Name: Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Lernen Sie ein fluoreszenzbasiertes Exonuklease-Assay zur Analyse der WRN-Exonukleaseaktivität mit fluoreszierenden DNA-Substraten. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare, kostengünstige und sichere Untersuchungen zur Genomstabilität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken dem ratsübergreifenden New Dynamics of Ageing Programme für die Finanzierung dieser Arbeit [ES/G037086/1] und Prof. Dave Sherratt (Department of Biochemistry, University of Oxford) für den Zugang zum Fuji FLA-3000.

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
<li>Payne, M., Hickson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+instability+and+cancer%3A+lessons+from+analysis+of+Bloom%27s+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome).</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).</li>
<li>Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+Werner%27s+syndrome+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the Werner's syndrome gene.</a> Science. 272, 258-262 (1996).</li>
<li>Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+premature+ageing+syndrome+protein%2C+WRN%2C+is+a+3%27--%3E5%27+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease.</a> Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).</li>
<li>Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome-causing+mutations+in+Werner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Trends%22%5BJournal%5D)">Syndrome-causing mutations in Werner syndrome.</a> Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).</li>
<li>Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+exonuclease+structure+and+molecular+mechanism+imply+an+editing+role+in+DNA+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).</li>
<li>Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+action+of+the+helicase+and+3%27+to+5%27+exonuclease+of+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).</li>
<li>Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+an+exonuclease+from+Arabidopsis+thaliana+reveals+similarities+to+the+DNA+exonuclease+of+the+human+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).</li>
<li>Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterisation+of+RecQ+homologues+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).</li>
<li>Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Drosophila+ortholog+of+WRN+exonuclease+that+is+required+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity.</a> Aging Cell. 7, 418-425 (2008).</li>
<li>Cox, L. S., Boubriak, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Instability+in+Premature+Aging%2C+in+DNA+Damage+Repair%2C+Repair+Mechanisms+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Thomas%2C+A.E.%2C+Eds.+Nova+Science+Publishers%22%5BJournal%5D)">DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging.</a> Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).</li>
<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Bestimmung der Exonuklease-Aktivität von gereinigten Proteinen erfordert die Analyse von DNA-Spaltprodukten. Die sequentielle Spaltung der DNA durch Exonukleasen kann durch Trennung von markierten Spaltprodukten auf Acrylamidgelen sichtbar gemacht werden. In der Vergangenheit beinhaltete dies die Endmarkierung des DNA-Substrats mit einer Radiomarkierung (z. B. 32P oder 35S), jedoch mit den Nachteilen, die mit der Verwendung von Radiomarkierung verbunden sind (Kosten, Sicherheitsprobleme...

