Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

Bei diesem Verfahren werden mehrere endogene Lipide innerhalb einer Rinderlinse räumlich lokalisiert. Unter Verwendung der Technik des matrixgestützten Lasers, der DESORPTIONSIONISATION, der massenspektrometrischen Bildgebung. Bereiten Sie zunächst einen dünnen Schnitt aus Rinderlinsengewebe vor und wenden Sie ein Multi-Matrixx an, dann erfassen Sie einen Maldi-Massenspektraldatensatz.

Verarbeiten Sie den Datensatz zu einer visuellen Darstellung der detektierten Lipide auf dem Linsengewebeschnitt. Zusammen können diese Ergebnisse die Position und die relative Häufigkeit der Lipide in einer Rinderlinse bestimmen und eine visuelle Darstellung dieser Verteilung erzeugen. Im Vergleich zu anderen Methoden wie der Lipidextraktion mit anschließender LCMS-Analyse ermöglicht die maldi-Massenspektrometrie die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Lipide, ohne ihre räumliche Lokalisierung zu verlieren. Entnehmen Sie die schockgefrorenen Gewebeproben aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Kapsel von der Oberfläche der Linse, um einen ganzen Teil der Rinderkalbslinse zu fixieren. Geben Sie ein bis zwei Tropfen Wasser auf die Gewebeschneidestufe eines Kryostaten. Legen Sie die Linse schnell ins Wasser, bevor sie erstarrt, wenn der Kryostat die optimale Temperatur erreicht hat.

Schneiden Sie das Gewebe äquatorial in Abschnitte von 20 Mikrometern Dicke. Verwerfen Sie die ersten Gewebeschnitte und verwenden Sie nur Schnitte, die sich in der Nähe der Äquatorebene befinden oder diese hinzufügen, um das Augenlinsengewebe abzubilden. Fügen Sie 1,5 Mikroliter Ameisensäure hinzu, um die Oberfläche eines ITO-beschichteten Objektträgers vorzubenetzen.

Anschließend werden die Gewebeschnitte vorsichtig auf den Objektträger im Inneren des Kryostaten übertragen. Anschließend die Objektträger 15 Minuten lang lyophilisieren, bevor die Maldi-Matrix aufgetragen wird. Fügen Sie mit einem Korrekturflüssigkeitsstift drei Lehrmarkierungen auf der nicht leitenden Oberfläche des ITO-beschichteten Objektträgers hinzu.

Nehmen Sie nun mit einem Flachbettscanner ein optisches Bild des Gewebeobjektträgers auf und speichern Sie es in einem geeigneten Format wie TIFF oder JPEG. Decken Sie zunächst die Kanten auf der Vorderseite der ITO-beschichteten Objektträger mit Klebeband ab, damit die Matrize die Kanten des Objektträgers nicht bedeckt. Bereiten Sie die Matrix für die Verwendung in einem geeigneten Lösungsmittel vor.

Tragen Sie dann Matrixlösungen auf die Oberflächen der Gewebeschnitte auf. Beschichten Sie den Objektträger mit 20 Zyklen Matrixbeschichtung. Alternativ kann ein pneumatisch unterstütztes Airbrush-Sprühgerät zum Auftragen der Matrizen eingesetzt werden, wenn ein Lösungsmittel mit dem elektronischen Matrixsprühgerät nicht kompatibel ist.

Für die Massenkalibrierungslösung verdünnen Sie die ES-Abstimmungsmischungs-Standardlösung um den Faktor eins bis 200 in 60 %. Isopropanol führte zwei Mikroliter pro Minute der verdünnten ES-Abstimmungsmischungslösung in die Dual-Mode-Elektrospray-Ionisationsionenquelle auf dem Gerät für vier eine Transformationsionen-Zyklotronresonanz ms ein. Betreiben Sie das F-T-I-C-R-Instrument im positiven Ionen-ESI-Modus mit Breitbanddetektion und einer Datenerfassungsgröße von 1024 Kilobyte pro Sekunde. Stellen Sie in der Regel die ESI-Parameter von 3.900 Volt Kapillar-Elektrosprühspannung ein.

