Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

Dieses Verfahren lokalisiert mehrere endogene Lipide räumlich innerhalb einer Rinderlinse. Unter Verwendung der Technik der matrixunterstützten laserdesorptiven Ionisierung wird eine Massenspektrometrie-Bildgebung durchgeführt. Zunächst wird ein dünner Gewebeschnitt der Rinderlinse präpariert und mit einer Multimatrix beschichtet, anschließend wird ein MALDI-Massenspektrometrie-Datensatz aufgenommen.

Verarbeiten Sie den Datensatz zu einer visuellen Darstellung der nachgewiesenen Lipide im Linsengewebeschnitt. Zusammen können diese Ergebnisse die Lokalisation und relative Häufigkeit der Lipide in einer bovinen Linse bestimmen und eine visuelle Darstellung dieser Verteilung erzeugen. Im Vergleich zu anderen Methoden wie der Lipidextraktion gefolgt von LC-MS-Analyse ermöglicht die MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Lipide, ohne deren räumliche Lokalisation zu verlieren. Entnehmen Sie die flashgefrorenen Gewebeproben der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Kapsel von der Oberfläche der Linse, um einen gesamten Abschnitt einer Rinderkälberlinse zu fixieren. Geben Sie ein oder zwei Tropfen Wasser auf die Gewebeschnittplatte eines Kryostaten. Platzieren Sie die Linse schnell in das Wasser, bevor es erstarrt, sobald der Kryostat die optimale Temperatur erreicht hat.

Schneiden Sie das Gewebe äquatorial in Schnitte mit einer Dicke von 20 Mikrometer. Entsorgen Sie die ersten Gewebeschnitte und verwenden Sie nur Schnitte, die nahe an oder in der Äquatorialebene liegen, zur Abbildung des Augenlinsengewebes. Geben Sie 1,5 Mikroliter Ameisensäure hinzu, um die Oberfläche eines ITO-beschichteten Objektträgers vorzuwetten.

Überführen Sie die Gewebeschnitte dann vorsichtig auf den Objektträger innerhalb des Kryostaten. Anschließend lyophilisieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang, bevor die MALDI-Matrix aufgetragen wird. Tragen Sie mit einem Korrekturflüssigkeitsstift drei Orientierungsmarkierungen auf die nichtleitende Oberfläche des ITO-beschichteten Glasobjektträgers auf.

Nun nehmen Sie ein optisches Bild des Gewebeschnitts mit einem Flachbettscanner auf und speichern Sie es in einem geeigneten Format wie TIFF oder JPEG. Bedecken Sie zunächst die Kanten auf der Vorderseite der mit ITO beschichteten Objektträger mit Klebeband, damit die Matrix nicht auf die Kanten des Objektträgers aufgetragen wird. Bereiten Sie die Matrix in einem geeigneten Lösungsmittel vor.

Tragen Sie anschließend Matrixlösungen auf die Oberflächen der Gewebeschnitte auf. Beschichten Sie den Objektträger durch 20 Beschichtungszyklen mit der Matrix. Alternativ kann ein pneumatisch betriebener Airbrush-Sprüher verwendet werden, um die Matrizes aufzutragen, falls ein Lösungsmittel mit dem elektronischen Matrix-Sprüher nicht kompatibel ist.

Für die Massenkalibrierungslösung verdünnen Sie die Standardlösung des ES-Abgleichgemischs im Verhältnis 1 zu 200 in 60 % Isopropanol. Leiten Sie zwei Mikroliter pro Minute der verdünnten ES-Abgleichgemischlösung in die Dualmodus-Elektrospray-Ionisations-Ionenquelle am Gerät für eine Fourier-Transform-Ion-Cyclotron-Resonanz-Massenspektrometrie ein. Betreiben Sie das FT-ICR-Gerät im positiven Ionen-ESI-Modus mit Breitbanddetektion und einer Datenerfassungsgröße von 1024 Kilobyte pro Sekunde. Stellen Sie typischerweise die ESI-Parameter auf 3.900 Volt Kapillar-Elektrospray-Spannung ein.

Eine Spray-Shield-Spannung von 3.600 Volt, Nebulisierungs-Stickstoffgasfluss bei zwei Litern pro Minute. Trockener Stickstoffgasfluss bei vier Litern pro Minute und einer Temperatur von 200 Grad Celsius. Stellen Sie außerdem die Skimmer-Einspannung auf 15 Volt ein.

Flugzeit auf 0,01 Sekunden, Argon-Kollisionsgasfluss auf 0,4 Liter pro Sekunde, Ionenanreicherungszeit in der Quelle auf 0,1 Sekunde und Ionenanreicherungszeit in der Kollisionszelle auf 0,2 Sekunden einstellen. Anschließend die F-T-I-C-R-Betriebsparameter optimieren, um die analytische Empfindlichkeit im Massenbereich von m/z 200 bis 1400 zu maximieren, wobei gleichzeitig gute zeitdomänige Free-Induction-Decay-Signale erhalten bleiben sollen. Danach die ESI-Massenspektren aufnehmen und das Gerät unter Verwendung der Referenzmassen der Standardverbindungen in der E es-Abstimmungs-Mischlösung kalibrieren.

