Interaktion enterischer Nervenzellen.

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National Institute of Health Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.

Alle Tierpflege und experimentellen Verfahren waren in Übereinstimmung mit und Zustimmung durch die Institutional Animal Care und Use Committee an der Virginia Commonwealth University. 1. Herstellung von sterilen Poly-D-Lysin und Laminin beschichteten Deckgläschen in 24-Well-Platten <ol><li> Alle Verfahren für Schritt 1 werden in sterilen Bedingungen durchgeführt; unter einer Haube und mit sterilem Reagenzien. Deckgläschen und doppelt deionisiertem Wasser (ddH2O) sollten im Voraus sterilisiert werden. Vorbereitung der Platten kann bis zu zwei Wochen durchgeführt werden, bevor Neuron Isolation. </li><li> Unter der Haube sterile Pinzette autoklavierten Deckgläschen in 12 Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu platzieren. </li><li> Bereiten Poly-D-Lysin Lager vor der Zeit. 50 ml der sterilen ddH2O bis 5 mg Poly-D-Lysin. Vortex und Speicher in 3 ml Aliquots bei -20 ° C. Aliquots vor Gebrauch auftauen. </li><li> Für eine endgültige Konzentration von 1 ml Poly-D-Lysin Lager pro 25 cm 2: Pipette 80 ulvon Poly-D-Lysin stock übereinander Deckglas (2 cm 2). Lassen Lösung für 10 Minuten absetzen. </li><li> Entfernen Poly-D-Lysin unter Verwendung von Vakuum und spülen Deckgläschen 3x mit sterilem ddH 2 O. </li><li> Erlauben Platten für mindestens 2 Stunden unter der Haube trocknen. </li><li> Die Platten können bei 4 ° C gelagert werden oder - 20 ° C bevor mit Laminin beschichtet. </li><li> Bereiten Laminin Lager vor der Zeit. Auftauen Laminin auf Eis und halten auf dem Eis während des Einsatzes. Verdünnen auf eine Konzentration von 50 ug / ml; achten Sie auf viel Konzentration; jedes Los wird anders sein. Je nach Menge Konzentration, werden etwa 20 ml ddH2O auf jeder Flasche des Laminin hinzugefügt werden. Aliquot (5 ml) und bei -80 ° C Auftauen Aliquots auf Eis vor dem Gebrauch. </li><li> Coat Deckgläser mit 5 pg / cm 2 Laminin; Pipette 200 ul Laminin Lager auf jeder Deckglas. </li><li> Inkubieren Laminin-Lösung auf Deckgläsern für 1 Stunde. </li><li> Saugen restlichen Laminin-Lösung und spülen Deckgläschen einmal mitddH 2 O. Vermeiden Schabfläche von Deckgläsern. </li><li> Shop Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen. </li></ol> 2. Rechtzeitige Vorbereitung von Neuron Isolation Solutions <ol><li> Bereiten Krebs-Lösung (in mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 11 Glucose und 2,5 CaCl 2). Platz 13,79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120) .289 g MgSO 4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO 3 (FW 84.01), 3,96 g Glucose (FW 180,2) und 0,555 g CaCl 2 (FW 111) in 2 L ddH 2 0. Kühlen auf 4 ° C </li><li> Bereiten spülen Medien (F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika / Antimykotika): In einen 500-ml-Flasche von F12-Medium, 50 ml FBS und 5 ml Antibiotikum / Antimykotikum 100x Liquid (Gibco). </li><li> Bereiten enterischen Neuron Medien (Neurobasal Ein Medium mit B-27, 2 mM L-Glutamin, 1% FBS, 10 ng / ml, glialem Neurotrophic Factor (GDNF), und Antibiotika / Antimykotika 100x Flüssigkeit). Um GDNF Lager machen, fügen Sie 1 ml ddH2O bis 10 ug GDNF und frieren wieder in 50 ul Aliquots bei -80 ° C. Für ein 50 ml Fläschchen komplette Neuron Medien kombinieren 47,5 ml Neurobasal A Medien, 1 ml B-27 (50x), 500 ul FBS, 500 ul 200 mM L-Glutamin (Gibco) 50 ul GDNF Lager, und 500 ul Antibiotika / Antimykotische 100x Flüssigkeit. Die Medien werden in kleinen Chargen 50 ml hergestellt, um die Frische von GDNF zu gewährleisten und um eine Kontamination von großen Mengen dieser teuren Zellkulturmedien Mischung zu vermeiden. </li></ol> 3. Ernte Längsmuskel / myenterischen Plexus (LMMP) Herstellung von Mice <ol><li> Entsprechende nationale und institutionelle Ethik sollten vorhanden sein, bevor Tierversuch. Adult Swiss Webster-Mäuse mit einem Gewicht von über 25 g (in der Regel mehr als 8 Wochen alt) in Gruppen von 6 vor Experimente untergebracht. Gewebe von zwei Mäuse werden zur Isolierung von Ileum enterischen Neuronen und Glia verwendet und drei Mäuse verwendetIsolierung von