Nukleasen spielen in Zellen eine wichtige Rolle bei der Entfernung beschädigter DNA, der Auflösung von Nicht-Duplex-Strukturen wie Holliday-Verbindungen und der Bereitstellung von Korrekturlesekapazitäten während der DNA-Replikation, sowohl intrinsisch in DNA-Polymerasen als auch extrinsisch zu ihnen1. Nukleasen können entweder durch sequentiellen Abbau von DNA von freien Enden (Exonukleasen) oder durch Spaltung interner Phosphodiesterbindungen innerhalb eines längeren DNA-Moleküls (Endonukleasen) wirken. Der Verlust der Nukleaseaktivität kann zu hochspezifischen Phänotypen der Genominstabilität führen. Während die Mutation des RecQ-Helikase-Familienmitglieds BLM zu übermäßig hohen Raten des Schwesterchromatidenaustauschs und weltweit erhöhten Krebsraten führt (überprüft von Payne und Hickson2), führt die Mutation des hochverwandten WRN-Proteins zu vorzeitiger Alterung3; Der wichtigste signifikante Unterschied zwischen diesen beiden Familienmitgliedern ist das Vorhandensein einer 3'-5'-Exonuklease-Domäne in WRN4. Hinweise auf eine entscheidende Rolle der WRN-Exonuklease bei der Aufrechterhaltung der Genomstabilität haben sich aus der Analyse von Genotypen bei WS-Patienten5 zusammen mit Punktmutations- und Deletionsstudien in menschlichen Zellen angesammelt, die durch kristallographische Studien der isolierten Exonuklease-Domäne6 gestützt wurden. Die Zusammenarbeit und Wechselwirkung zwischen der Exonuklease-Aktivität von WRN und ihrer zentralen Helikase-Aktivität7 macht es jedoch schwierig, die Funktionalität beider Elemente und ihre relativen Beiträge zur Genomstabilität auseinanderzuhalten. In Pflanzen und Tieren mit niederen Metazoen ist die WRN-Exonuklease-Aktivität auf einem einzelnen Polypeptid ohneHelikase-Aktivität vorhanden 8-10 (überprüft in Cox und Boubriak11); In Arabidopsis wurde biochemisch gezeigt, dass diese Exonuklease koordiniert mit der verwandten WRN-Helikase agiert und die kombinierten Enzymaktivitäten, die bei Wirbeltieren WRN9 beobachtet wurden, effektiv rekonstituiert. Wir haben die WRN-Exonuklease in Drosophila untersucht, da die hervorragenden genetischen Werkzeuge die Analyse der Auswirkungen der Exonuklease-Mutation (ohne Auswirkungen auf die mutmaßlich verwandte Helikase) auf der Ebene des gesamten Organismus und während der Entwicklung ermöglichen10,12. Darüber hinaus haben wir rekombinante Drosophila WRN-Exonuklease (DmWRNexo) kloniert, exprimiert und gereinigt, was eine vollständige biochemische Analyse ihrer Enzymeigenschaften ermöglicht13,14.
Die Nukleaseanalyse in vitro wird traditionell mit radioaktiv markierten Oligonukleotiden durchgeführt, wobei der Abbau durch Suche nach einer Leiterbildung von Produkten auf Acrylamidgelen bewertetwird 4,8,15. Solche Assays sind zwar empfindlich, aber aufgrund des radioaktiven Zerfalls der markierten Substrate im Alltag nicht quantitativ reproduzierbar. Darüber hinaus stellen der Umgang und die Entsorgung radioaktiver Reagenzien erhebliche Umwelt- und Gesundheitsprobleme dar. Auch die Beschaffung von radioaktiven Markierungen wird zunehmend problematisch. Eine neuere alternative Methode bestimmt die Menge des endgültigen Abbauprodukts mittels Massenspektrometrie16. Es ist jedoch zeitaufwändig (dauert mehrere Tage), erfordert spezielle Geräte, und die Ablesung ist die Menge des Endprodukts (Einzelnukleotid) und eignet sich daher nicht für die empfindliche Messung von Aspekten wie der Enzymprozessivität oder zur Bestimmung, ob einige Nukleotide, Sequenzen oder Modifikationen zu einer Pause oder einem Stillstand der Nuklease führen. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir die traditionellen gelbasierten Assays für die Verwendung mit fluoreszierenden Oligonukleotidsubstraten angepasst, um stabil markierte Substrate zu erzeugen, die über lange Zeiträume reproduzierbar verwendet werden können und so einen direkten Vergleich der Nukleaseaktivitäten unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz/Material</td></tr><tr><td>Kundenspezifische Oligonukleotide</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Es ist notwendig, diese in hoher Reinheit z. B. mit PAGE-Aufreinigung zu erhalten.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluorescein-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40</td></tr><tr><td>% 19:1 Acrylamidlösung</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>ACHTUNG: starkes Neurotoxin, daher sollten immer</td></tr> <tr><td>Handschuhe getragen werdenHis-Trap-Säulen (1 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Alle anderen Reagenzien</td><td>eines namhaften Lieferanten</td><td></td><td>Molekularbiologische Qualität ist erforderlich (DNase-frei); Mikrofuge-Röhrchen sollten ebenfalls DNase- und RNase-frei</td></tr><tr> sein<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Hoefer SE400 Gelapparat</td><td>Hoefer</td><td>SE400-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>FLA-3000 (Phosphor und Fluoreszenz) imager)</td><td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Reader V2.02</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Gauge V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein fluoreszenz-basierte exonuklease assay zu dmwrnexo, ortholog der menschen progeroid wrn exonuclease, und ihre anwendung auf andere nukleasen charakterisieren

