Name: Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Erfahren Sie die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Behandlung akuter Leukämie. Diese Methode nutzt Western Blot, Klonogenitätsassays und biolumineszente Bildgebung zur Wirksamkeitsprüfung.

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In-vivo-Bildgebung wurde mit dem IVIS Shared Resource an der University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30-CA046934 unterstützt). Durchflusszytometrie wurde in der Durchflusszytometrie Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30CA046934 unterstützt) durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (RO1CA137078 DKG) unterstützt. ABLS ist ein Fellow des Pediatric Scientist Entwicklungsprogramm, durch Zuschüsse von der American Academy of Pediatrics, der American Pediatric Society und der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850) unterstützt.

Alle Experimente mit Tieren folgten die von der Universität von Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt regulatorischen Standards. Die nachgewiesene Protokoll wurde von der University of Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Phospho-Protein-Western Blot <ol><li> Herstellung von Lysaten <ol><li> Kulturzelllinien, die den Rezeptor-Tyrosin-Kinase von Interesse exprimieren. Ernten der Zellen und die Platte 3-5 x 10 6 Zellen / Probe in 400 &amp;mgr; l Wachstumsmedium in einer 48-Well-Gewebekulturschale. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 für 2-3 Stunden. </li><li> 100 l 5x TKI Lösung in Wachstumsmedium und Inkubation für 60 min. </li><li> Vorbereitung Lysepuffer mit 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) Glycerin, 1% (v / v) Triton X-100 und Protease-Inhibitoren. Wenn Kulturen wird nicht mit Pervanadat vor der Ernte behandelt werden, fügen Phosphatase-Inhibitoren (1 mM Natrium orthovanadate und 0,1 mM Natriummolybdat) mit Lysepuffer. </li><li> Bereiten Pervanadat (PV)-Phosphatase-Inhibitor-Lösung unmittelbar vor Gebrauch. Vorbereitung einer 0,3% igen Lösung von Wasserstoffperoxid (VORSICHT) in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem dunklen Röhrchen auf Eis (1:100 Verdünnung einer 30% Stammlösung). Kochen Sie ein Aliquot von 0,2 M Natriumorthovanadat (OV, VORSICHT) stock-Lösung für 5 min. 1:10 verdünnt in PBS auf 20 mM OV Lösung bei Raumtemperatur (RT) zu machen. Mischungs 0,3% Wasserstoffperoxid und 20 mM OV 1:1 und Inkubieren im Dunkeln bei RT für 20 min. </li><li> Verdünnen PV in Vollmedium (60 ul PV + 940 ul Medium). 100 l verdünnt PV / gut. Bei 37 ° C in 5% CO 2 für 3 min und dann legen Platte auf Eis. </li><li> Ernte der Zellen in kaltem Mikrozentrifugenröhrchen bei 2500 rpm für 5 min. Absaugen des Überstandes und resuspendieren Zellen in 120 ul Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 15 min. Klären Sie das Lysat in einem kalten Mikrozentrifuge bei 6.000 rpm für 3 min. Übertragen supernatant zu einem frischen kalten Röhre. Bei -80 ° C </li></ol></li><li> Immunpräzipitation <ol><li> Spin down Protein G Sepharose-Kügelchen in Mikrozentrifuge bei 1.000 rpm für 1 min. Überstand entfernen und waschen Perlen 2x mit 1 ml kaltem PBS. Hinzufügen eines gleichen Volumens an PBS, um eine 50% ige Aufschlämmung zu machen. In primären Antikörper und 20 ul 50% Protein G-Kügelchen zu jeder Probe. Inkubation für 2 Stunden - O / N bei 4 ° C auf einem Rotator. </li><li> Impuls nach unten Perlen in einem kalten Mikrozentrifuge bei 9.000 Umdrehungen pro Minute. Überstand entfernen und waschen Perlen 2x mit 150 ul kaltem Lysepuffer. Spin in kalten Mikrozentrifuge bei 1.000 Upm für 1 min. Überstand entfernen und Pellet erneut in 20 ul 2X SDS Probenpuffer mit 2-Mercaptoethanol (VORSICHT). Verwenden Sie sofort oder bei -80 ° C </li><li> Kochen Sie die Proben für 5 min und laufen auf einem SDS-PAGE-Tris-Glycin-Gel. Übertragen Sie die Proteine ​​auf eine Nitrocellulose-Membran und erkennen Phospho-Protein durch Western-Blot. </li><li> Spülen Blot mit Wasser und dann inkubieren in 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,8), 0.1 M β-Mercaptoethanol (VORSICHT) für 30 min bei 50 ° C. 2x Spülen mit Wasser und dann für 60-90 min waschen in 5-6 Änderungen der TBS-T-Lösung zu entfernen Strippen. </li><li> Erkennen Gesamt-Protein durch Western-Blot. </li></ol></li></ol> 2. Methylcellulose-Assay <ol><li> Aliquot 4 ml Methylcellulose menschlichen Basismedium in 50 ml konische Röhrchen mit einem sterilen große Bohrung stumpfen Ende Nadel. (Hinweis:. Methylcellulose kann aliquotiert und bei -20 ° C gelagert werden Tauwetter bei RT O / N vor der Verwendung) </li><li> Gib 500 ul 10x-TKI oder ein Fahrzeug in einem Wachstumsmedium zu 4 ml Methylcellulose und Wirbelmischung für 10 sek. </li><li> Ernte-und Zählerzellen. Vorbereitung einer Zellsuspension in Wachstumsmedium in einer Konzentration, die 10-fach höher als die endgültige Zellkonzentration ist. In 500 ul Zellsuspension auf Methylcellulose-Mischung. Vortex für 10 Sekunden und lassen Sie sich für 10 Minuten, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Zeichnen bis 4 ml Methylcellulose Mischung mit einer 5-ml-Spritze und sterile größe Bohrung stumpfen Ende Nadel. Vermeiden Sie die Erstellung Blasen. Verzichtet werden 1 ml der Methylcellulose-Gemisch in der Mitte