Multiplex-Fluoreszenz-Mikroarray für Menschenspeichelproteinanalytik Verwendung von Polymer-Mikrosphären und LWL-Bundles

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mehrere Proteine in menschlichen Speichelproben mit Hilfe von Mikrosphären-basierten Fluoreszenzarrays zu analysieren. Kodieren Sie zunächst die Mikrosphären mit unterschiedlichen Mengen von zwei Fluoreszenzfarbstoffen. Koppeln Sie die Capture-Antikörper für verschiedene Proteine an die kodierten Mikrosphären.

Assemblieren Sie dann den Multiplex-Protein-Microarray auf dem Glasfaserbündel unter Verwendung der Sandwich-Immunoassays auf dem assemblierten Microarray-Assay für mehrere Proteine in den Testspeichelproben. Letztendlich kann die Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie die Signalantworten verschiedener Proteine in den Speichelproben messen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der von Eliza besteht darin, dass sie die gleichzeitige Analyse mehrerer Proteine in komplexen Bioflüssigkeiten ermöglicht.

Obwohl diese Methode Einblicke in die menschliche Speichelanalyse geben kann, kann sie auch auf andere biologische Grippe wie Serumurin und Auswurf angewendet werden. Wiegen Sie die Opium-TTA in einem Braunglasfläschchen und bereiten Sie eine 200 millimolare Stammlösung in Tetrahydrofurin vor. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und überprüfen Sie visuell, ob sich der Farbstoff vollständig aufgelöst hat.

Bereiten Sie in ähnlicher Weise eine 12 millimolare Stammlösung von Cumarin 30 vor, die durch Pipettieren vorsichtig gemischt wird. Optisch. Stellen Sie sicher, dass das D vollständig in die Mikrosphärensuspension aufgelöst ist, und übertragen Sie dann 60 Mikroliter in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Mikrosphären zu waschen, fügen Sie 600 Mikroliter PBS hinzu, die durch 20-maliges Pipettieren gemischt werden, und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 10.000 U/min.

Entfernen Sie nach drei Wäschen mit Tetrahydrofurinlösung den Überstand, resuspendieren Sie den Gaumen in 600 Mikrolitern Arbeitslösung und geben Sie die Mischung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit Parafolie und legen Sie es auf einen Schüttler. Schützen Sie es vor Licht, indem Sie es mit Aluminiumfolie abdecken.

Geben Sie 200 Mikroliter codierte Mikrosphärensuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit sicherem Verschluss. Geben Sie tropfenweise 150 Mikroliter hinzu, eine frisch zubereitete EDC-Lösung. Fügen Sie sofort 150 Mikroliter Sulfa-NHS-Lösung hinzu. Durch Pipettieren gut mischen und sicherstellen, dass die Suspension homogen ist.

Verschließen Sie das Röhrchen, verschließen Sie es mit Paraform und legen Sie es auf einen Shaker. Schützen Sie es vor Licht, indem Sie es mit Aluminiumfolie abdecken. Nach drei Wäschen P-B-S-S-D-S Puffer reus suspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern P-B-S-S-D-S Puffermischung s.

Übertragen Sie dann die Lösung auf 300 Mikroliter P-B-S-S-D-S-Puffer, der 60 Mikrogramm Capture-Antikörper enthält. Mischen Sie 50 Mikroliter jeder Art von Proteineinfang-Mikrosphären in ein neues Autoklaven-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Vorrats-Mikrosphären-Pool drei Minuten lang bei 7.000 U/min und entfernen Sie alle bis auf 100 Mikroliter Überstand.

Schneiden Sie nun Glasfaserbündel von Hand auf eine Länge von etwa fünf Zentimetern und polieren Sie beide Enden nacheinander mit Diamant-Läppfolien. Dann beschallen Sie das polierte Bündel zwei Minuten lang in entionisiertem Wasser. Um Partikel zu entfernen, setzen Sie einen kleinen magnetischen Rührstab in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein.

