Verdau mit Restriktionsenzymen

Restriktionsenzyme oder Restriktionsendonukleasen werden in der Molekularbiologie in einer Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen eingesetzt. Diese Enzyme erkennen und spalten eine bestimmte DNA-Sequenz, die als Restriktionsstelle bezeichnet wird. Das Video, das Sie sich gleich ansehen werden, bietet einige Hintergrundinformationen zu diesen wundersamen Molekülen und zeigt, wie Sie einen Restriktionsenzymverdau einrichten.

Woher kommen Restriktionsenzyme überhaupt? Diese Enzyme sind eine Anpassung von Bakterien, die als Abwehrmechanismus gegen Viren, die als Bakteriophagen bekannt sind, fungieren. Dank der Hinzufügung von Methylgruppen an die Stellen von Restriktionsenzymen auf der bakteriellen DNA erkennen und schneiden Restriktionsenzyme nur die Phagen-DNA und verhindern so eine Infektion.

Restriktionsenzyme haben einige ziemlich seltsame Namen. Zum Beispiel HindIII, NotI, EcoRI und BamHI. Die ersten drei Buchstaben eines Restriktionsenzymnamens beziehen sich auf den Organismus, aus dem es isoliert wurde. So wurde beispielsweise das Restriktionsenzym EcoRI aus E. coli isoliert. Der vierte Buchstabe bezieht sich gegebenenfalls auf den Bakterienstamm, aus dem das Enzym isoliert wurde. Die römische Ziffer gibt an, ob es sich um das erste, zweite oder dritte Enzym handelt, das aus diesem bestimmten Organismus isoliert wurde.

Restriktionsenzyme erkennen eine Sequenz von Nukleotiden, die normalerweise vier bis acht Basenpaare lang ist und als Erkennungsstelle bezeichnet wird. An bestimmten Nukleotiden innerhalb der Sequenz bricht das Enzym die Phosphodiesterbindungen im DNA-Rückgrat auf. Die Erkennungsstellen sind in der Regel palindromisch, was bedeutet, dass die Sequenz vorwärts und rückwärts gleich liest. Wenn das Palindrom auf komplementären Strängen des DNA-Moleküls gefunden wird, wird es als umgekehrtes Palindrom bezeichnet.

Restriktionsenzyme können verschiedene Arten von Enden hinterlassen, sobald die DNA gespalten ist: klebrige Enden und stumpfe Enden. Klebrige Enden lassen 3? und 5? Überhänge, während stumpfe Enden keine Überhänge hinterlassen. Die Art des Endes bestimmt, wie das DNA-Fragment, das durch den Verdau des Restriktionsenzyms isoliert wurde, in einem Prozess, der als Ligation bekannt ist, mit anderen DNA-Fragmenten rekombiniert wird.

Ein Restriktionsenzymverdau sollte sorgfältig geplant werden. Eine Verdauungsreaktion besteht typischerweise aus folgenden Elementen: deionisiertem Wasser, der DNA, die geschnitten werden soll, einem Puffer, der für das Enzym spezifisch ist, das Sie verwenden werden, und manchmal einem Protein namens Rinderserumalbumin oder BSA. BSA stabilisiert die Reaktion, indem es verhindert, dass das Enzym an der Seite des Behälters haftet, in dem sich der Aufschluss befindet. Jedes Restriktionsenzym kann potenziell unterschiedliche Pufferbedingungen, Inkubationstemperaturen und Anforderungen an BSA haben. Lieferanten von Restriktionsenzymen werden über Ressourcen verfügen, die man überprüfen kann, um alle notwendigen Informationen zu erhalten.

Um mit der Einrichtung des Aufschlusses zu beginnen, holen Sie das Restriktionsenzym aus dem Gefrierschrank oder Kühlschrank. Bewahren Sie das Restriktionsenzym auf Eis oder einem thermisch beständigen Behälter auf, um sicherzustellen, dass die Aktivität für zukünftige Reaktionen optimal ist. Zu einem Mikrofurchenröhrchen sollten die Reaktionskomponenten in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt werden. Zuerst ein Volumen steriles, nukleasefreies Wasser, das ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 μl ergibt. Dann 10x Restriktionsenzympuffer, dann BSA, falls erforderlich, bis zu 1 μg DNA und 2-10 Einheiten Enzym. Einheiten sind definiert als die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um einen vollständigen Verdau von 1 μg Kontroll-DNA in 60 Minuten bei 37? C in einer 50? L Reaktionsvolumen. Danach durch Vortexen mischen und dann kurz bei 12.000xg in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie dann bei einer optimalen Temperatur für Ihr Restriktionsenzym, normalerweise 37? C 1 bis 4 Stunden lang in einem Heizblock erhitzen.

