Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein gesamtes Maushirn mit einer Auflösung im Mikrometerbereich zu rekonstruieren und zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein fixiertes Maushirn in einer integrierten Tetrahydrofuran-Serie dehydriert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Probe in Benzylether zu klären.

Anschließend wird das Gehirn mit einem konfokalen Lichtblattmikroskop abgebildet. Der letzte Schritt besteht darin, Software zu verwenden, um die aufgenommenen Bildstapel auszurichten und zusammenzufügen. Letztendlich kann ein Visualisierungswerkzeug mit mehreren Auflösungsstufen genutzt werden, um sich durch das rekonstruierte Bildvolumen zu bewegen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der konfokalen Mikroskopie oder der Lichtmikroskopie besteht darin, dass das gesamte Volumen eines Maushirns innerhalb weniger Tage abgebildet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise die Verteilung verschiedener neuronaler Zelltypen im gesamten Gehirn. Bietet diese Metallkappe Einblicke in die feine strukturelle Autonomie des Gehirns?

Es kann auch auf Mausembryonen oder Fußfliegen angewendet werden, was zeigt, dass das Verfahren erneut durchgeführt wird. Ein Doktorand aus meinem Labor. Um dieses Protokoll zu beginnen, führen Sie die standardmäßige Fixierung von Maushirnen über eine transkardiale Perfusion durch und anschließend eine Nachfixierung über Nacht, bevor Sie die Dehydrierung und Klärung durchführen.

Danach, da das Dehydrierungslösungsmittel THF die XFP-Fluoreszenz stark löscht, Filtration durchführen, um Peroxide mit basisch aktiviertem Aluminiumoxid unter Verwendung einer Chromatographiesäule zu entfernen; dabei vermeiden, dass die Säule reißt, was die Peroxidentfernung beeinträchtigen würde, und einen Stabilisator zur Endlösung hinzufügen. Auch wenn das THF vor der Filtration bereits stabilisiert war, wird der Stabilisator durch das Aluminiumoxid zurückgehalten. Beachten Sie, dass THF ohne Stabilisator große Mengen an Peroxiden bilden kann und explosionsgefährdet sowie gefährlich ist.

Als Nächstes dehydrieren Sie das gesamte Maushirn in einer aufeinanderfolgenden Serie von THF in reinem Wasser. Anschließend stellen Sie das Gefäß mit der Probe auf ein rotierendes Rad, um eine Belichtung mit Licht zu vermeiden. Wickeln Sie das Gefäß mit einer Aluminiumfolie ein.

Filtern Sie schließlich das Klärungslösungsmittel mit Aluminiumoxid mithilfe eines Trenntrichters. Klären Sie anschließend die Probe in 100 % DBE, wobei die Lösung nach drei und sechs Stunden gewechselt wird, sobald das Gehirn transparent erscheint. Normalerweise wird die Probe eine Stunde nach dem zweiten DBE-Wechsel mit einer der hier gezeigten Methoden auf einer geneigten Bildgebungsschale befestigt.

Direktes Montieren über eine Agros-Scheibe oder über einen Agro-Lautsprecher zum direkten Montieren: Tauchen Sie die Probe vorsichtig in eine der Spitzen, um die Aros-Scheibe einzutauchen. Eine Scheibe aus 6 % Aros-Gel auf den Spitzen. Befestigen Sie dann die Probe vorsichtig auf der Agros-Scheibe mit Acrylkleber und warten Sie etwa eine Minute zum Aushärten, um sie zu montieren.

Unter Verwendung des Agros-Bechereinsatzes wird ein Becher aus 3 % Agros-Gel auf die Spitzen aufgebracht. Anschließend wird die Probe vorsichtig auf den Boden des Bechers platziert. Nach dem Befestigen der Probe nach einer dieser Methoden platzieren Sie die Bildgebungsplatte mit einer Pinzette in die Probekammer.

Füllen Sie dann die Kammer mit Klärungslösung. Bereiten Sie anschließend die Tomographie vor. Entfernen Sie zuerst den Spalt, um so viel Fluoreszenz wie möglich zu sammeln, und beleuchten Sie dann die Probe mit geringer Laserleistung.

Um eine Photobleiche zu verhindern, bewegen Sie die Probe in den drei x-, y- und z-Richtungen mithilfe des softwaregesteuerten Mikro-Positioniersystems. Identifizieren Sie für jede Richtung die minimalen und maximalen Koordinaten, bei denen die Probe noch innerhalb des Sichtfeldes der Kamera beleuchtet ist. Geben Sie anschließend die ermittelten Koordinaten als Parameter für die Vor-Tomographie-Unterprozedur ein.

Geben Sie außerdem den Abstand zwischen benachbarten Stapeln an, der in der Tomographie und im Pre-Tomographie-Abtastschritt in Z-Richtung verwendet werden soll. Starten Sie abschließend die Pre-Tomographie, bei der die Bilder in jedem Stapel mit den in dem vorherigen Schritt festgelegten Z-Abtastparametern aufgenommen werden. Um die Aufnahme zu beginnen, bewegen Sie zunächst die Probe mithilfe des Mikro-Positioniersystems außerhalb des Lichtblatts.

Erhöhen Sie dann die Laserleistung und stoppen Sie die Bewegung aller Scansysteme, um nur eine feste Linie in der Mitte des Sichtfeldes zu beleuchten. Bringen Sie anschließend den Spalt an und richten Sie ihn mithilfe des Autofluoreszenzsignals der Klärungslösung aus. Nun sollte die Spaltlinie deutlich in der Mitte des Sichtfeldes sichtbar sein.

