Ein In-vitro Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, funktionell lebensfähige Neuronen und CLIA aus dem myenterischen Plexus der adulten Maus zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die sterile Zellkulturoberfläche mit Polylysin und Laminin beschichtet wird. Der zweite Schritt besteht darin, Lösungen und Operationsgebiete für die Isolierung des Plexus myentericus vorzubereiten.

Entfernen Sie anschließend den Magen-Darm-Trakt und isolieren Sie den gewünschten Abschnitt, um eine Vorbereitung des Plexus myentericus longitudinal zu erstellen. Der letzte Schritt besteht darin, das LMMP in Kollagenase und Trypsin sequentiell zu verdauen, gefolgt von der Beschichtung der Zellen auf den vorkodierten Zellkulturoberflächen. Letztendlich können Elektrophysiologie, Immunzytochemie und Einzelzell-PCR verwendet werden, um die Wirkung von enterischen Neuronen, Gliazellen oder die Interaktion zwischen diesen beiden Zelltypen zu untersuchen.

Verfahren wird von Dr. Trisha Har Smith, einer Postdoktorandin in allen Laboratorien, demonstriert und von Joy Gombe, einer Doktorandin in allen Laboratorien, unterstützt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken besteht darin, dass die Neuronen und Gliazellen von der erwachsenen Maus stammen. Dies ermöglicht voll funktionsfähige Neuronen und Gliazellen, die möglicherweise von gentechnisch veränderten Tieren stammen können.

Diese Methode kann jedoch Einblicke in die elektrischen Eigenschaften von Neuronen geben. Es kann auch auf andere Methoden wie Immunzytochemie, Einzelzell-PCR und Echtzeit-Kalziumbildgebung angewendet werden. Beginnen Sie diesen Eingriff, indem Sie eine eingeschläferte Maus dorsal liegend auf die Operationsfläche legen.

Reinigen Sie anschließend die Bauchhaut mit 70% Ethanol. Heben Sie es dann mit einer Pinzette an und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Schere, um die inneren Verdauungsorgane freizulegen. Heben Sie danach einen Teil des Ileums an, um das Mesentar freizulegen.

Entfernen Sie den Magen-Darm-Trakt und schneiden Sie das Mesenterium mit einer Schere durch. Entfernen und entwirren Sie dann vorsichtig das Ileum und den Dickdarm. Achten Sie darauf, das Mesenterium nicht aus dem Ileum und dem Dickdarm zu ziehen, nachdem der Darm in voller Länge entwirrt wurde.

Entfernen Sie das Ileum, indem Sie den Darm distal des Magens und proximal des Blinddarms durchschneiden. Dieses Verfahren kann auch mit einem Dickdarmgewebe durchgeführt werden, indem der Dickdarm vom distalen zum Blinddarm und proximal zum Anus entfernt wird. Als nächstes teile ich das Ileum in drei oder mehr große Stücke.

Reiben Sie die Kreb-Lösung vorsichtig durch den Darmbereich, bis alle Fäkalien in einen separaten Abfallbehälter entfernt sind. Legen Sie den sauberen Abschnitt in den Behälter von Krebs mit der Aufschrift clean und wiederholen Sie die Vorgänge, bis das gesamte Ileum gereinigt ist. Um das LMMP zu entfernen, schneiden Sie das Ileum in zwei bis vier Zentimeter kleine Segmente.

Legen Sie anschließend ein Segment Ileum auf einen Kunststoff- oder Glasstab. Das Ileum sollte eng anliegen, aber nicht locker oder straff sein. Verhindern Sie, dass sich der Magen-Darm-Trakt um den Stab dreht, indem Sie den Schlauch vorsichtig mit dem Daumen an den Stab drücken.

Entfernen Sie dann vorsichtig Mesenterienstücke, die noch mit einer Pinzette am Magen-Darm-Trakt befestigt sind. Trennen Sie danach den LMMP vom darunter liegenden Zirkelmuskel. Indem man zuerst den Rand der Pinzette sanft entlang der gesamten Linie reibte, an der das Mesenterium von oben nach unten am Segment befestigt war.

Anschließend legen Sie vorsichtig eine Lücke in der Längsmuskulatur an. Dann toupieren Sie den Längsmuskel vorsichtig mit einem Wattestäbchen ab, das mit Kreben besetzt ist, beginnend am oberen Ende der Lücke, mit dem leichtesten horizontalen Strich und mit sehr leichtem Druck, bis der Längsmuskel gerade beginnt, sich vom kreisförmigen Muskel zu lösen. Führen Sie dies über den gesamten Streifen entlang des mesentaren Befestigungspunkts aus.

Arbeiten Sie dann vorsichtig um den Magen-Darm-Schlauch herum, indem Sie sich von oben nach unten und zurück bewegen. Da der Längsmuskel langsam vom Zirkelmuskel rund um die Röhre getrennt wird. Wenn dies abgeschlossen ist, löst sich das LMMP auf natürliche Weise von der verbleibenden Magen-Darm-Sonde.

Legen Sie dann den resultierenden dünnen Streifen des Längsmuskels in das Becherglas mit der Bezeichnung LMMP und wiederholen Sie die Verfahren für alle Segmente in diesem Verfahren. Geben Sie die Spülung in LMMP-Segmente in die Aufschlusslösung. Schneiden Sie dann den LMMP mit einer Schere in winzige Stücke.