von drei 35 mm-Gewebekulturplatten. Schwenken Sie die Gerichte, bis der Boden vollständig mit Methylcellulose bedeckt. </li><li> Für jede Platte Methylcellulose, bereiten ein 10 cm sterile Gewebekulturplatte mit zwei zusätzlichen 35-mm-Gewebekulturplatten mit sterilem Wasser gefüllt, um eine feuchte Umgebung zu gewährleisten. Ort Kulturen mit Wassermantel bei 37 º C in 5% CO 2 für 10-14 Tage. </li><li> Graf Kolonien nach 1-2 Wochen. Kolonien mehr als 20 Zellen und nicht überlappend sein. Kolonien können mit einem inversen Mikroskop mit einem Mikroskoptisch ausgestattet mit einem Gitter oder mit Hilfe eines automatisierten Kolonie gezählt werden. Änderungen der Kolonie-Morphologie oder in Reaktion auf die Behandlung mit TKI auch ausgewertet werden. Um der Entdeckung durch Koloniezähler, Fleck Kolonien verbessern, indem 60-100 ul (3 - (4,5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-Diphenyl-2H-tetrazoliumbromid Solution (MTT, 5 mg / ml in H 2 O, Lagerung bei -20 ° C, vor Licht schützen, VORSICHT) tropfenweise über die Oberfläche jeder Platte und Inkubation für 8 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 3. Soft-Agar-Assay <ol><li> Bereiten 1% Agar für edle Bodenschicht, 0,7% Agar für edle Deckschicht und 2x Wachstumsmedium. Ins Gleichgewicht 2x Wachstumsmedium in einem 42 ° C Wasserbad. Heat 1% und 0,7% Agar edel in der Mikrowelle (ca. 1 min/100 ml) und ins Gleichgewicht in einem 42 ° C Wasserbad. Mix gleichen Teilen von 1% Agar und 2x mittel-und separat 0,7% Agar und 2x 50 ml Medium in Schrägen. Plan 10 ml Soft-Agar-Mischung / sechs-Well-Platte für jede Schicht. </li><li> Label 6-Well-Gewebekulturplatten. Füllen Sie jedes Well mit 1,5 ml 1% Soft-Agar-Mischung. Vermeiden Sie während der Beschichtung Blasen. Dry Platten mit Deckel weg in sterile Haube für 30 min. </li><li> Zählen von Zellen. Vorbereitung einer Zellsuspension in Wachstumsmedium in einer Konzentration, die 500-fache höher als die letzte Zelle ist concentratiauf. In Zellsuspension auf 0,7% Agar-Mischung, gut mischen und dosieren 1,5 ml des Agar Zellgemisch auf der Oberseite der 1%-Agar-Schicht. Lassen Sie die obere Schicht erstarren für 30 min. </li><li> Bereiten 1x Wachstumsmedium TKI-oder Fahrzeugsteuer enthält. 2 ml Medium mit der gewünschten Konzentration von TKI auf dem Top-Agar-Schicht. </li><li> Kulturen für 10 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2. Entfernen und die Überlagerung Medium ersetzen alle 3 Tage. </li><li> Wenn Kolonien mit bloßem Auge überlagert Medium absaugen und mit 200 ul Nitro-Tetrazolium-Blau-Lösung (1 mg / ml NBT in H 2 O, Lagerung bei 4 ° C, vor Licht schützen, VORSICHT). Zurück zum Inkubator für 24-48 Std. Bewegen, um 4 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Zählen. Gefärbten Platten können bei 4 º C für einen Monat gelagert werden. Graf Kolonien mit einem Mikroskop oder einem automatisierten Koloniezähler. </li></ol> 4. Auswertung der Phospho-Protein-Hemmung in vivo <ol><li> Sammeln cEllen wächst in der log-Phase durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei 1500 Upm für 5 min. Waschen der Zellen einmal mit sterilem PBS und Resuspendieren in PBS in einer geeigneten Konzentration (typischerweise 1-5 × 10 7 Zellen / ml). Transplantationszellen in einem Volumen von 100 ul in 6-12 Wochen alte NSG Mäusen durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene unter Verwendung einer 28 G-Insulinspritze. Legen Sie das Tier in einem Restrainer, heizen den Schwanz in einen Becher mit warmem Wasser, um die Venen erweitern sich, und reinigen Sie den Schwanz mit einem Chlorhexidin-Tupfer vor der Injektion. Nach der Injektion Druck auf die Injektionsstelle mit steriler Gaze, bis die Blutung aufhört. Transplant mindestens 3 Tiere / Gruppe. Pflegen Sie die Mäuse auf dem Wasser mit 1 mg / ml Gentamycinsulfat. </li><li> Vierzehn Tage nach der Transplantation zu behandeln Tiere mit TKI oder Fahrzeug nur und Ernteproben für die Analyse von Ziel-Hemmung. Wiegen Tiere und behandeln mit einer angemessenen Dosis (mg / kg Körpergewicht) oder TKI Fahrzeugs. Verabreichen Behandlung in einem Volumen von 5 ml / kg Körpergewicht durch intraperitoneale (ip) Injektion oder 10 ml / kg Körpergewicht durch orale Sondenfütterung. Für ip-Injektion, zurückhalten mit der Maus manuell und injizieren in der rechten unteren Quadranten des Bauches mit einer 29 G-Nadel. Für orale Gabe, beschränken Sie die Maus manuell und halten das Tier aufrecht. Legen Sie die Magensonde Rohr in den Mund über die Zunge und in den hinteren Teil des Mundes. Drücken Sie leicht auf den Schlauch durch die Speiseröhre in den Magen passieren. Drücken Sie den Spritzenkolben, die Behandlung zu verabreichen. Wenn der Kolben nicht leicht drücken die Sondennadel sollte entfernt und neu positioniert werden. Bereiten TKI Formulierungen unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Wenn Pervanadat Behandlung gewünscht, bereiten PV-Lösung 20 min vor der Ernte, wie oben (Schritt 1.1.4) beschrieben und in Medium verdünnt mit 1 uM MgCl 2 und 100 U / ml DNase (120 ul PV + 880 ul Medium). Hinweis: PV für mindestens 1 h nach der Verdünnung stabil. </li><li> Sacrifice Tiere durch CO 2-Narkose an der apchenden Zeit (en) nach der Behandlung. Dissect Oberschenkelknochen durch Entfernen Fell, Haut und