Kolon-Zellen. </li><li> Bereiten OP-Bereich. Sammeln Sie kleine chirurgische Schere, Pinzette abgewinkelt, Wattestäbchen, drei 200 ml Bechergläser, und ein Glas / Kunststoff-Stab (Pinsel). Sicherstellen, dass alle Lieferungen gründlich gewaschen und gespült, bevor verwenden, um eine Kontamination zu minimieren. Dieser Schritt kann durchgeführt am Tag vor dem Experiment werden. </li><li> Zeigen Krebs-Lösung auf Eis und Blase mit Carbogen (95% Sauerstoff, 5% CO 2) für mindestens 30 min auf pH stabilisieren. </li><li> Schalten Sie auf verschiedenen Geräten und warmen Chemikalien am gewünschten Temperaturen zu stabilisieren; Hitze Wasserbad (s) auf 37 ° C, cool Zentrifuge auf 4 ° C, Platz ausgewogene Hank-Salzlösung (HBSS) und 0,5% Trypsin im Wasserbad (37 ° C ). Komplette Neuron Medien und spülen Medien bleiben sollte gekühlt werden. </li><li> Platz 150 ml eiskaltem sprudelte Krebs in drei 200 ml Bechergläser als &#39;schmutzig&#39;, &#39;sauber&#39; und &#39;LMMP&#39;. Blase Becherglas als &#39;LMMP&#39; mit Carbogen. </li><li> Nach der Genehmigung von Ethik-Kommission, euthanize mouse durch Genickbruch oder CO 2 Ersticken. </li><li> Bewegen Sie die Maus in Rückenlage recumbence auf chirurgische Oberfläche, saubere Haut mit 70% EtOH und heben Bauchhaut mit einer Pinzette. Mit einer Schere, offene Bauchhöhle und zeigen interne Verdauungsorgane. </li><li> Entfernen Sie die Länge des Magen-Darm-Trakt durch Anheben eines Abschnitts Ileum und enthüllt seine Mesenterium. Snip durch Mesenterium mit einer Schere vorsichtig zu entfernen und zu entwirren Ileum und Colon, man aufpassen, nicht aus dem Ileum Mesenterium / Doppelpunkt zu ziehen. </li><li> Nachdem die gesamte Länge des Darms entwirrt entfernen Ileum durch Schneiden durch den Darm distal des Magens und proximal zu dem Blinddarm. Hinweis: Dieses Verfahren kann auch mit Kolon durch Entfernen des Dickdarms von distal nach den Blinddarm zu proximal durchgeführt der Anus. </li><li> Gewebe kann ferner zwischen dem proximalen und distalen Kolon und jejenum und Ileum unterteilt werden. Der Rest dieses Verfahrens wird die Isolation des Ileums beziehen; ter ist das gleiche für die Isolierung von Doppelpunkt LMMP. Setzen Sie den gesamten Ileum in einem Glasbehälter mit eiskaltem Krebs markiert &#39;dirty&#39;. </li><li> Erstellen Sie ein Werkzeug, um die Ileum reinigen; stumpfen eine große 20 G-Nadel mit einer Ablage Stein und verbinden Sie es mit einer großen Spritze (10 ml) mit eiskaltem Krebs. </li><li> Reinigen Fäkalien aus dem Ileum von Schneiden des Ileums in drei oder mehr große Stücke. Entfernen eines ileal Abschnitt aus dem Becherglas und platzieren Sie den stumpfen Nadel in das Ende eines ileal Stück. </li><li> Sanft laufen Krebs durch den Darm Abschnitt bis alle Fäkalien in einen separaten Abfallbehälter entfernt wird. Setzen Sie den gereinigten Abschnitt in den Behälter von Krebs gezeichnet &#39;clean&#39;. Wiederholen, bis ganze Ileum gereinigt wird. </li><li> Um die LMMP entfernen, schneiden Sie das Ileum in kleine Segmente, etwa 2-4 cm. Legen Sie ein Segment des Ileum auf einem Kunststoff-oder Glas-Stab; Ileum sollte eng anliegend, aber nicht lose oder straff (~ 2 mm). Beginnen Entfernung des LMMP durch sanftes Entfernen von Bits von Mesenterium noch anhängened der gastrointestinalen (GI)-Trakt mit einer Pinzette. Verhindern, dass der GI-Trakt zu drehen um die Stange durch leichtes Pinning des Rohres auf die Stange mit dem Daumen. </li><li> Trennen Sie die LMMP aus dem zugrunde liegenden kreisförmigen Muskel; zuerst sanft an den Kanten der Zange auf der ganzen Linie, wo das Mesenterium befestigt war, von oben nach unten von dem Segment, sanft eine Lücke in der Längs-Muskel. Dann vorsichtig entfernt necken die Längsmuskel mit einem Wattestäbchen mit Krebs benetzt. </li><li> Beginnen an der Oberseite des Spaltes in Längsrichtung Muskel und reizen weg mit der leichtesten horizontaler Strich beim Anwenden sehr leichtem Druck, bis die Längsmuskel gerade beginnt, sich von der kreisförmigen Muskels zu trennen, tun dies entlang der gesamten Streifen entlang der Mesenterium Befestigungspunkt. </li><li> Dann vorsichtig im Umfeld des GI Rohr einzuführen, bewegt von oben nach