Multiplex-Fluoreszenz-Mikroarray für Menschenspeichelproteinanalytik Verwendung von Polymer-Mikrosphären und LWL-Bundles
October 10th, 2013
Wir beschreiben ein Verfahren zum Profilieren von Speichelproteinen mit gemultiplexten Basis von Mikroarrays Antikörper. Monoklonale Antikörper wurden kovalent an Fluoreszenzfarbstoff-codierten 4,5 &mgr; m-Mikrokugeln unter Verwendung von Carbodiimid-Chemie gebunden. Die modifizierten Mikrosphären wurden in faseroptischen Mikrovertiefungen abgeschieden, um Protein-Spiegel im Speichel mittels Fluoreszenz-Sandwich-Immunoassays zu messen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mehrere Proteine in menschlichen Speichelproben mit Hilfe von Mikrosphären-basierten Fluoreszenzarrays zu analysieren. Kodieren Sie zunächst die Mikrosphären mit unterschiedlichen Mengen von zwei Fluoreszenzfarbstoffen. Koppeln Sie die Capture-Antikörper für verschiedene Proteine an die kodierten Mikrosphären.
Assemblieren Sie dann den Multiplex-Protein-Microarray auf dem Glasfaserbündel unter Verwendung der Sandwich-Immunoassays auf dem assemblierten Microarray-Assay für mehrere Proteine in den Testspeichelproben. Letztendlich kann die Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie die Signalantworten verschiedener Proteine in den Speichelproben messen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der von Eliza besteht darin, dass sie die gleichzeitige Analyse mehrerer Proteine in komplexen Bioflüssigkeiten ermöglicht.
Obwohl diese Methode Einblicke in die menschliche Speichelanalyse geben kann, kann sie auch auf andere biologische Grippe wie Serumurin und Auswurf angewendet werden. Wiegen Sie die Opium-TTA in einem Braunglasfläschchen und bereiten Sie eine 200 millimolare Stammlösung in Tetrahydrofurin vor. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und überprüfen Sie visuell, ob sich der Farbstoff vollständig aufgelöst hat.
Bereiten Sie in ähnlicher Weise eine 12 millimolare Stammlösung von Cumarin 30 vor, die durch Pipettieren vorsichtig gemischt wird. Optisch. Stellen Sie sicher, dass das D vollständig in die Mikrosphärensuspension aufgelöst ist, und übertragen Sie dann 60 Mikroliter in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Mikrosphären zu waschen, fügen Sie 600 Mikroliter PBS hinzu, die durch 20-maliges Pipettieren gemischt werden, und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 10.000 U/min.
Entfernen Sie nach drei Wäschen mit Tetrahydrofurinlösung den Überstand, resuspendieren Sie den Gaumen in 600 Mikrolitern Arbeitslösung und geben Sie die Mischung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit Parafolie und legen Sie es auf einen Schüttler. Schützen Sie es vor Licht, indem Sie es mit Aluminiumfolie abdecken.
Geben Sie 200 Mikroliter codierte Mikrosphärensuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit sicherem Verschluss. Geben Sie tropfenweise 150 Mikroliter hinzu, eine frisch zubereitete EDC-Lösung. Fügen Sie sofort 150 Mikroliter Sulfa-NHS-Lösung hinzu. Durch Pipettieren gut mischen und sicherstellen, dass die Suspension homogen ist.
Verschließen Sie das Röhrchen, verschließen Sie es mit Paraform und legen Sie es auf einen Shaker. Schützen Sie es vor Licht, indem Sie es mit Aluminiumfolie abdecken. Nach drei Wäschen P-B-S-S-D-S Puffer reus suspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern P-B-S-S-D-S Puffermischung s.
Übertragen Sie dann die Lösung auf 300 Mikroliter P-B-S-S-D-S-Puffer, der 60 Mikrogramm Capture-Antikörper enthält. Mischen Sie 50 Mikroliter jeder Art von Proteineinfang-Mikrosphären in ein neues Autoklaven-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Vorrats-Mikrosphären-Pool drei Minuten lang bei 7.000 U/min und entfernen Sie alle bis auf 100 Mikroliter Überstand.
Schneiden Sie nun Glasfaserbündel von Hand auf eine Länge von etwa fünf Zentimetern und polieren Sie beide Enden nacheinander mit Diamant-Läppfolien. Dann beschallen Sie das polierte Bündel zwei Minuten lang in entionisiertem Wasser. Um Partikel zu entfernen, setzen Sie einen kleinen magnetischen Rührstab in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein.
Fügen Sie 400 Mikroliter proteinfreien PBS-Puffer hinzu und rühren Sie 30 Minuten lang auf einer magnetischen Rührplatte. Um Luftblasen zu entfernen, ätzen Sie ein Ende des polierten Faserbündels 150 Sekunden lang in eine 0,025 % normale Chlorwasserstofflösung. Tauchen Sie das geätzte N sofort ein und beschallen Sie es eine Minute lang in deionisiertem Wasser.
Trocknen Sie dann die Faserbündel mit Druckluft, montieren Sie das Faserbündel auf einen Faserhalter und blockieren Sie das geätzte Ende in dem blasenfreien proteinfreien PBS-Puffer für eine Stunde, legen Sie ein Mikroliter-ALI-Quad der gelagerten Mikrosphärensuspension auf das geätzte Ende des Glasfaserbündels. Schützen Sie das Setup vor Licht mit einer mit Alufolie umwickelten Box. Nach 15 Minuten verringert sich das Volumen der Suspension durch Verdampfen und drückt die Mikrosphären in die geätzten Mikrovertiefungen.