Muskeln aus dem gesamten Bein, so dass die Knochen vollständig ausgesetzt. Entfernen der Oberschenkelknochen von Clipping mit Dissektionsscheren knapp unter dem Hüftgelenk wieder oberhalb des Kniegelenks. Überweisung in eine Petrischale und bündig Knochenmark mit 1 ml kaltem PBS verdünnt oder PV-Lösung mit einer Spritze und einer 27 G-Nadel. Wenn die Behandlung mit PV, Inkubation bei RT im Dunkeln für 10 min. </li><li> Bereiten Lysaten und zu analysieren, Phospho-Protein-und Protein-Ebene-Gesamt wie oben (1.1.6-1.2.5 Schritte) angezeigt. </li><li> Quantifizieren relativ Phospho-Protein-und Protein-Ebene-Gesamt für jede Probe mit Densitometrie. Phospho-protein/total-protein relativ zu berechnen, um den durchschnittlichen Wert für phospho-protein/total-protein Vehikel-behandelten Tieren. </li></ol> 5. Evaluation der Anti-Leukämie-Aktivität von TKI in ALLEN Xenograft Modelle <ol><li> Falls notwendig, setzen Mäuse auf 200 cGy von Strahlung in einem RS-2000-Strahler Prio 1 Tagr zu verpflanzen. Transplant-Mäusen mit Leukämie-Zelllinien, wie oben (Schritt 4.1) beschrieben. Transplant mindestens 6 Mäuse pro Gruppe. Identifizieren von Ohrstanzmäuse. Alternativ kann eine schwarze Markierung verwendet, um Mäuse mit Hash-Zeichen auf ihren Schwänzen zu identifizieren. In Bereicherung in Käfige, um das Potenzial für Käfigkollegen Aggression während der Studie zu reduzieren. </li><li> Gönnen Mäuse mit einem TKI oder Fahrzeug nur wie oben (Schritt 4.2) beschrieben. Überwachung des Gesundheitsstatus der Mäuse täglich über körperliche Untersuchung und Gewichtsbestimmung. Erwartete Symptome der Leukämie (reduzierte Aktivität, Gewichtsverlust, Lähmung der hinteren Gliedmaßen und Augeninfektionen). Gewichtsverlust von mehr als 10% -15% wird in der Regel mit dem Tod der Maus innerhalb von zwei Tagen verbunden und ist typischerweise ein Surrogatendpunkt für Tod in Übereinstimmung mit der Norm IACUC Anforderungen. </li><li> Überwachung der Transplantation und die Entwicklung von Leukämie über eine in-vivo-Biolumineszenz-Imaging-System bis zu 2x wöchentlich. Bereiten Sie eine 200x-D-Luciferin-Stammlösung (30 mg / ml) in Sterile Wasser. Vorsichtig mischen durch Umdrehen, bis D-Luciferin vollständig gelöst ist. Verwenden Sie unverzüglich, aliquotieren und bei -20 ° C. Vor der Bilderzeugung unter Verwendung eines in vivo-Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem, auftauen Aliquots von D-Luciferin bei RT und verdünnt 1:2 PBS auf eine Endkonzentration von durch einen 0,2 &amp;mgr; m-Filter 15 mg / ml und Filter-Sterilisieren. </li><li> Anesthetize die Mäuse vor der Bildgebung mit 1,5% Isofluran in Sauerstoff eingeatmet. Überwachen ausreichende Anästhesie, dadurch gekennzeichnet, Muskelentspannung, Bewegungsverlust und Verlust der Reaktion auf Zehenklemm Stimulation. </li><li> Unmittelbar vor der Bildgebung zu verabreichen 150 mg / kg Körpergewicht D-Luciferin durch ip-Injektion (10 ul 15 mg / ml Luciferin / g Körpergewicht). </li><li> Verwenden Sie eine in-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung System zu 2 Serie von Bildern mit sequentieller 30, 60 und 90 Sekunden Belichtungen und einer abschließenden Bild mit einem 120 Sekunden Belichtung fotografieren. Nach der Bebilderung zurück Mäuse in Käfige und Monitor für Erholung von der Narkose. Je nach derIntensität der Biolumineszenz können Belichtungszeiten variiert werden. Optimale Belichtungszeit sollte für ein bestimmtes Modell vorbestimmt und konsistent gehalten, so dass die Signalintensitäten für einzelne Zeitpunkte sind in der gesamten Studie vergleichbar. </li><li> Bestimmen Sie Biolumineszenz Intensität für jede Maus mit Wohnzimmer Bild 3.2 Erfassung und Analyse-Software. Bestimmen Sie, in Photonen / gemessene Gesamtflusswerte zweiten, indem Regionen von Interesse (ROI) gleicher Größe über jede Maus. </li><li> Opfern Mäuse durch CO 2-Exposition und zervikale Dislokation wenn moribund, aufweist Lähmung, bei mehr als 15% Gewichtsverlust, oder am Ende der Studie. Dissect Mäusen und Rekord Beobachtungen (z. B. Erweiterung der Milz, Leber oder Lymphknoten, blasse Knochenmark). Dissect Oberschenkelknochen und bündig Knochenmark mit kaltem PBS mit einer 27 G-Nadel. </li><li> Sammeln Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 2.500 Upm für 5 min. Die Zellen in PBS, enthaltend 2% FBS und Inkubation für 5 min bei RT.Zellen sammeln und Fleck mit 20 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid, 1:1000) und FITC-konjugiertem α-hCD45 (1:100) oder Maus-IgG 1-Isotyp-Kontroll-Antikörper (1:100) . Bewerten Leukämie Transplantation mit Durchflusszytometrie. Tor auf der lebensfähige Population (DAPI negativ) und bestimmen Prozentsatz der CD45 +-Zellen (% Blasten im Knochenmark). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Diese Handschrift beschreibt eine wirksame Strategie zur Evaluierung neuer Tyrosinkinase-Inhibitoren bei der Behandlung von akuter Leukämie. Mit diesem Ansatz, biochemischen und Anti-Leukämie-Aktivitäten werden zunächst in zellbasierten Assays in vitro Xenotransplantat-Modelle in vivo ausgewertet und dann. Immunoblot-Analyse wurde erfolgreich verwendet, um die Hemmung der Ziel Tyrosinkinase in Leukämiezellen nach der Behandlung mit TKI demonstrieren und direkt vergleichen die Wirksamkeit von mehreren V...

Akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern 1,2. Die Gesamtüberlebensrate für Kinder-B-Zelllinien-ALL (B-ALL) ist etwa 85%, aber spezifische biologische Subtypen, darunter T-Zelllinien-ALL (T-ALL), haben immer noch schlechtere Prognose auch mit den aktuellen Therapieprotokolle. Die weitere Behandlung des rezidivierten ALL bleibt eine Herausforderung 3. Obwohl die Mehrheit der erwachsenen Patienten mit akuter Leukämie eine Remission zu erreichen mit Up-Front-Chemotherapie leiden viele Patienten immer noch 4 Rückfall. Strom Chemotherapien bei der Behandlung von akuter Leukämie bekannt, um Toxizität assoziierten kurz-und langfristige Nebenwirkungen verursachen. Daher werden weniger toxische Therapien, die spezifisch auf Krebszellen mit minimaler Wirkung auf normales Gewebe stark benötigt. In den letzten Jahren wurde der Schwerpunkt auf der Entwicklung von neuen, molekular gezielte Wirkstoffe mit Spezifität für Krebszellen oft unter Verwendung von iterativen Chemie platziertmehrere Wirkstoffe, die dann verglichen und priorisiert werden müssen 5 zu erzeugen. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung der TKI für die Behandlung von akuter Leukämie, die für die Bewertung einer einzigen Verbindung oder zur direkten Vergleich mehrerer Verbindungen, um die Medikamentenentwicklung zu erleichtern verwendet werden kann. Die hier vorgestellten Verfahren besteht aus vier Schritten. Die erste biochemische (1) und Anti-Leukämie-(2)-Aktivitäten der Verbindung (en) sind in der Zellkultur untersucht, dann die Hemmung des Targets in Tiermodellen (3) bestätigt, und schließlich therapeutische Wirksamkeit des TKI (en) (4) in orthotopen Leukämie Xenotransplantatmodellen bestimmt. Für diese Untersuchungen ist es wichtig, relevante Zelllinien, die Vertreter der häufigsten biologischen Subtypen wählen. Zelllinien gewählt werden, die beide, ausdrücklich das Ziel, Interesse und fehlt das Ziel von Interesse, zu untersuchen, ob biologische Wirkungen med. sinddurch Hemmung der Ziel iated. Dies ist für die Entwicklung von kleinen Molekül-Inhibitoren, die Nebeneffekte, die für Anti-Tumor-Aktivität können besonders relevant. Es ist auch notwendig, um eine Zelllinie, die von der Ziel-zur funktionellen Wirkungen wie Proliferation oder Überleben zu wählen. Vorläufige Zielvalidierungsstudien (außerhalb des Umfangs dieses Artikels) mittels RNA-Interferenz-oder anderen spezifischen Mittel, um das Ziel zu hemmen, kann verwendet werden, um zielabhängigen Zelllinien zu identifizieren. Es ist auch wünschenswert, um Zelllinien, Maus-Xenotransplantaten, so daß Zellkulturergebnisse können mehr direkt übersetzt in in vivo Experimenten bilden können wählen. Zur Bewertung der biochemischen Aktivität von TKIs in Leukämie-Zellen vermittelt wird, kann eine Abnahme der Rezeptor-Phosphorylierung als Indikator der Hemmung Ziel verwendet werden. Western-Blot-Analyse oder ELISA-Assays können verwendet werden, abhängig von der Verfügbarkeit und Spezifität von Antikörpern.Wenn Antikörper mit ausreichender Spezifität für das Ziel verfügbar sind, sind ELISA-Assays bevorzugt, da sie mehr quantitative und effizient sind. In Fällen, in denen Antikörper mit ausreichender Spezifität für ELISA nicht verfügbar sind, können Western-Blot-Analyse erforderlich sein. In diesem Fall kann die Immunpräzipitation von einer großen Menge an Lysat nützlich für die Detektion von Zielen, die in geringer Menge sind sein. Dieser Ansatz ist für die Messung von Phospho-Proteine, die eine kurze Halbwertszeit haben können, für schnelle Änderungen in der Signal in Reaktion auf Umweltreize ermöglichen besonders relevant. Einige phosphorylierte Proteine ​​sind extrem labil, wahrscheinlich als Ergebnis der Komplexbildung mit Phosphatasen. Für robuste und konsistente Detektion dieser phosphorylierten Proteine ​​kann es auch möglich sein, Zellen mit Pervanadat eine irreversible Protein-Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor 6 behandelt, um das Phospho-Protein vor der Herstellung ganzer Zellysate stabilisieren. Zubestimmen, ob biochemische Aktivität ergibt Antitumorwirkungen können zielabhängigen biologischen Prozesse in Zell-basierten Experimenten beobachtet werden. Für Leukämie-Zelllinien, kann Anti-Leukämie-Aktivität durch TKI vermittelt mit Koloniebildungstests in Methylcellulose oder Soft-Agar-7 durchgeführt beurteilt werden. Weichagar kann bevorzugt sein, da dies ein festes Medium, das eher für die Manipulation wenn wiederholte Behandlung mit TKI erforderlich ist. Während viele akute myloid Leukämie (AML) Zelllinien Kolonien in Soft-Agar zu bilden, werden die meisten ALLE Zelllinien nur bilden Kolonien in Methylcellulose, die ein halbfestes Medium ist. Obwohl es möglich ist, mittel-und / oder Methylcellulose in TKIs Kulturen zu aktualisieren, kann nur kleine Mengen verwendet und mit begrenzten Frequenz werden. Ebenso ist es schwieriger, in Methylcellulose-Kolonien ohne Unterbrechung färben. Vorläufige