unten und zurück als die longitudinale Muskel wird langsam aus dem Ringmuskel ganzen Weg rund um das Rohr abgetrennt. Wenn Sie fertig sind, dieLMMP wird natürlich kommen aus dem Rest des GI Rohr. </li><li> Legen Sie die resultierende dünne Streifen Längsmuskel in das Becherglas mit der Aufschrift &quot;LMMP &#39;. Wiederholen für alle Segmente. </li><li> Nachdem alle Streifen LMMP von einer Maus gesammelt worden sind, wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Mäuse verwendet. Spülen Sie die &#39;schmutzige&#39; und &#39;clean&#39; Becher vor Wiederverwendung. </li><li> Spülen Sie die LMMP 3x auf biologische Verunreinigungen zu entfernen. Füllen Sie drei 2 ml Eppendorf-Röhrchen mit eiskaltem Krebs. Platzieren Sie die LMMP Streifen in der ersten Röhre und Spin für 30 sec bei 356 × g in einer Zentrifuge gekühlt auf 4 ° C Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und bewegen Sie die LMMP Streifen zum nächsten sauberen Krebs gefüllten Röhre. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede verbleibende Rohr. </li></ol> 4. Digest LMMP <ol><li> Bereiten Verdauung Lösung, indem 13 mg Collagenase Typ 2 und 3 mg BSA in 10 ml warmer, sprudelte Krebs-Lösung. </li><li> Platz Segmente gespült LMMP in Aufschlußlösung und Nutzung scissoren zu LMMP in kleine Stücke schnippeln. </li><li> Digest LMMP für 60 min bei 37 ° C im Wasserbad mit Schüttler unter leichtem mit Carbogen eingeleitet. </li><li> Nach der Verdauung abgeschlossen ist, sammeln die Zellen durch Zentrifugation für 8 min bei 356 xg in Zentrifuge gekühlt auf 4 ° C </li><li> Von diesem Punkt an sollten alle Verfahren unter sterilen Bedingungen in einer Zellkultur Haube getan werden! Alle Reagenzien und Behälter sollte vor Gebrauch sterilisiert werden. </li><li> Während der Zentrifugation vorbereiten 0,05% Trypsin-Lösung, indem 1 ml 0,25% Trypsin erwärmt und 4 ml HBSS erwärmt in ein steriles 50 ml Zellkultur Rohr. </li><li> Nach Zentrifugation Überstand entfernen und entsorgen. Verwenden Sie nicht ein Vakuum, das wird wahrscheinlich saugen das Zellpellet aufgrund der niedrigen Geschwindigkeiten zentrifugiert. Entfernen Sie vorsichtig das Zellpellet aufnehmen und in sauberes Röhrchen mit 5 ml 0,05% Trypsin-Lösung. </li><li> Digest Zellen in 0,05% Trypsin-Lösung in 37 ° C warmes Wasserbad unter Schütteln für 7 min. Nicht mehr als 7 kmn der gesamten Trypsinbehandlung oder Neuronen zugrunde gehen. </li><li> Neutralisieren Trypsin mit 10 ml kaltem spülen Medien nach 7 min von Trypsin-Behandlung. </li><li> Zentrifuge Zellen für 8 min bei 356 x g. Entfernen und entsorgen Medien. </li><li> Während des Laufs, balancieren einen Abschnitt sterilisiert Nitex Mesh auf einem sterilen 15 ml Zellkultur Rohr. </li><li> Nach Zentrifugation Überstand entfernen und entsorgen. Vorsichtig resuspendieren Zellgemisch durch Verreiben in 3 ml komplette Neuron Medien. Vermeiden Erzeugung von Luftblasen während dieses Schrittes und alle künftigen Schritte in der Zelle Gemisch verrieben. Alle Triturationen sollte sehr vorsichtig erfolgen. Filter Zelllösung durch Nitex Mesh in saubere 15 ml Zellkultur Rohr. </li><li> Optional: Cap Zellkultur Rohr und in gekühlten Hula Mixer (oder Mixer, der Rotation bietet) mit sanften und Kippen für 30 min. Dieser Schritt ist optional, aber empfohlen. </li><li> Optional: Nach Hula-Mischer, 2 ml Kaltspülung Medien Zellen zu waschen. </li><li> Sammeln Zellen durch Zentrifugation (8 min, 356 xg). Überstand entfernen und entsorgen. </li><li> Die Zellen in 1.200 ul komplette Neuron Medien. Man reibt Zellen vorsichtig mit 1 ml Kunststoff Pipettenspitze. Nicht generieren Luftblasen. Pipette langsam und vorsichtig, bis die meisten Stücke gebrochen und werden die Zellen in Flüssigkeit suspendiert. </li><li> In 750 ul komplette Medien auf jede der 12 Vertiefungen, die eine Pre-beschichteten Deckglas und 100 ul der triturated Zelllösung. </li><li> Inkubieren Neuronen in Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie die Hälfte der Zellmedien alle 2 Tage. </li><li> Neuronen sind bereit für elektrophysiologische Ableitungen nach 1 - 2 Tagen in Kultur. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine größeren Interessenkonflikte bestehen.