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN-Exonuklease ist an der Auflösung von DNA-Schäden beteiligt, die entweder während der DNA-Replikation oder nach Exposition gegenüber endogenen oder exogenen Genotoxinen auftreten. Es ist wahrscheinlich, dass es eine Rolle bei der Verhinderung der Akkumulation von rekombinogenen Zwischenprodukten spielt, die sich sonst an vorübergehend blockierten Replikationsgabeln ansammeln würden, was mit einem hyperrekombinanten Phänotyp von Zellen ohne WRN übereinstimmt. Beim Menschen umfasst die Exonuklease-Domäne einen N-terminalen Teil eines viel größeren Proteins, das auch Helikase-Aktivität besitzt, zusammen mit zusätzlichen Stellen, die für die Interaktion zwischen DNA und Protein wichtig sind. Im Gegensatz dazu wird in Drosophila die Exonuklease-Aktivität von WRN (DmWRNexo) durch einen von der präsumtiven Helikase getrennten genetischen Locus kodiert, was eine biochemische (und genetische) Aufschlüsselung der Rolle der Exonuklease-Aktivität bei den Stabilitätsmechanismen des Genoms ermöglicht. Hier demonstrieren wir eine Fluoreszenzmethode zur Bestimmung der WRN-Exonuklease-Aktivität unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem DmWRNexo und end-markierten fluoreszierenden Oligonukleotiden. Dieses System ermöglicht eine höhere Reproduzierbarkeit als radioaktive Assays, da die Substrat-Oligonukleotide monatelang stabil bleiben, und bietet eine sicherere und relativ schnelle Methode für eine detaillierte Analyse der Nukleaseaktivität, die die Bestimmung der Nukleasepolarität, der Prozessivität und der Substratpräferenzen ermöglicht.

Die in vitro-Analyse der Exonuklease-Aktivität erfordert neben der eigentlichen Analyse eine Reihe von Vorbereitungsschritten. Ein Überblick über die Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.
Vor der Durchführung von fluoreszenzbasierten Exonuklease-Assays ist es entscheidend, die Detektion des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid-Substrats nach Trennung in Harnstoff-Acrylamid-Gelen mithilfe eines geeigneten Fluoreszenz-Bildgebungssystems zu optimieren. Die Wahl des F...

Exonukleasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewährleistung der Genomstabilität. Der Verlust der WRN-Exonuklease-Funktion führt zu vorzeitiger Alterung. Die Untersuchung von Substraten und anderen Anforderungen an die Nuklease in vitro kann helfen, ihre Rolle in vivo aufzuklären. Hier demonstrieren wir einen schnellen und reproduzierbaren fluoreszenzbasierten Assay zur Messung seiner Nukleaseaktivität.