Als nächstes verdauen Sie sie 60 Minuten lang. In einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit einem Shaker, während es sanft mit Carbogen beblasen wird. Nachdem der Verdau abgeschlossen ist, werden die Zellen acht Minuten lang bei 356 g in einer Zentrifuge zentrifugiert und auf vier Grad Celsius abgekühlt

In der Zwischenzeit wird 0,05%ige Trypsinlösung in einer Zellkulturhaube hergestellt, indem ein Milliliter erwärmtes 0,25%iges Trypsin und vier Milliliter erwärmtes HBSS in ein steriles 50-Milliliter-Zellkulturröhrchen gegeben wird. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, entfernen Sie vorsichtig das Zellpellet und geben Sie es in ein sauberes Röhrchen mit fünf Millilitern 0,05%iger Tryinlösung. Als nächstes verdauen Sie die Zellen in 0,05%iger Tryinlösung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad unter siebenminütigem Schütteln und neutralisieren Sie Tryin mit 10 Millilitern kaltem Spülmedium.

Nach sieben Minuten Trips in der Behandlung zentrifugieren Sie die Zellen acht Minuten lang bei 356 g. In der Zwischenzeit den Abschnitt des sterilisierten TX-Netzes auf ein steriles 15-Milliliter-Zellkulturröhrchen ausbalancieren. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen, das Zellgemisch vorsichtig resuspendieren, indem es in drei Millilitern ausgelöst wird.

Komplette Neuronenmedien. Alle Änderungen sollten sehr vorsichtig vorgenommen werden. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, filtrieren Sie die Zelllösung durch das NYX-Netz in ein sauberes 15-Milliliter-Zellkulturröhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation für acht Minuten bei 356 g.

Entfernen Sie danach den Überstand und entsorgen Sie ihn. Suspendieren Sie die Zellen in 1200 Mikrolitern vollständigen Neuronenmedien. Anschließend werden die Zellen vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze aus Kunststoff behandelt.

Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erzeugen, pipettieren Sie langsam und vorsichtig, bis die meisten Brocken aufgebrochen sind und die Zellen in Flüssigkeit suspendiert sind. Geben Sie nun 750 Mikroliter des kompletten Mediums in jede der 12 Vertiefungen, die einen vorcodierten Glasabdeckschirm enthalten. Fügen Sie dann 100 Mikroliter der bewerteten Zelllösung hinzu.

Inkubieren Sie die Neuronen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxidwechsel. Die Hälfte der Mobilfunkmedien alle zwei Tage. Neuronen sind nach ein bis zwei Tagen in Kultur bereit für elektrophysiologische Aufzeichnungen.

Hier ist die immunhistochemische Charakterisierung von enterischen Neuronen dargestellt. Lea von der Maus isoliert. Die konfokale Längsmikroskopie des Muskels zeigte die neuronale spezifische Beta-3-Tubulin-Färbung in der gesamten Präparation des Längsmuskels des Mount Ileal aus der Maus.

Und das sind die Zellen, die aus den LMMP-Präparaten isoliert wurden, die die Neuronen enthalten, die positiv für die cal-Bindung gefärbt sind, und die hier gezeigten Retin-Gliazellen wurden mit dem gliaspezifischen Marker GFAP visualisiert. Es wurde jedoch keine Färbung beobachtet, wenn der primäre Antikörper weggelassen wurde. Hier sind die Neuronen und Gliazellen, die aus dem Längsmuskel der Maus isoliert wurden und in unmittelbarer Nähe zueinander wachsen.

Die konfokalen Mikroskopiebilder zeigen, dass die grünen Neuronen und die roten ggl leicht nebeneinander wachsen und in vitro zu interagieren scheinen. Diese Abbildung zeigt die Elektrophysiologie der kultivierten enterischen Neuronen und CLIA im Strom-Clamp-Modus. Alle Neuronen zeigten bei der Strominjektion Aktionspotentiale.

CLIA haben keine Aktionspotentiale, zeigen aber große elektrotonische Potentiale als Reaktion auf die Strominjektion. Die Neuronen, die aus dem Ileum der Maus kultiviert werden, sind eine elektrophysiologische heterogene Population. Im Strom-Clamp-Modus führt eine Strominjektion von 0,09 Nanoampere in Neuronen zu Aktionspotentialen.

Ein HP-negatives Neuron kehrt nach der Stimulation sofort in das Ruhemembranpotential zurück. Während ein HP positiv ist, zeigen Neuronen nach der Stimulation einen A HP, bei dem das Ruhemembranpotential unter den Ausgangswert fällt, bevor es langsam zum Ausgangswert zurückkehrt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Glaswaren und chirurgische Instrumente so sauber wie möglich zu halten. Iterieren und blasen Sie die Zellen auch vorsichtig und wechseln Sie die Hälfte des Zellkulturmediums alle zwei Tage nach diesem Verfahren. Methoden wie Elektrophysiologie und Immun-Zytochemie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie Ionenkanäle im Darm auf eine medikamentöse Behandlung reagieren, und um mehr über die Expression von Proteinen in Neuronen und Lia zu erfahren und wie das Zusammenspiel dieser beiden Zelltypen durch verschiedene Behandlungen nach ihrer Entwicklung verändert wird.

Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg geebnet, um die grundlegenden Funktionen von Neuropathien und g-Neuropathien des enterischen Nervensystems bei genetisch veränderten Tieren zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Neuronen und Gliazellen aus dem TER-Plexus des enterischen Nervensystems der erwachsenen Maus isoliert.