Verwendete Tiere
Dieses Protokoll wurde für Schweizer Webster-Mäuse optimiert. Diese Methode lässt sich jedoch leicht an andere kleine Säugetiere wie Ratten und andere Mäusestämme anpassen. Wir haben erfolgreich vorläufige Isolierungen mit C57-Mäusen und μ-Opioidrezeptor-Knock-outs durchgeführt. Es ist jedoch auch möglich, dass andere Mäusestämme aufgrund morphologischer Variationen im Magen-Darm-Trakt problematisch sein können. Darüber hinaus sind Unterschiede zwischen Mausstämmen (C57Bl/6 vs. B...

Das enterische Nervensystem (ENS) ist groß Netzwerk von Nerven und Gliazellen, die die gesamte Länge des Magen-Darm-Trakt (GI) verläuft. Die ENS funktionell steuert alle Aspekte der Verdauung, darunter Peristaltik, Flüssigkeitsaufnahme / Sekretion, Gefühl von Stimuli, etc (für eine Übersicht siehe 1). Es enthält über 500 Millionen Nervenzellen, mehr als im Rückenmark gefunden, und enthält jede Klasse Neurotransmitter im Gehirn gefunden. Darüber hinaus ist die ENS einzigartig, dass es reflexiv funktionieren, ohne Eingabe von dem zentralen Nervensystem 2. Verständnis der ENS ist von entscheidender Bedeutung, nicht nur, um seine normale physiologische Rolle zu verstehen, aber ihr Engagement in einer Vielzahl von Neuropathien, die angeboren (Morbus Hirschsprung), erworben (Chagas), sekundäre Krankheitszuständen (diabetischer Gastroparese), Drogen verstehen können induzierte (Opioid Darm-Syndrom), oder wegen der Verletzung (postoperative Ileus) 1. Darüber hinaus können enterischen Neuronen eine erneute seinservoir für virale Infektion (Varizella-Zoster) 3. Wegen seiner Ähnlichkeit mit dem Gehirn und der hohen Konzentration von Serotonin im Darm, Medikamente bei der Behandlung des zentralen Nervensystems Mängel gerichtet haben oft unerwünschte Nebenwirkungen auf das ENS 2. Bemerkenswert ist auch, dass viele Neuropathien wie Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit ähnliche zelluläre Veränderungen in den Neuronen magensaftresistente lange vor ihrem Auftritt in zentralen Neuronen zeigen, was die ENS ein zugängliches Modell, um die Pathogenese dieser Erkrankungen 4 studieren. Daher ist ein umfassendes Verständnis der ENS eine Notwendigkeit für das Verständnis Krankheitszuständen und Verhinderung / Vorhersage pharmakologischen Nebenwirkungen. Die Neuronen des ENS wurden traditionell in der Meerschweinchen mit wholemount Vorbereitungen 5-7 oder 8 kultivierten Neuronen untersucht. Trotz der Leichtigkeit, mit der Nervenzellen in diesem großen Tier untersucht werden können, hat dieses Modell viele Einschränkungen einschließlichMangel an genetisch veränderten Stämme, Mangel an spezifischen Reagenzien zu dieser Spezies, und der hohen Kosten, die mit der Bestellung und beherbergt diese Themen verbunden. Die Entwicklung eines murinen enterale Nervensystem Modell hat den einzigartigen Vorteil der verschiedenen Knock-out-Systeme, eine breite Palette von anderen etablierten Methoden, die in Verbindung mit der Zellkultur-Technik verwendet werden können, und die Fähigkeit, eine Validierung für die Meerschweinchen-Modell bieten . Die äußere Plexus myentericus (zwischen der Längs-und Ringmuskulatur), die hauptsächlich verantwortlich für die Peristaltik des Darms Aktionen ist, sowie die submuköse und Schleimhaut-Plexi, (: Das ENS besteht aus drei Plexi, die die Länge des Magen-Darm-Trakt führen umfasste gefunden unter und innerhalb der Schleimhaut, jeweils), die im Wesentlichen steuert Flüssigkeitsaufnahme / Sekretion und Nachweis von Stimuli 1. Dieses Verfahren beginnt mit der Isolierung des Längsmuskel / myenteric Plexus (LMMP) Herstellung durch AbziehenAus der äußeren Muskulatur des Magen-Darm-Trakt. Diese dramatisch verkürzt sich auf Kontamination Probleme, die bei der Schleimschicht in der Isolierung beteiligt ist auftreten. Dadurch ist dieses Verfahren ideal für die Untersuchung der neuronalen Steuerung der Motilität anstatt sekretorischen Aktionen des ENS. Die hier vorgestellte Methode Ergebnisse in einer Mischkultur von enterischen Neuronen und Gliazellen. Mindestens zwei verschiedene Arten von Neuronen sind auf vorherige elektrophysiologischen und immunozytochemische Beobachtungen 9 basiert. Die Anwesenheit von Glia ist sehr vorteilhaft, da sie nicht nur ein wichtiger Zelltyp in ihrem eigenen Recht zu studieren, aber sie tragen zum Überleben der Neuronen 10 magensaftresistente und pflegen nativen Rezeptor-Expression auf der neuronalen Zelloberfläche 11. Darüber hinaus kann Mängel magensaftresistente Glia zu abnormen gastrointestinale Motilität Krankheitszuständen, geprägt &#39;Neuro-gliopathies &quot;12 führen. Daher legte die ENS Kultur hier rrgebnisse in mehreren Zelltypen, die reif für die Untersuchung sind. Die Vorteile dieser Methode sind einfache Isolation, preiswertes Tool Anforderungen, und eine kurze Zeit, um die Technik von erfahrenen Labor-Mitarbeiter zu meistern. Einschränkungen der Methode sind insgesamt gering Zellausbeute von hoher Gewebe Volumen und den Ausschluss von ENS Neuronen aus Schleimhaut und Submukosa Plexi. Dieses Verfahren wird als sehr vorteilhaft für Wissenschaftler, spezialisiert auf Elektrophysiologie, Immunhistochemie, single-cell PCR und andere Methoden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenzien</td></tr><tr><td>Fisherbrand Deckglas für Wachstumsdeckgläser (12 mm Durchmesser)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P6407- 5 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Kann sich im Labor vorbereiten&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Steriles Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr><tr><td>50 ml Steriles Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58,44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74,55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW137,99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120,4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84,01</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180,16</td></tr><tr><td>CaCl22H2</td><td>O Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 Medien</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Qualität Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr><tr><td>Antibiotikum/Antimykotikum 100x flüssig</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal A media</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gliaabgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF)</td><td>Neuromik</td><td>PR27022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Präparierschere mit scharfer Spitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Kann jede Marke</td></tr> verwenden <tr><td>Disparierzange</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr><tr><td>Applikatoren mit Wattespitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden 250 ml Messglasbecher</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden 2 L Glas Erlenmyer Flasche</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr><tr><td>Kunststoffstab (Kinderpinsel)</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5% CO2</td></tr><tr><td>10 ml Leur-Lock Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden 21 G x 1 1/2 in. Injektionsnadel</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden Kollagenase Typ 2</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2 ml Mikrozentrifuge Eppendorf Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden Nitrex Mesh 500 & micro; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenset</td> jeder Marke <td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr><tr><td>Sharpeining Stone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr> verwenden<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 Biologische Sicherheitswerkbank (Zellkulturhaube)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Kann jede verwenden Marke</td></tr><tr><td>10 L Schütteln Wasserbad</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden Mikrozentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Kann eine einzelne größere Zentrifuge mit Größenadaptern verwenden</td></tr><tr><td>Allegra 6 Serie Zentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td>366816</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden HuluMixer Probenmischer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>AutoFlow Water Jacket CO2 Inkubator</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr></tbody></table>