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Dieses Experiment verwendet einen robusten, reproduzierbaren fluoreszenzbasierten Assay zur Bestimmung der Exonuklease-Aktivität. Inkubieren Sie das gereinigte Enzym mit dem fluoreszierenden DNA-Substrat, um dem Enzym die schrittweise Degradation der DNA zu ermöglichen. Trennen Sie anschließend die DNA in einem Acrylamid-Harnstoff-Gel, um die Abbauprodukte nach Größe aufzutrennen.Verwenden Sie anschließend die Fluoreszenzbildgebung, um den Umfang der Exonukleaseaktivität zu identifizieren und zu quantifizieren. Die ausgewerteten Ergebnisse können Aufschluss geben über die bevorzugten Substrat-Reaktionsbedingungen, die prozessive und Gesamtaktivität des Enzyms. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber etablierten, auf Radioaktivität basierenden Techniken liegt darin, dass die DNA-Substrate über einen langen Zeitraum stabil sind, was eine hervorragende Reproduzierbarkeit ermöglicht, die Kosten senkt und die Sicherheit erhöht.Zunächst wird der bakterielle Lysat mit einem geeigneten Volumen einer 2-molaren emit-ole-Stammlösung auf 20 Millimolar ole eingestellt. Anschließend wird das Volumen mit 20 Millimolar ole-Waschpuffer auf mindestens ein Milliliter aufgefüllt. Eine Ein-Milliliter-Hist-Trap-Säule wird mit 10 Milliliter Milli-Q-Wasser gewaschen. Danach wird die Säule mit 10 Milliliter 20 Millimolar ole equilibriert.Laden Sie anschließend das Lysat auf die Säule auf, wobei beim Beladen der Säule mit dem Lysat ein erheblicher Gegendruck auftreten kann. Dies ist vollkommen normal. Versuchen Sie nicht, zu starken Druck auf die Spritze auszuüben, und halten Sie einen gleichmäßigen, konstanten Druck aufrecht.Es ist üblich, eine leichte Farbveränderung zu beobachten, wenn das Lysat in die Säule eintritt. Sammeln Sie den Durchlauf in einer sterilen Biju-Flasche mit einem Fassungsvermögen von sieben Milliliter und lagern Sie ihn auf Eis. Spülen Sie anschließend die Säule mit 10 Milliliter 20 Millimolar Emitol.Leiten Sie nun fünf Milliliter 40 Millimolarer Iole durch die Säule. Beobachten Sie den Kolben des Spritzen sorgfältig, um die ein Milliliter-Fraktionen zu messen, die in jedes der Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt werden. Genauso nacheinander leiten Sie jeweils fünf Milliliter jeder Iole-Konzentration durch und sammeln jedes Mal fünf ein Milliliter-Fraktionen.Analysieren Sie die Fraktionen mittels Dot-Blot und Detektion mit einem HRP-konjugierten Anti-His-Antikörper, um die Peak-Fraktionen zu identifizieren. Halten Sie alle Reagenzien bei vier Grad Celsius, aliquotieren Sie die Master-Mix-Lösung in sterile, DNA-freie 0,5-Milliliter-Microfuge-Röhrchen, und führen Sie zusätzlich eine Kontrolle ohne Enzym durch, um das ursprüngliche Substrat sichtbar zu machen.Stellen Sie nun einen Heizblock auf die geeignete Temperatur für die Enzymaktivität ein. Bereiten Sie ein IDE mit Stopplösung vor und lagern Sie es bei Raumtemperatur. Ordnen Sie den Arbeitsbereich in der Nähe des Heizblocks, einschließlich der endgültigen Reagenzien, die der Reaktion hinzugefügt werden sollen.Mischen Sie eine Ein- bis 10-Mikroliter-Pipette mit Spitzen, einen Timer, einen Kryo-Rack oder einen Eisbehälter und Stop-Lösung. Starten Sie den Timer beim Hinzufügen des Enzyms zum ersten Reaktionsgefäß und stellen Sie das Gefäß in den Heizblock. Fahren Sie fort, indem Sie den restlichen Röhrchen im Abstand von 15 Sekunden Enzym hinzufügen, und stellen Sie die Röhrchen in den Heizblock, sobald der Timer die entsprechende Zeit erreicht hat.Fügen Sie 10 Mikroliter Stopplösung zur ersten Probe hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. Stellen Sie die Probe sofort auf Eis. Fahren Sie fort, die Reaktionen in den entsprechenden Zeitabständen und in der gleichen Reihenfolge wie ihre Einrichtung zu stoppen, sodass jede Reaktion exakt die gleiche Inkubationszeit hatte. Laden Sie die Hälfte oder das gesamte Volumen jeder Probe auf ein Acrylamidgel auf. Geben Sie eine x-Stopplösung, die Farbstoff enthält, in eine oder mehrere Spuren, um zu überprüfen, wie das Gel läuft.Nach der Elektrophorese entfernen Sie die Abstandshalter und eine Gelscheibe. Spülen und wischen Sie die Gelscheibe vorsichtig gründlich ab, um Rückstände des ausgefallenen Harnstoffs zu entfernen. Stellen Sie die Scheibe mit dem Gel nach unten auf den Glasraum des Gelhalters und bringen Sie sie gegebenenfalls in den Imager ein.Notieren Sie die Koordinaten des Gels auf dem Glas. Öffnen Sie die entsprechende Software und scannen Sie den notierten Bereich des Scanbereichs unter den im Textprotokoll beschriebenen Bedingungen. Beschneiden Sie das Bild und komprimieren Sie die Daten.Falls erforderlich, speichern und anschließend als Datei zur Analyse exportieren. Die Durchführung einer In-vitro-Analyse der Exonukleaseaktivität erfordert mehrere Vorbereitungsschritte. Zusätzlich zur eigentlichen Analyse dieser auf Fluoreszenz basierenden Exonuklease-Assays ist es entscheidend, die Detektion des Fluoreszenzbildgebungssystems zu optimieren.Beispielsweise erfordert ein Oligonukleotid-Substrat, das mit Fluorescein markiert ist, einen Filter, der eine Anregung bei 470 Nanometern und eine Emission bei 520 Nanometern ermöglicht. Mit diesem Filter lässt sich die Empfindlichkeit zur Detektion geringer Substrat- oder Produktkonzentrationen erhöhen, indem sowohl die Empfindlichkeit als auch die Auflösung des Detektors angepasst werden. Beachten Sie, dass eine gewisse Toleranz bezüglich der Filterbandbreite besteht.Da eine suboptimale Filterwahl immer noch eine teilweise Detektion des Substrats ermöglicht, wenn auch mit deutlich geringerer Empfindlichkeit. Eine geeignete Kombination aus markierter Oligonukleotidkonzentration und Einstellungen des Bildgebungssystems kann zu einer robusten Detektion des Substrats führen. Dies ist wichtig, da die Abbauprodukte nach Inkubation mit einer aktiven Exonuklease in geringeren Mengen in jedem Band vorliegen, da das Substrat schrittweise fragmentiert wurde.Ein erfolgreicher Exonuklease-Assay führt zum schrittweisen Abbau des Substrats in Richtung der Vier, was zu einem charakteristischen, treppenartigen Muster der DNA im Gel führt, das für den Exonuklease-Abbau typisch ist. Sobald die Detektion optimiert ist, kann der Assay verwendet werden, um unterschiedliche Aktivitäten sowohl qualitativ als auch quantitativ nachzuweisen.Zum Beispiel kann die Anwesenheit oder Abwesenheit von Aktivität bei Nuklease-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp-Protein bestimmt werden. Verschiedene Substrate können ebenfalls daraufhin überprüft werden, ob sie von der Nuklease abgebaut werden können. Wird untersucht.Dieser In-vitro-Assay kann verwendet werden, um die Substratspezifität und den Prozess einer interessierenden Nuklease zu testen.