Fügen Sie 400 Mikroliter proteinfreien PBS-Puffer hinzu und rühren Sie 30 Minuten lang auf einer magnetischen Rührplatte. Um Luftblasen zu entfernen, ätzen Sie ein Ende des polierten Faserbündels 150 Sekunden lang in eine 0,025 % normale Chlorwasserstofflösung. Tauchen Sie das geätzte N sofort ein und beschallen Sie es eine Minute lang in deionisiertem Wasser.

Trocknen Sie dann die Faserbündel mit Druckluft, montieren Sie das Faserbündel auf einen Faserhalter und blockieren Sie das geätzte Ende in dem blasenfreien proteinfreien PBS-Puffer für eine Stunde, legen Sie ein Mikroliter-ALI-Quad der gelagerten Mikrosphärensuspension auf das geätzte Ende des Glasfaserbündels. Schützen Sie das Setup vor Licht mit einer mit Alufolie umwickelten Box. Nach 15 Minuten verringert sich das Volumen der Suspension durch Verdampfen und drückt die Mikrosphären in die geätzten Mikrovertiefungen.

Verwenden Sie einen mit Probenlösung getränkten Tupfer, um Mikrosphären zu entfernen, die nicht in den Mikrovertiefungen eingeschlossen sind. Um den Protein-Microarray gebrauchsfertig zu machen, geben Sie 200 Mikroliter Probenlösung in ein 0,5-Milliliter-Autoklaven-Mikrozentrifugenröhrchen. Tauchen Sie den auf die Faser geladenen Protein-Microarray in die Lösung und legen Sie ihn auf einen Shaker.

Vor Licht schützen, indem Sie es mit Alufolie abdecken. Tauchen Sie anschließend den Protein-Microarray in ein neues Autoklaven-Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern Waschpuffer und schütteln Sie ihn zwei Minuten lang bei 600 U/min. Inkubieren Sie nun den Microarray 30 Minuten lang in einer 100-Mikroliter-Lösung eines Nachweisantikörpercocktails, der biotinylierte Nachweisantikörper und einen PBS-Blockierungspuffer enthält.

Reinigen Sie das distale Ende des Faserbündels bei Raumtemperatur im Dunkeln mit einem mit absolutem Ethanol getränkten Tupfer. Trocknen Sie dann beide Enden der Faser mit Druckluft, montieren Sie die Faser auf ein Epi-Fluoreszenzmikroskop und bilden Sie durch das distale Ende der Faser ab, nehmen Sie die Mikrosphärenbilder auf, die den Fluoreszenzemissionsintensitäten von Opium TTAC 30 und SAP entsprechen. Hier sind die Kodierungsbilder von sieben Mikrosphärentypen zu sehen.

Im UTTA-Kodierungsbild sind zwei Intensitätsstufen zu beobachten, die für Mikrosphären stehen, die mit unterschiedlichen Mengen an UTTA-Die kodiert sind. Ähnliche Ergebnisse sind im C 30-Kodierungsbild zu beobachten. Die MATLAB-Bildanalyse ermöglicht die Berechnung der Fluoreszenzintensitäten verschiedener Mikrosphären im Signalbild. Die Dekodierungsergebnisse sind in Abbildung 2D sieben dargestellt.

Unterschiedliche Mikrosphären werden erfolgreich entschlüsselt. Die Mikrosphären zeigen keine Reaktion, wenn sie mit Assay-Puffer inkubiert werden. Bei der Inkubation mit menschlichen Speichelproben werden signifikante Fluoreszenzreaktionen beobachtet.

Zum besseren Vergleich wurden die Kontraste in diesen beiden Abbildungen auf das gleiche Niveau angepasst. Einmal beherrscht, ermöglicht diese Methode eine reproduzierbare Analyse verschiedener Proteine in den menschlichen Speichelproben. Die Ergebnisse von drei unabhängigen Detektionen an derselben Probe werden gezeigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Mikrosphären-basierte Multiplex-Protein-Mikrostrahlung herstellt und sie für die Analyse komplexer Bioflüssigkeiten verwendet. Befolgen Sie dieses Verfahren. Auch andere Protein-Biomarker in verschiedenen komplexen Biofluiden können analysiert werden.