ein<em&gt; in-vitro</em&gt; vorbereitung von isolierten neuronen und glia enteric vom plexus myentericus der erwachsenen maus

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Die enterale Nervensystem ist ein riesiges Netz von Neuronen und Gliazellen, die die Länge des Magen-Darm-Trakt, die funktionell steuert gastrointestinalen Motilität. Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von einer gemischten Population von Neuronen und Gliazellen aus dem Plexus myentericus beschrieben. Die primären Kulturen kann für mehr als 7 Tage gehalten werden, mit Verbindungen zwischen den Neuronen entwickeln und Gliazellen. Die Längsmuskel Streifen mit dem beigefügten myentericus Plexus aus dem zugrunde liegenden kreisförmigen Muskel der Maus Ileum oder Kolon abgestreift und einer enzymatischen Verdauung. In sterilen Bedingungen werden die isolierten neuronalen und Gliazellen Bevölkerung im Pellet nach Zentrifugation erhalten und plattiert auf Deckgläsern. Innerhalb von 24-48 Stunden, tritt Neuritenwachstum und Neuronen kann durch pan-neuronalen Marker identifiziert werden. Nach zwei Tagen in Kultur isolierten Neuronen feuern Aktionspotentiale durch Patch-Clamp-Studien beobachtet. Darüber hinaus können auch magensaftresistente Glia identif seinied von GFAP-Färbung. Ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in enger Apposition bildet innerhalb von 5 - 7 Tage die. Enteric Neuronen können individuell und direkt untersucht mit Methoden wie Immunhistochemie, Elektrophysiologie, Kalzium-Imaging und Single-Cell-PCR. Darüber hinaus kann dieses Verfahren in genetisch veränderte Tiere durchgeführt werden. Diese Methode ist einfach durchzuführen und kostengünstig. Insgesamt macht dieses Protokoll die Komponenten des enteralen Nervensystems in einem leicht manipuliert Weise, so dass wir Ihnen besser entdecken Sie die Funktionalität der ENS in normalen und Krankheitszuständen.