a-fluorescence-based-exonuclease-assay-to-characterize-dmwrnexo

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genetische Studien in Hefe kann eingesetzt werden, um die molekularen und zellulären Funktionen der menschlichen Gene in Zellen DNA-Stoffwechsel zu untersuchen. Es werden Methoden für die genetische Charakterisierung des menschlichen...

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Echtzeit-Messung der DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten in Kerntransfer-Lysaten. Der Test liefert Raten von DNA-Reparatur-Aktivität zugänglich kinetische Analyse und ist anpassungsfähig für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität im Gewebe und Tumor-Lysaten oder mit gereinigten Proteinen.

Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

Eine nicht beschriftet, nicht-Radio-Isotopen Methode zur DNA-Polymerase Korrekturlesen und eine DNA-Reparatur-Assay wurde mithilfe von hochauflösenden MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine Einzel-Nukleotid-Erweiterung-Strategie entwickelt. Der Test erwies sich als zu sehr spezifischen, einfache, schnelle und einfach durchzuführen, für das Korrekturlesen und reparieren kürzer als 9-Nukleotide patches.

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer-basierte Echtzeit-Beobachtung, dass Systeme der DNA Strang Austausch Reaktion vermittelt durch Rad51 wurden entwickelt. Mithilfe der hier vorgestellten Protokolle, sind wir in der Lage, die Bildung von Zwischenprodukten Reaktion und ihre Umsetzung in Produkte, bei der Analyse auch die enzymatischen Kinetics der Reaktion zu erkennen.

Echtzeit-Beobachtung der DNA-Strang Exchange Reaktion vermittelt durch Rad51

Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit verschiedenen menschlichen Bedingungen verbunden, die ihr Potenzial als Biomarker zugrunde liegen. Die modulare und einfach zu implementierende Screening-Methodik, die in diesem Papier vorgestellt wird, ermöglicht die Auswahl spezifischer Nukleinsäuresonden zur Nutzung der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten.

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Die DNAzyme-basierten Nanomaschinen können für den hochselektiven und sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für das Design von DNAzym-basierten Nanomaschinen mit einem 10-23-Kern unter Verwendung freier Software und deren Anwendung am Beispiel der Detektion eines Epstein-Barr-Virusfragments.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Wir präsentieren Protokolle zur Bewertung der Kompetenz des Doppelstrangbruch-Reparaturwegs in Zellen unter Verwendung einer Reihe von lumineszenzbasierten extrachromosomalen Reportersubstraten.

Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays

In dieser Studie wird ein einfacher, benutzerfreundlicher ratiometrischer FRET-Assay für den Nachweis und die quantitative Beurteilung der DNase-Aktivität vorgestellt und seine Anwendung bei der Analyse einer schwachen Nuklease demonstriert.

Beurteilung der DNase-Aktivität durch ratiometrischen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

Dieses Protokoll beschreibt einen biochemischen Gel-Shift-Assay zur Messung der FEN1-Aktivität (Flap-Endonuklease 1) und der Inhibitorentwicklung.

Fluoreszenzbasierter Nachweis der FEN1-Nukleaseaktivität und Screening von niedermolekularen Inhibitoren

Lernen Sie ein fluoreszenzbasiertes Exonuklease-Assay zur Analyse der WRN-Exonukleaseaktivität mit fluoreszierenden DNA-Substraten. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare, kostengünstige und sichere Untersuchungen zur Genomstabilität.

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren (Video) | JoVE Journal

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren

Weitere Videos entdecken