Verwenden Sie einen mit Probenlösung getränkten Tupfer, um Mikrosphären zu entfernen, die nicht in den Mikrovertiefungen eingeschlossen sind. Um den Protein-Microarray gebrauchsfertig zu machen, geben Sie 200 Mikroliter Probenlösung in ein 0,5-Milliliter-Autoklaven-Mikrozentrifugenröhrchen. Tauchen Sie den auf die Faser geladenen Protein-Microarray in die Lösung und legen Sie ihn auf einen Shaker.
Vor Licht schützen, indem Sie es mit Alufolie abdecken. Tauchen Sie anschließend den Protein-Microarray in ein neues Autoklaven-Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern Waschpuffer und schütteln Sie ihn zwei Minuten lang bei 600 U/min. Inkubieren Sie nun den Microarray 30 Minuten lang in einer 100-Mikroliter-Lösung eines Nachweisantikörpercocktails, der biotinylierte Nachweisantikörper und einen PBS-Blockierungspuffer enthält.
Reinigen Sie das distale Ende des Faserbündels bei Raumtemperatur im Dunkeln mit einem mit absolutem Ethanol getränkten Tupfer. Trocknen Sie dann beide Enden der Faser mit Druckluft, montieren Sie die Faser auf ein Epi-Fluoreszenzmikroskop und bilden Sie durch das distale Ende der Faser ab, nehmen Sie die Mikrosphärenbilder auf, die den Fluoreszenzemissionsintensitäten von Opium TTAC 30 und SAP entsprechen. Hier sind die Kodierungsbilder von sieben Mikrosphärentypen zu sehen.
Im UTTA-Kodierungsbild sind zwei Intensitätsstufen zu beobachten, die für Mikrosphären stehen, die mit unterschiedlichen Mengen an UTTA-Die kodiert sind. Ähnliche Ergebnisse sind im C 30-Kodierungsbild zu beobachten. Die MATLAB-Bildanalyse ermöglicht die Berechnung der Fluoreszenzintensitäten verschiedener Mikrosphären im Signalbild. Die Dekodierungsergebnisse sind in Abbildung 2D sieben dargestellt.
Unterschiedliche Mikrosphären werden erfolgreich entschlüsselt. Die Mikrosphären zeigen keine Reaktion, wenn sie mit Assay-Puffer inkubiert werden. Bei der Inkubation mit menschlichen Speichelproben werden signifikante Fluoreszenzreaktionen beobachtet.
Zum besseren Vergleich wurden die Kontraste in diesen beiden Abbildungen auf das gleiche Niveau angepasst. Einmal beherrscht, ermöglicht diese Methode eine reproduzierbare Analyse verschiedener Proteine in den menschlichen Speichelproben. Die Ergebnisse von drei unabhängigen Detektionen an derselben Probe werden gezeigt.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Mikrosphären-basierte Multiplex-Protein-Mikrostrahlung herstellt und sie für die Analyse komplexer Bioflüssigkeiten verwendet. Befolgen Sie dieses Verfahren. Auch andere Protein-Biomarker in verschiedenen komplexen Biofluiden können analysiert werden.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Überblick
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Profilerstellung von Speichelproteinen unter Verwendung von multiplexierten, microsphere-basierten Antikörper-Arrays. Die Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Proteine in menschlichen Speichelproben und erweitert die Möglichkeiten herkömmlicher Assays.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biotechnologie
- Proteomik
Hintergrund
- Speichel enthält eine Vielzahl von Proteinen, die Einblicke in Gesundheit und Krankheit geben können.
- Herkömmliche Methoden wie ELISA sind auf die Analyse eines Proteins nach dem anderen beschränkt.
- Multiplex-Assays können die Effizienz und Datenfülle verbessern.
- Die fluoreszente Mikrosphären-Technologie bietet einen neuartigen Ansatz für die Proteinerkennung.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur gleichzeitigen Analyse mehrerer Proteine in Speichel zu entwickeln.
- Die Sensitivität und Spezifität der Proteinerkennung in komplexen Bioflüssigkeiten zu verbessern.
- Eine effizientere Alternative zu bestehenden Einzelanalyt-Assays zu bieten.
Verwendete Methoden
- Codierung von Mikrosphären mit fluoreszierenden Farbstoffen.
- Kovalente Verknüpfung von Capture-Antikörpern mit den Mikrosphären.
- Zusammenbau von multiplexierten Protein-Microarrays auf Glasfaserbündeln.
- Verwendung von Fluoreszenz-Sandwich-Immunoassays zum Nachweis von Proteinen in Speichelproben.
Hauptergebnisse
- Die Methode konnte erfolgreich mehrere Proteine in Speichelproben nachweisen.
- Die Fluoreszenzmikroskopie lieferte klare Signalantworten für verschiedene Proteine.
- Die Technik zeigte Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA-Methoden.
- Die Ergebnisse deuten auf potenzielle Anwendungen in der klinischen Diagnostik hin.
Schlussfolgerungen
- Dieser multiplexierte Ansatz ermöglicht eine effiziente Analyse von Speichelproteinen.
- Die Methode könnte ein besseres Verständnis verschiedener Gesundheitszustände erleichtern.
- Zukünftige Studien könnten die Anwendung dieser Technik auf andere Bioflüssigkeiten ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