Unmittelbar nach der Isolierung von LMMP-abgeleiteten Zellen sind Neuronen und andere Zelltypen noch nicht leicht erkennbar. Lebende, runde Zellen mit unklarem Phänotyp sind sichtbar, ebenso wie Gewebe-Debriskörperchen von unvollständig verdauten Gewebefragmenten und Bindegewebe. Dieser Zelltrümmerschutt ist unbedenklich und wird größtenteils bei dem ersten Mediumwechsel in zwei Tagen entfernt. Versuchen Sie nicht, die Objektträger vorher zu reinigen, da ansonsten auch gesunde, lebensfähige Zellen entfernt würden.
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Wir demonstrieren ein Zellkulturprotokoll für die direkte Untersuchung von neuronalen und glialen Komponenten des enterischen Nervensystems. Eine Neuron/Glia-Mischkultur auf Deckgläsern wird aus dem myenterischen Plexus einer adulten Maus hergestellt und bietet die Möglichkeit, die Funktion einzelner Neuronen und Gliazellen elektrophysiologisch, immunhistochemisch usw. zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, funktionell lebensfähige Neuronen und CLIA aus dem adulten Mäuse-Muskelplexus zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die sterile Zellkulturoberfläche mit Polylysin und Laminin beschichtet wird. Der zweite Schritt besteht darin, Lösungen und den Operationsbereich für die Isolierung des Muskelplexus vorzubereiten. Als Nächstes entfernen Sie den Magen-Darm-Trakt und isolieren den gewünschten Abschnitt, um eine Vorbereitung des longitudinalen Muskel-Meissner-Plexus herzustellen. Der letzte Schritt besteht darin, das LMMP nacheinander mit Kollagenase und Trypsin zu verdauen und anschließend die Zellen auf vorcodierten Zellkulturoberflächen auszuplatzieren. Letztendlich können Elektrophysiologie, Immunzytochemie und Einzelzell-PCR verwendet werden, um die Wirkungen enterischer Neurone, Gliazellen oder der Interaktion zwischen diesen beiden Zelltypen zu untersuchen.Den Vorgang wird Dr. Trisha Har Smith, eine Postdoktorandin in unserem Labor, demonstrieren, und ihr assistieren wird Joy Gombe, eine Doktorandin in unserem Labor. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken liegt darin, dass die Neuronen und Gliazellen aus der erwachsenen Maus stammen. Dies ermöglicht voll funktionsfähige Neuronen und Gliazellen, die potenziell von genetisch modifizierten Tieren stammen können.Obwohl diese Methode Einblicke in die elektrischen Eigenschaften von Neuronen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Methoden wie Immuncytochemie, Einzelzell-PCR und Echtzeit-Kalzium-Bildgebung anwenden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine euthanasierte Maus in dorsaler Rückenlage auf die chirurgische Oberfläche bringen.Reinigen Sie anschließend die Bauchhaut mit 70 % Ethanol. Heben Sie sie dann mit einer Pinzette an und öffnen Sie mit einer Schere die Bauchhöhle, um die inneren Verdauungsorgane freizulegen. Heben Sie danach einen Abschnitt des Ileums an, um das Mesenterium freizulegen.Entfernen Sie den Magen-Darm-Trakt und durchtrennen Sie das Mesenterium mit einer Schere. Entfernen und entflechten Sie dann vorsichtig Ileum und Kolon. Achten Sie darauf, das Mesenterium nach dem vollständigen Entflechten des Darms nicht vom Ileum und Kolon abzuziehen.Entfernen Sie das Ileum, indem Sie den Darm distal zum Magen und proximal zum Z盲cum durchtrennen. Dieses Verfahren kann auch mit einem kolorektalen Gewebe durchgef眉hrt werden, indem man den Dickdarm vom distalen Bereich zum Z盲cum bis zum proximalen Bereich zum Anus entfernt. Anschlie脽end wird das Ileum in drei oder mehr gro脽e St眉cke geschnitten.Reinigen Sie die Darmabschnitte vorsichtig mit Krebs-Lösung, bis sämtliche Fäkalien in einen separaten Abfallbehälter überführt sind. Legen Sie den gereinigten Abschnitt in den mit „clean“ gekennzeichneten Behälter mit Krebs-Lösung und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Ileum gereinigt ist. Um das LMMP zu entfernen, schneiden Sie das Ileum in zwei bis vier Zentimeter kurze Segmente. Anschließend ein Segment des Ileums auf einen Kunststoff- oder Glasstab legen. Das Ileum sollte fest sitzen, jedoch weder locker noch straff sein. Drehen des Magen-Darm-Trakts um den Stab verhindern, indem das Rohr vorsichtig mit dem Daumen an den Stab angeheftet wird.Entfernen Sie anschließend vorsichtig mit der Pinzette noch am Magen-Darm-Trakt anhängende Reste des Mesenteriums. Danach trennen Sie die LMMP von dem darunterliegenden Ringmuskel, indem Sie zunächst vorsichtig mit der Kante der Pinzette entlang der gesamten Linie, an der das Mesenterium befestigt war, von oben nach unten des Segmentes entlangreiben.Erzeugen Sie anschließend vorsichtig eine Öffnung im Längsmuskel. Lösen Sie dann den Längsmuskel mit einem mit Crebs benetzten Wattestäbchen, beginnend an der Spitze der Öffnung, durch leichteste horizontale Striche bei äußerst geringem Druck, bis sich der Längsmuskel gerade vom Ringmuskel zu trennen beginnt. Wiederholen Sie dies entlang des gesamten Streifens in Richtung der mesenterialen Ansatzstelle.Danach vorsichtig von oben nach unten und zurück entlang des Darmrohrs arbeiten, wobei sich der Längsmuskel langsam ringförmig vom Kreismuskel löst. Sobald dies abgeschlossen ist, löst sich das LMMP von selbst vom verbleibenden Darmrohr.Danach den resultierenden dünnen Streifen aus Längsmuskel in das mit LMMP beschriftete Becherglas geben und die Verfahren für alle Segmente in diesem Verfahrensschritt wiederholen. Die LMMP-Segmente zur Spülung in die Verdauungslösung geben. Anschließend das LMMP mit einer Schere in winzige Stücke schneiden.Danach 60 Minuten lang im 37 Grad Celsius warmen Wasserbad unter Zugabe von Carbogen vorsichtig schütteln und inkubieren. Nach Beendigung der Verdauung sammeln die Zellen durch Zentrifugation acht Minuten lang bei 356 ×g in einer auf 4 Grad