Studien sollte die Fähigkeit von geeigneten Zelllinien, Kolonien in Methylcellulose und / oder Soft-Agar-und T-Form zu definierener optimale Dichte von Zellen in Kultur, so dass Kolonien sich nicht überlappen und in ausreichender Anzahl, um statistisch (üblicherweise 50-200 Kolonien pro 35 mm-Platte) erhalten relevanten Daten. Während in-vitro-Assays sind robust und kostengünstig, und haben weniger ethischen Implikationen als ganze Tierversuche, Weiterentwicklung der therapeutischen Verbindungen erfordert Nachweis der Wirksamkeit und Sicherheit in Tiermodellen. Für die in vivo-Studien können menschliche akuten Leukämie-Zelllinien in orthotop NOD.Cg-Prkdc SCID transplantiert werden ich l2rg tm1Wjl / SZJ (NSG) Mäuse und TKI kann leicht durch Injektion oder orale Gabe verabreicht werden. Einige Zelllinien kann die Exposition von Mäusen NSG auf eine niedrige Zelllinie abhängige Dosis der Strahlung, um festzustellen, für Heterotransplantate erfordern, und in diesem Fall Mäuse können nicht tolerieren, ohne orale Gabe 5-10 Tage Erholungszeit nach der Bestrahlung. Dieses Manuskript beschreibt Generation der B-ALL und T-ALL-Heterotransplantate mitspezifische Zelllinien (697 und Jurkat) als Beispiele aber Xenotransplantaten in Mäusen NSG Verwendung einer großen Vielzahl von Zelllinien etabliert werden. In dem Fall, dass andere Zelllinien sind falls die Anforderung für die Bestrahlung, die optimale Anzahl von Zellen zu verpflanzen, und den Zeitpunkt der Entstehung und Progression Krankheit sollte experimentell bestimmt werden. Im Idealfall werden diese Modelle vollständiger Penetranz (jedes Tier transplantiert entwickelt Leukämie), konsistente Kinetik (Leukämie schreitet ähnlich bei allen Tieren) und eine angemessene Behandlungsfenster (idealerweise 20 bis 30 Tage zwischen Beginn der Behandlung und Entfernung aus der Studie aufgrund von Krankheit) haben . Die Anzahl der Zellen transplantiert erhöht werden, um kinetische Penetranz und Konsistenz zu verbessern oder verringert, um das Behandlungsfenster bei Bedarf zu verbessern. Zu bestimmen, ob TKI vermitteln Ziel-Hemmung in vivo werden die Proben von Mäusen mit Leukämie Xenotransplantaten nach der Behandlung mit TKI oder nur Fahrzeug gesammelt. Idealerweise sollte die Dosis eind Zeitplan der Verwaltung für diese Experimente werden von pharmakokinetischen Studien, die oft von kommerziellen Labors durchgeführt und sind nicht in den Anwendungsbereich dieses Artikels geführt werden kann. Wenn pharmakokinetischen Daten verfügbar sind, kann die Konzentration der Verbindung für eine effektive Ziel Hemmung in der Zellkultur und die maximale Konzentration im Serum nach einer Einzeldosis von TKI erforderlich verwendet, um eine Anfangsdosis für Tierversuche zu definieren. Pharmakokinetischen Studien können auch den Zeitpunkt der Probenentnahme nach der Behandlung informieren pharmakokinetische Studien und die Art der Verabreichung. Inhibition des Ziels in jeder betroffenen Organs bewertet werden, aber die meisten Gewebe, die leicht erhoben und verarbeitet werden, sind bevorzugt. Die meisten akuten Leukämie-Zelllinien zu etablieren in der Leber, Knochenmark, der Milz, dem peripheren Blut und dem Zentralnervensystem, obwohl die spezifischen Organe betroffen und das Ausmaß der Transplantation dieser Organe variiert zwischen den Modellen. Die hier vorgestellte Protokoll beurteilt phospho-Protein-Hemmung im Knochenmark mittels Western Blot-Analyse, aber soliden Organen kann einfacher sein, konsequent ernten und benötigen nur minimale oder keine Verarbeitung vor dem Einfrieren, so dass weniger Gelegenheit für den Abbau von Phosphor-Proteine ​​während der Probensammlung und-verarbeitung. Immunhistochemie kann auch verwendet werden, um solide Tumoren oder Organe von Leukämie betroffen bewerten. Schließlich wird die therapeutische Wirksamkeit des TKI (s) in orthotopen Leukämie-Xenograft-Modellen bestimmt. Aus diesen Untersuchungen kann der Zeitpunkt der Einleitung der Behandlung variiert werden, so dass Krankheit mehr oder weniger festgelegt. Die Behandlung kann unmittelbar nach der Transplantation für die ersten Studien beginnen und dann in nachfolgenden Studien verzögert, bis erhebliche Krankheitslast erkannt wird, um eine Diagnosebehandlungsmodell genauer anzunähern. Idealerweise haben diese Tiermodellen auch die Fähigkeit zur nicht-invasiven Messung der Krankheitsbelastung. Wir haben Verfahren für die Einführung der Firefly Lucifer optimiertase-Gen in Leukämie-Zelllinien mit Virus-ähnlichen Partikeln, so dass für nicht-invasive, Längsschnittanalyse der Krankheitsbeginn und Verlauf und Beurteilung der Krankheitslast im Knochenmark und soliden Organen. Entscheidend für diesen Ansatz ist die Verwendung von Luciferase-markierte monoklonale Zelllinien, um die Variabilität in der Entwicklung von Luciferase-exprimierenden Leukämie mit der Verwendung von polyklonalen Zellinien assoziiert zu verhindern, und ist nicht abhängig von der Behandlung mit einem TKI 8. Zusammengenommen können diese Schritte für die Bewertung eines einzelnen TKI oder zum direkten Vergleich und Einstufung der mehreren TKIs verwendet werden. Während die Protokolle hier vorgestellt werden, zielen auf die Entwicklung von TKI, können diese Methoden, um andere Ziele angepasst werden und Überlegungen für die Assay-Entwicklung beschrieben. Somit kann diese Strategie im weiteren Sinne der präklinischen Bewertung von molekular gezielte Wirkstoffe anwendbar zur Behandlung von akuter Leukämie.