Sobald Ihr Aufschluss abgeschlossen ist, ist es eine gute Idee, das Reaktionsgemisch bei 65 zu inkubieren? C zur Hitzeinaktivierung der Restriktionsenzyme. Während Restriktionsenzyme die meiste Zeit ortsspezifisch schneiden, können verlängerte Inkubationszeiten zu Sternaktivität führen, die an Stellen schneidet, die ihren typischen Verdauungsstellen ähnlich, aber unterschiedlich sind.

Nach der Inaktivierung sollte die DNA auf einem Agarosegel laufen, um sicherzustellen, dass der Verdau erfolgreich war.

Hier sind ein paar hilfreiche Tipps, wie Sie Ihre Digests durchführen und den Erfolg sicherstellen können.

Manchmal befinden Sie sich in einer Situation, in der mehrere Enzyme verwendet werden müssen, um ein bestimmtes DNA-Fragment zu erzeugen. In diesem Fall müssen Sie überprüfen, ob die Pufferbedingungen und die Inkubationstemperaturen zwischen den beiden Enzymen kompatibel sind, wenn dies der Fall ist, können Sie einen doppelten Verdau durchführen und beide Enzyme in derselben Reaktion schneiden lassen. Manchmal werden Sie jedoch eine Inkompatibilität in den Reaktionsbedingungen zwischen den beiden Enzymen feststellen, und in diesem Fall besteht die Problemumgehung darin, die Enzyme nacheinander zu verwenden. Zum Beispiel kann der Aufschluss zuerst mit einem Enzym durchgeführt werden, und dann kann die Pufferzusammensetzung verändert werden, um für das zweite Enzym optimal zu sein. Eine andere Möglichkeit, die Pufferinkompatibilität zu überwinden und einen sequenziellen Verdau durchzuführen, besteht darin, die DNA nach dem ersten Verdau zu reinigen und dann den zweiten Verdau durchzuführen.

Die Verwendung von Steuerelementen ist eine gute Möglichkeit, um zu verstehen, warum ein Digest schief gehen kann. Mit einer Kontrolle ohne Enzym können Sie beispielsweise die Integrität der DNA-Probe überprüfen und feststellen, ob eine Exonuklease-Aktivität vorhanden ist. Durch die Verwendung von Kontroll-DNA mit bekannten Restriktionsstellen kann die Aktivität des Enzyms getestet werden.

Nachdem wir nun gesehen haben, wie Verdaue durchgeführt werden, werfen wir einen Blick auf verschiedene Möglichkeiten, wie Restriktionsenzyme verwendet werden können.

Restriktionsenzyme können diagnostisch eingesetzt werden, um bestimmte Proben zu identifizieren. Indem ein Digest in einen speziellen Chip geladen und dieser Chip dann in eine Maschine eingesetzt wird, die als Bioanalysator bezeichnet wird. Forscher können die Größe der DNA-Fragmente untersuchen, die vom Verdau produziert werden, um die Echtheit von Fischproben zu bestimmen. Die unterschiedlichen Bandenmuster desselben Gens einer bestimmten Spezies, oder in diesem Fall verschiedener Spezies, werden als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen bezeichnet.

Restriktionsenzyme können auch bei der Subklonierung verwendet werden, um ein DNA-Fragment aus einem Plasmid zu isolieren und in ein anderes einzufügen, so dass das gewünschte Fragment mit Hilfe von Bakterien repliziert werden kann.

Durch den Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Einführung von Restriktionsstellen in Gene an sehr spezifischen Stellen können Restriktionsenzyme verwendet werden, um das Vorhandensein von Einzelnukleotidunterschieden in alternativen Formen desselben Gens oder Allels zu bestimmen. Diese Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) sind mit PCR und Gelelektrophorese allein schwer zu erkennen. Mit der Einführung der Restriktionsstelle innerhalb des SNP kann ein einfacher Verdau zwischen den Allelen unterscheiden.

Sie haben gerade das Video von JoVE über Restriktionsenzyme gesehen. Sie haben gelernt, woher diese Enzyme kommen, einige Grundlagen über ihre Funktionsweise gelernt, gesehen, wie man einen Verdau einrichtet, und gelernt, wie Restriktionsenzyme in der Molekularbiologie eingesetzt werden können. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!