Celsius gekühlten Zentrifuge.Bereiten Sie in der Zwischenzeit im Zellkulturwerk eine 0,05 %ige Trypsin-Lösung vor, indem Sie ein Milliliter erwärmte 0,25 %ige Trypsin-Lösung und vier Milliliter erwärmtes HBSS in ein steriles 50-Milliliter-Zellkulturrohr geben. Nach der Zentrifugation entsorgen Sie vorsichtig den Überstand, entfernen das Zellpellet und geben es in ein sauberes Röhrchen mit fünf Milliliter 0,05 %iger Trypsin-Lösung. Danach inkubieren Sie die Zellen sieben Minuten lang in der 0,05 %igen Trypsin-Lösung im 37-Grad-Celsius-Wasserbad unter Schütteln und neutralisieren anschließend das Trypsin mit 10 Milliliter kaltem Spülmittel.Nach siebenminütiger Trypsin-Behandlung die Zellen anschließend acht Minuten bei 356 ×g zentrifugieren. In der Zwischenzeit einen Abschnitt des sterilisierten TX-Netzes auf ein steriles 15-Milliliter-Zellkulturgefäß legen. Nach der Zentrifugation das Überstandmedium vorsichtig entfernen und das Zellgemisch durch Pipettieren in drei Milliliter resuspendieren.Vollständiges Neuronenmedium. Alle Änderungen sollten sehr vorsichtig durchgeführt werden, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, anschließend die Zellsuspension durch ein NYX-Netz in ein sauberes 15-Milliliter-Zellkulturrohr filtrieren. Die Zellen durch Zentrifugation acht Minuten lang bei 356 ×g sammeln.Danach das Überstand entfernen und verwerfen. Die Zellen in 1200 Mikroliter vollständigem Neuronenmedium resuspendieren. Anschließend die Zellen vorsichtig mit einer ein-Milliliter-Plastikpipettenspitze umrühren.Seien Sie vorsichtig, um keine Luftblasen zu erzeugen, pipettieren Sie langsam und vorsichtig, bis die meisten Klumpen aufgelöst sind und die Zellen in der Flüssigkeit suspendiert sind. Geben Sie nun 750 Mikroliter des kompletten Mediums in jede der 12 Vertiefungen, die einen vorcodierten Glasdeckel enthalten. Anschließend geben Sie 100 Mikroliter der titrierten Zellsuspension hinzu.Die Neuronen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Alle zwei Tage die Hälfte des Zellkulturmediums erneuern. Die Neuronen sind nach ein bis zwei Tagen im Kulturmedium für elektrophysiologische Ableitungen bereit.Hier ist die immunhistochemische Charakterisierung enterischer Neuronen dargestellt. Lea, isoliert aus der Maus. Die konfokale Mikroskopie der Längsmuskulatur zeigte eine neuronenspezifische Färbung für Beta-Tubulin-III im gesamten Präparat der ilealen Längsmuskulatur der Maus.Und dies sind die Zellen, die aus den LMMP-Präparationen isoliert wurden und die Neuronen enthalten, die positiv auf Calbindin und Retin gefärbt wurden, sowie Gliazellen, die hier mit dem gliaspezifischen Marker GFAP sichtbar gemacht wurden. Allerdings wurde keine Färbung beobachtet, wenn der primäre Antikörper weggelassen wurde. Hier sind die Neuronen und Gliazellen, die aus der Maus-Längsmuskulatur isoliert wurden und in engem räumlichen Abstand zueinander wachsen.Die konfokalen Mikroskopieaufnahmen zeigen die grünen Neuronen und das rote ggl, die leicht nebeneinander wachsen und in vitro offenbar miteinander interagieren. Diese Abbildung zeigt die Elektrophysiologie der kultivierten enterischen Neuronen und CLIA im Strom-Klemm-Modus. Alle Neuronen zeigten Aktionspotentiale nach Strominjektion.CLIA zeigen keine Aktionspotenziale, weisen jedoch große elektrotonische Potenziale als Reaktion auf Strominjektion auf. Die aus dem Ileum der Maus kultivierten Neuronen bilden eine elektrophysiologisch heterogene Population. Im Strom-Klemm-Modus führt eine Strominjektion von 0,09 Nanoampere in Neuronen zu Aktionspotenzialen.HP-negative Neuronen kehren unmittelbar nach der Stimulation zum Ruhepotential der Membran zurück. HP-positive Neuronen hingegen zeigen eine AHP nach der Stimulation, bei der das Ruhepotential der Membran unter die Ausgangsbasis fällt, bevor es langsam zum ursprünglichen Wert zurückkehrt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass Glasgeräte und chirurgische Instrumente so sauber wie möglich gehalten werden. Außerdem sollten die Zellen vorsichtig inkubiert und durchmischt werden, und die Hälfte des Zellkulturmediums sollte alle zwei Tage gewechselt werden, nachdem das Verfahren durchgeführt wurde. Methoden wie die Elektrophysiologie und die Immunzytochemie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie Ionenkanäle im Darm auf eine medikamentöse Behandlung reagieren, sowie um Erkenntnisse über die Expression von Proteinen in Neuronen und LIA zu gewinnen und zu untersuchen, wie die Interaktion dieser beiden Zelltypen durch verschiedene Behandlungen nach der Entwicklung verändert wird.Diese Technik hat für Forscher auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg geebnet, die Grundfunktionen von Neuropathien und neuropathischen Erkrankungen des enterischen Nervensystems bei genetisch modifizierten Tieren zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Neuronen und Gliazellen aus dem TER-Plexus des enterischen Nervensystems erwachsener Mäuse isoliert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein alternativer Weg zur Isolierung von embryonalen Maus-Motoneurone aus dem Rückenmark beschrieben. Die Methode berücksichtigt die Tatsache, dass Lektin kann die geringe Affinität nerve growth factor receptor p75NTR binden. Das Lektin-basierte preplating ermöglicht eine Reinigung ähnlich wie mit einem spezifischen Antikörper gegen das p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung enterischer Gliazellen aus der Submukosa und der Lamina propria des Mausdarms. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Extraktion von Submukosa- und Lamina propria-Gewebe, der Isolierung der enterischen Gliazellen und der Kultivierung der Zellen auf einer beschichteten Well-Platte zur Etablierung einer enterischen Gliazellkultur erforderlich sind.