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Reagenz/Material</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>MP Biomedicals</td><td>#02194057</td><td>GHS05, GHS07, H302-H318</td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat</td><td>Sigma</td><td>#S6508</td><td>GHS07, H302+ H312+H332&nbsp;</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>#M7522</td><td>GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>ColonyGel Human Base Medium&nbsp;</td><td>ReichweiteBio</td><td>#1101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT)</td><td>Sigma</td><td>#M5655</td><td>GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Difco Noble Agar&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>#214883</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nitrotetrazoliumblauchlorid</td><td>Sigma</td><td>#N6639</td><td>GHS07, H302&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Luciferin Glühwürmchen, Kaliumsalz</td><td>PerkinElmer</td><td>#122796</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6- Diamidino-2-phenylindoldihydochlorid</td><td>Sigma</td><td>#D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC CD45&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>#347463</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC Maus IgG1 Isotyp-Steuerung</td><td>BD Bioscience</td><td>#51-35404X-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gentamycinsulfat</td><td>Sparhawk</td><td>#NDC58005-633-04</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Protease-Hemmer&nbsp;</td><td>Roche</td><td>#11836153001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>#D4263</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Protein G Kügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>#10-1242</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran-VETON</td><td></td><td>#NDC13985-030-60</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Zellkulturschalen, Ø 35 mm & mal; H 10 mm</td><td>Nunklon</td><td>#D7804-500EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zellkulturschalen, Ø 100 mm x&nbsp; H 20 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Nunklon</td><td>#D8429-1CS</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>BD Bioscience</td><td>#353046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>14 Gauge x 4 Zoll Nadeln mit stumpfem Ende</td><td>Cadence science</td><td>#7956</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>5 ml Spritze mit Luer-Lok</td><td>BD Bioscience</td><td>#309646</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GelCount automatisierter Koloniezähler</td><td>Oxford Optronix</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebungssystem</td><td>PerkinElmer</td><td>#IVIS200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Scout pro tragbare Waagen, Waage</td><td>Ohaus</td><td>#SP202</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nagetier-Zurückhaltung im Broome-Stil</td><td>Plas-labs</td><td>#551-BSRR</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ohrlocher, Lochdurchmesser: 2 mm</td><td>FST</td><td>#24210-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorhexidin-Tupfer, Prevantics</td><td>PDI</td><td>#B10800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Insulinspritze 1 mL (40 Einheiten) 29 G x 1/2</td><td>Monojekt</td><td>#8881500042</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fütterungsnadeln aus Kunststoff für Nagetiere (Einweg) 20 ga x 38 mm, steril</td><td>Instech</td><td>#FTP-20-38</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL Luer-Lok Einmalspritze</td><td>BD Bioscience</td><td>#309628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lo-Dose U-100 Insulinspritze mit 28 G x &frac12;, fest angebrachte Nadel</td><td>BD Bioscience</td><td>#329465</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Extra feine Bonn Schere</td><td>FST</td><td>#14084-08</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Schüler-Feinschere</td><td>FST</td><td>#91460-11</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Moria ultrafeine Pinzette</td><td>FST</td><td>#11370-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Extra feine Graefe Pinzette</td><td>FST</td><td>#11150-10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>FST</td><td>#10003-12</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>FST</td><td>#10011-00</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