Um das Instrument für den MALDI-Betrieb einzustellen, lösen Sie mehrere Aliquots zu je einem Mikroliter einer gemischten Turin- und INE-Standardlösung in der Matrixlösung bei einer Konzentration von jeweils einem Mikromolar auf und pipettieren Sie diese Lösungen direkt auf einen der Gewebeprobenabschnitte. Legen Sie den Objektträger in einen Gewebe-Objektträger-Adapter und laden Sie den Adapter von der MALDI-Seite in die duale ESI-MALDI-Ionenquelle ein. Anschließend optimieren Sie die geeigneten MALDI-Betriebsparameter für die Laserleistung und die Anzahl der Laserimpulse zur MALDI-Signalerfassung für jeden Massenscan.

Nach der Abstimmung, Kalibrierung und Optimierung des Instruments für MALDI-MSI-Experimente muss die physische Position eines zu bildgebenden Gewebeschnitts mit dem entsprechenden aufgezeichneten optischen Bild innerhalb der Bildgebungssoftware ausgerichtet werden. Richten Sie die drei Korrekturflüssigkeitsmarkierungen mithilfe einer Dreipunkt-Triangulationsmethode aus. Starten Sie anschließend einen simultanen ESI-MALDI-Betrieb, sodass jedes Massenspektrum die Referenzmassenpeaks der ESI-Tuning-Mix-Lösung für die interne Massenkalibrierung nach der Datenaufnahme enthält.

Dämpfen Sie zunächst das ESI-Signal, indem Sie die Kapillarspannung so weit verringern, bis die MALDI-Signale die Spektren dominieren, während die ESI-Kalibriersignale noch ausreichend hoch für eine interne Massenkalibrierung sind. Richten Sie danach eine automatisierte Methode zur schrittweisen Erhöhung der Laserstrahlung ein. Verwenden Sie eine zufällige Spot-Analyse.

Definieren Sie die zu bildgebenden Geweberegionen und stellen Sie die geeignete Schrittgröße für die Laser-RA ein. Kalibrieren Sie die MALDI-Massenspektren mittels interner Kalibrierung für den initialen Vergleich und zur Auswahl von Peaks für die MS/MS-Deisotopierung, und wählen Sie die monoisotopen Peaks mithilfe eines angepassten VBA-Skripts aus. Exportieren Sie die resultierenden Listen der monoisotopen Peaks. Geben Sie die gemessenen Werte des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses in die Melin-nine- und/oder die HMDB-Metabolom-Datenbanken ein, um eine Massenabgleichung mit den Bibliothekseinträgen durchzuführen.

Als Nächstes erzeugen Sie MALDI-Bilder für alle Lipidentitäten, die über den gesamten Gewebeschnitt hinweg detektiert wurden, unter Verwendung einer Bildgebungssoftware mit einer Massenfilterbreite von einem Teil pro Million am Peak-Apex. Sobald Bilder für alle Masse-zu-Ladung-Verhältniswerte generiert wurden, die mit Datenbankeinträgen übereinstimmen, erzeugen Sie zusätzlich Bilder für alle anderen Peaks, um einzigartige Verteilungsmuster zu identifizieren, die später für bestimmte Gewebe, wie beispielsweise die Rinderlinse, näher untersucht werden können. Umfangreiche Geweberisse werden häufig beobachtet, wenn die direkte Auftaumontage verwendet wird.

Die Vorbehandlung des IT-OAS-Objektträgers mit Ethanol oder Ameisensäure trägt dazu bei, die Integrität der Gewebeschnitte während der Gewebemontage zu bewahren. Sowohl die Wahl der Matrix als auch die Auswahl des Lösungsmittels sind wichtige Faktoren, die die Qualität der MALDI-Spektren beeinflussen. Diese Beispiele vergleichen ein Spektrum, das mit einem effizienten Matrixlösungsmittel erzeugt wurde, mit einer ungeeigneten Wahl des Matrixlösungsmittels für Diol.

Nachdem der Satz von Massenspektren aus einem Maldi-MSI-Experiment erfasst wurde, kann das Bild für jedes der detektierten Ionen generiert werden, wobei jedes Pixel einen Laserbestrahlungspunkt von der Oberfläche eines Gewebeschnitts darstellt. Die relativen Konzentrationen der Analyten können in den verschiedenen Bereichen des Gewebeschnitts detailliert dargestellt werden.

Bei den meisten Experimenten wird die Daten auf den Gesamtionenstrom innerhalb jedes Spektrums normalisiert. Ohne diese Normalisierung könnten Bereiche mit besserer Analyt-Matrix aufgrund der COC-Kristallisation stärkere Signale für die Analyten erzeugen, was die Daten verfälschen würde. Auch die Gewebepräparation kann das erzeugte Bild erheblich verändern.

Wenn die Probe zu feucht ist, werden die Analyten sich im Gewebe verteilen und ein Großteil der räumlichen Information geht verloren. Diese Demonstration eines Gewebeimaging-Experiments an der Augenlinse verwendete Diol als Multi-Matrixx, um die räumliche Verteilung von Lipiden mittels F-T-I-C-R-M-S zu bestimmen. Die Abbildung von Lipiden in verschiedenen Gewebetypen kann auf ähnliche Weise unter Verwendung von Diol oder einer anderen Matrix erreicht werden.