Aktivieren Sie nun das Scansystem erneut. Verringern Sie die Laserleistung und bewegen Sie die Probe mithilfe des Mikro-Positioniersystems in das Lichtblatt hinein. Beachten Sie, dass die beim Einsatz des Spalts verwendete Laserleistung höher sein wird als die ohne Spalt verwendete.

Da der räumliche Filter einen nicht zu vernachlässigenden Anteil des Lichts blockiert, stellen Sie mithilfe der Steuersoftware die Amplitude und den Offset der Scanning- und d-Scanning-Systeme so ein, dass die Bilder klar und hell erscheinen. Danach legen Sie den geeigneten Z-Schritt für das Experiment fest und führen die Tomographie-Aufnahmesoftware aus. Das Volumen wird in vielen parallelen, teilweise überlappenden Stapeln abgebildet, und die Bilder werden in einer hierarchischen Ordnerstruktur gespeichert.

Um der Näherungssoftware ein vollständiges kubisches Volumen zur Verfügung zu stellen, ergänzen Sie das aufgenommene Volumen durch synthetische schwarze Bilder, also Bilder vom gleichen Typ und mit denselben Dimensionen wie die aufgezeichneten, jedoch mit einer Intensität von null, mithilfe einer automatisierten Software. Starten Sie anschließend die VA A 3D-Software mit den installierten Plugins Terra, Stitcher und Tarly, und laden Sie das Terra-Stitcher-Plugin. Wählen Sie das Verzeichnis aus, das das abgebildete Volumen enthält, geben Sie die relativen Ausrichtungen der Achsen bezüglich eines referenziellen rechtshändigen Koordinatensystems an und legen Sie die Voxelgröße fest.

Starten Sie nun den ersten Teil des Stitchings. Die Software berechnet die relative Verschiebung zwischen Paaren von Stapeln und findet eine insgesamt optimale Anordnung aller Stapel zusammen. Wählen Sie aus, ob das zusammengesetzte Volumen im Einzelauflösungs- oder im Multiauflösungsformat gespeichert werden soll. Die Leiter ermöglicht die Multiauflösungs-Visualisierung mit dem Tarly-Plugin.

In beiden Fällen, wenn das Bild mit höherer Auflösung größer als einige Gigabyte ist, wählen Sie zusätzlich den Speichermodus für mehrere Stapel aus und geben Sie die Größe der einzelnen Teilstapel an. Dies ermöglicht einen effizienten Zugriff auf die gespeicherten Daten. Starten Sie nun den zweiten Teil der Montage.

Die Software führt die ausgerichteten Stapel zusammen und speichert sie entweder im Einzel- oder Mehrfachstapel-Modus. Schließen Sie nach Abschluss das Terra-Stitcher-Plugin. Laden Sie danach das Terra-Fly-Plugin.

Wählen Sie den Ordner mit dem mehrschichtigen, mehrauflösenden Volumen aus und geben Sie die Größe der Fuchsröhre sowie die Achsenorientierungen an. Das Volumen wird in der niedrigsten Auflösung geladen. Um auf eine höhere Auflösung zu zoomen, verwenden Sie einfach das Mausrad.

Alternativ kann man auf einen bestimmten Punkt des Bildes doppelklicken oder eine Vergrößerung um eine vorhandene Landmarke auswählen bzw. die Koordinaten des interessierenden Volumens direkt angeben. Um zu einer niedrigeren Auflösung zurückzuzoomen, verwenden Sie einfach das Mausrad. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um entweder ganze Mausgehirne oder ausgeschnittene Teile mit einer Auflösung im Mikrometerbereich zu rekonstruieren, ohne dass eine physische Schnitttechnik erforderlich ist.

Als repräsentatives Ergebnis ist hier das gesamte Kleinhirn eines L-sieben-GFP-Maus-Individuums am zehnten Tag nach der Geburt dargestellt. Alle Perkin-Gen-Neurone sind mit EGFP markiert. Nach dem Hineinzoomen wird die typische lamellenartige Struktur der Kleinhirnrinde sichtbar; weiteres Vergrößern ermöglicht die klare Unterscheidung jedes einzelnen Burkini-Zellkörpers.

Das beschriebene Protokoll kann somit zur Untersuchung der räumlichen Organisation von Neuronen in verschiedenen Studien zur Neuroentwicklung eingesetzt werden. Als zweites repräsentatives Ergebnis sehen wir hier Bilder aus dem UN-geschnittenen Gehirn eines erwachsenen Oberschenkels, eines GFPM-Maus. Bei diesem transgenen Tier wird EGFP in einer zufälligen, sparsamen Untermenge von Neuronen exprimiert.

Die rechte Gehirnhälfte ist hier dargestellt. Beim weiteren Hineinzoomen werden neuronale Prozesse erkennbar. Dieses Ergebnis zeigt, dass der beschriebene Protokollansatz die Abbildung mit mikrometergenauer Auflösung im gesamten adulten Mausgehirn ermöglicht und somit die Untersuchung der gesamten Gehirnanatomie auf zellulärer Ebene eröffnet.

In Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen kann diese Technik, einmal beherrscht, in drei bis vier Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Dehydrierungs- und Reinigungslösung richtig zu filtern, um die GFP-Fluoreszenz zu erhalten. Das hier vorgestellte Multiauflösungs-Visualisierungswerkzeug kann auch zur Untersuchung sehr großer Datensätze verwendet werden, die mit anderen Techniken wie der mikrooptischen Schnitttomographie gewonnen wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein fixiertes Maushirn datiert, bewertet und transparent macht. Bilden Sie es mit konfokaler Blattmikroskopie ab und visualisieren Sie das rekonstruierte Volumen in 3D mittels VR unter Verwendung des Tely-Plugins.