präklinische evaluierung von tyrosinkinase-inhibitoren für die behandlung von akuter leukämie

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Rezeptortyrosinkinasen sind bei der Entwicklung und Progression von vielen Krebsarten, einschließlich Leukämie und soliden Tumoren in Verbindung gebracht und sind attraktiv druggable therapeutische Ziele. Hier beschreiben wir eine effiziente Vier-Schritte-Strategie für die präklinische Bewertung von Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) in der Behandlung der akuten Leukämie. Zunächst wird Western-Blot-Analyse verwendet, um die Ziel Inhibition in kultivierten Leukämiezellen zu bestätigen. Die funktionelle Aktivität wird dann unter Verwendung klonogene Assays in Methylcellulose oder Soft-Agar-Kulturen untersucht. Experimentelle Verbindungen, die Aktivität in Zellkulturassays zeigen, werden in vivo mit NOD-SCID-gamma (NSG) orthotop Mäusen mit menschlichen Leukämie-Zelllinien transplantiert ausgewertet. Erste In-vivo-Studien bewerten pharmakodynamische Zielhemmung in leukämischen Blasten aus dem Knochenmark isoliert. Dieser Ansatz wird verwendet, um die Dosis und Verabreichungsschema für eine effektive Zielsperre notwendig festzustellen,ion. Nachfolgende Studien bewerten die Wirksamkeit der TKI in vivo unter Verwendung von Luciferase exprimierenden Leukämiezellen, wodurch eine nicht-invasive Überwachung des Biolumineszenz Leukämie Belastung und Beurteilung der therapeutischen Reaktion unter Verwendung eines in vivo-Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem. Diese Strategie wurde in vitro und in vivo wirksam war zur Bewertung der TKI und kann zur Identifizierung von molekular gezielte Wirkstoffe mit therapeutischem Potential oder zum direkten Vergleich und Priorisierung von mehreren Verbindungen eingesetzt werden.