Isolierung enterischer Gliazellen aus der Submukosa und der Lamina propria einer Maus

Muskel sensorischen Neuronen sind in proprioceptor Signalübertragung beteiligt und auch auf Stoffwechselzustand und Verletzungen bezogene Ereignisse zu berichten. Wir beschreiben einen erwachsenen Maus in vitro Muskel-Nerven Vorbereitung für Studien über Stretch-aktivierte Muskel Afferenzen.

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Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Durchführung elektrophysiologischer Einzelfaser-Aufzeichnungen an einem in vitro Maus-Darmnervenpräparat.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in der Darmwand, das die Darmreflexe steuert. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Aufzeichnung der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Lebendpräparaten von ENS unter Verwendung von Ca2+-Bildgebung.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Das enterische Nervensystem wird von Neuralleistenzellen gebildet, die sich vermehren, wandern und den Darm besiedeln. Neuralleistenzellen differenzieren sich in Neuronen mit Markern, die spezifisch für ihren Neurotransmitter-Phänotyp sind. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zum Präparieren, Fixieren und Immunfärben des embryonalen Magen-Darm-Trakts der Maus, um die Expression von Neurotransmittern des enterischen Nervensystems sichtbar zu machen.

Immunfärbung zu Murine enterische Nervensystem Entwicklung visualisieren

Hier beschreiben wir die Isolation der magensaftresistenten Gliazellen aus Darm-Submukosa mit sequentiellen EDTA Inkubationen chelatkomplex zweiwertigen kationen und dann Inkubation in nicht-enzymatische Zelle-Recovery-Lösung. Beschichtung der daraus resultierenden Zellsuspension auf Poly-D-Lysin und Laminin führt zu einer hoch angereicherten Kultur der submucosal Gliazellen für Funktionsanalyse.

Isolierung der magensaftresistenten Gliazellen aus der Submukosa und Lamina Propria der Erwachsenen Maus

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur In-vitro-Isolierung mehrerer Gliazellpopulationen aus einem Maus-ZNS. Diese Methode ermöglicht die Segregation von regionalen Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten, um die Phänotypen jedes einzelnen in einer Vielzahl von Kultursystemen zu untersuchen.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von gereinigten Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus und erleichtert spätere Anwendungen wie RNA-Analyse und Zellkultur. Es umfasst detaillierte Zelldissoziationsmethoden und -verfahren, die darauf ausgelegt sind, sowohl die Qualität als auch die Ausbeute isolierter Zellen zu verbessern.

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Lernen Sie die Isolierung von Neuronen und Gliazellen aus dem Plexus myentericus adulter Mäuse. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Studien und Untersuchungen zur Interaktion enterischer Nervenzellen.

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