Die hier vorgestellten Untersuchungen bewertet die biochemischen und funktionellen Wirkungen von TKI vermittelt und kann verwendet werden, um neue Verbindungen, basierend auf dem Grad der Ziel Inhibierung in vitro und in vivo werden einstuft, Reduktion der Koloniebildung und Verzögerung Leukämogenese NSG in Mäusen mit Luciferase-transplantierten getaggt Leukämiezellen. Immunoblot-Analyse wurde verwendet, um die Hemmung der aktiven phosphorylierten Form des Zielproteins in L...

Rezeptortyrosinkinasen sind bei vielen Krebs ektopisch exprimiert und sind als therapeutische Ziele bei akuter Leukämie identifiziert. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung der akuten Leukämie.

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die effiziente präklinische Bewertung von Tyrosinkinaseinhibitoren zur Behandlung der akuten Leukämie. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Western-Blutanalyse durchgeführt wird, um die Zielinhibition in kultivierten Leukämiezellen zu bestätigen. Der zweite Schritt besteht darin, die funktionelle Aktivität mittels eines klonogenen Assays in Methylcellulose oder weichem Agar zu bewerten.Als Nächstes dienen pharmakodynamische Studien der Beurteilung der Zielinhibition in leukämischen Blasten im Knochenmark von Mäusen, die mit einer humanen Leukämie transplantiert wurden. Die gewonnenen Daten werden verwendet, um Dosis und Applikationszeitplan zu bestimmen, die für eine wirksame Zielinhibition in vivo erforderlich sind. Letztendlich wird mit dieser Strategie die therapeutische Wirksamkeit der TKIs in vivo mittels biolumineszenzbasierter Bildgebung evaluiert.Diese Strategie zielt darauf ab, den besten Kandidaten für einen Tyrosinkinase-Inhibitor für die Weiterentwicklung in die klinische Anwendung zu identifizieren. Die in diesem Video beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um Tyrosinkinase-Inhibitoren effektiv in vitro und in v

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Entstehung der genetischen Resistenz gegen Kinase-Hemmer-Therapie stellt große Herausforderung für eine effektive Krebstherapie. Identifizierung und Charakterisierung von Mutationen resistent gegen ein neu entwickeltes Medikament hilft bei der besseren klinischen Behandlung und der nächsten Generation Drug-Design. Hier beschreiben wir unser Protokoll für in-vitro-Screening und Validierung von resistenten Mutationen.

Verfahren zum Screening und Validierung von Beständig Mutationen Vor-Inhibitoren

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Antikörper-Arrays zu Veränderungen im Signalwege in verschiedenen zellulären Modellen zu identifizieren. Diese Veränderungen, verursacht durch Medikamente/Hypoxie/ultra-violet Licht/Strahlung oder durch Überexpression/Herabregulation/Knockouts, sind wichtig für die verschiedenen Krankheitsmodelle und können angeben, ob eine Therapie wirksam werden oder Mechanismen der Drogen identifizieren kann Widerstand.

Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays

Hier beschreiben wir Protokolle für die genetischen und chemischen Validierung von c-Fos und Dusp1 als Medikament Ziel bei Leukämie mit in vitro und in vivo genetische und humanisierte Mausmodelle. Diese Methode kann auf jedes beliebige Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, in dem ein von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie abgeleitetes Xenograft-Modell als Strategie zur Bewertung und Überwachung von CD19-gerichteten chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizitäten verwendet wird.

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Hier wird eine auf Phosphoflow-Zytometrie basierende Methode zur Analyse der Signalwege stromabwärts der mTORC1-, JAK/STAT5- und MAPK-Signalwege in akuten humanen myeloischen Leukämiezellen beschrieben, die in Mäuse xenotransplantiert und aus Knochenmarkaspiraten gewonnen wurden. Die Werte von p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 und p-ERK1/2 werden gleichzeitig mit einem spektralen Durchflusszytometer der nächsten Generation mit hoher Empfindlichkeit gemessen.

Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

Dieses Protokoll beschreibt eine effektive Methode zur Quantifizierung des Unterschieds in der DNA-Schädigung, die durch Typ-I- und Typ-II-Inhibitoren in FLT3-mutierten Zellen durch Anwendung des Comet-Assays induziert wird.

Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren

Das Protokoll zielt darauf ab, ein Mausmodell zur Erzeugung von Schüben akuter lymphatischer Leukämie zu beschreiben, basierend auf der Dynamik des Ansprechens auf eine Induktionschemotherapie.

Mausmodell des Leukämie-Rezidivs zur Induktionschemotherapie bei akuter lymphatischer Leukämie

Das Ziel dieser Technik ist es, Serotonin (5-HT) Neurotransmitter-Funktion im Live-und frei atmenden Tier mit pharmakologische Kernspintomographie (phMRI) und einer intravenösen Herausforderung mit einem selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI), Fluoxetin zu beurteilen.

Die Verwendung von pharmakologischen fMRT-Herausforderung in der präklinischen Forschung: Anwendung auf die 5-HT-System

Gründung einer orthotopen Tumormodell Blase zu Antitumor-Wirkung von intravesikal geliefert Sarna und Überwachung des Tumorwachstums durch Ultraschall und Biolumineszenz-Bildgebung zu beurteilen.

Einem orthotopen Blasentumor Modell und der Auswertung der intravesikalen Behandlung SÄRNA

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Erfahren Sie die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Behandlung akuter Leukämie. Diese Methode nutzt Western Blot, Klonogenitätsassays und biolumineszente Bildgebung zur Wirksamkeitsprüfung.

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

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