Eine Sprühschildspannung von 3.600 Volt zerstäubt den Stickstoffgasfluss mit zwei Litern pro Minute. Trockener Stickstoffgasfluss mit vier Litern pro Minute und einer Temperatur von 200 Grad Celsius. Stellen Sie den Skimmer ebenfalls um eine Spannung auf 15 Volt ein.

Flugzeit auf 0,01 Sekunden, Kollisions-Argongasfluss auf 0,4 Liter pro Sekunde, Akkumulationszeit der Ionenquelle auf 0,1 Sekunden und Akkumulationszeit der Kollisionszelle auf 0,2 Sekunden. Stimmen Sie nun die Betriebsparameter F-T-I-C-R ab, um die analytische Empfindlichkeit über den Massenbereich von Masse zu Ladung Verhältnis 200 bis 1400 zu maximieren und gleichzeitig gute zeitbereichsfreie Induktionszerfallssignale beizubehalten. Erfassen Sie dann die ESI-Massenspektren und kalibrieren Sie das Instrument anhand der Referenzmassen der Standardverbindungen in der E es Tuning Mix-Lösung.

Um das Gerät auf den MALDI-Betrieb abzustimmen, lösen Sie mehrere Ein-Mikroliter-Aliquots einer gemischten Turin- und INE-Standardlösung in der Matrixlösung in einer Konzentration von jeweils einem Mikromolar auf und tupfen Sie diese Lösungen direkt auf einen der Probengewebeschnitte. Setzen Sie den Objektträger in einen Gewebe-Objektträgeradapter ein und laden Sie den Adapter von der MALDI-Seite in die duale ESI-Maldi-Ionenquelle. Optimieren Sie anschließend die entsprechenden MALDI-Betriebsparameter für die Laserleistung und die Anzahl der Laserschüsse für die MALDI-Signalakkumulation für jeden Massenscan.

Nach dem Tuning, Kalibrieren und Optimieren des Instruments für maldi MSI-Experimente wird die physische Position eines abzubildenden Gewebeschnitts mit dem aufgezeichneten optischen Bild in der Bildgebungssoftware abgeglichen. Richten Sie die drei Markierungen der Korrekturflüssigkeit mit einer Drei-Punkt-Triangulationsmethode aus. Starten Sie dann einen simultanen ESI MALDI-Vorgang, so dass jedes Massenspektrum die Referenzmassenpeaks der E ES-Tuning-Mix-Lösung für die interne Massenkalibrierung nach der Erfassung enthält.

Dämpfen Sie zunächst das ESI-Signal, indem Sie die Kapillarspannung verringern, bis die MALDI-Signale die Spektren dominieren, während die ESI-Kalibersignale noch hoch genug für eine interne Massenkalibrierung sind. Richten Sie als Nächstes eine automatisierte Rasierungsmethode für Strahlungslaser ein. Mit einer Zufallspunktanalyse.

Definieren Sie die abzubildenden Geweberegionen und stellen Sie die entsprechende Schrittweite für die Laser-RA ein. Kalibrieren Sie die MALDI-Massenspektren mit interner Kalibrierung für den ersten Vergleich und zur Auswahl von Peaks für MSMS de isotope und zur Auswahl der Mono-Isotopen-Peaks mit einem angepassten VBA-Skript und exportieren Sie die resultierenden Mono-Isotopen-Peaklisten. Geben Sie die gemessenen Werte des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses in die Melin-Neun- und/oder HMDB-Metabolomdatenbanken ein, um den Massenabgleich mit den Bibliothekseinträgen zu ermöglichen.

Generieren Sie als Nächstes Maldi-Bilder für alle Lipidentitäten, die über den gesamten Gewebeabschnitt hinweg erkannt wurden, mithilfe einer Bildgebungssoftware mit einer Massenfilterbreite von einem Teil pro Million an der Spitzenspitze. Nachdem Bilder für alle Werte des Masse-Ladungs-Verhältnisses generiert wurden, die mit den Datenbankeinträgen übereinstimmen, generieren Sie auch Bilder für alle anderen Peaks, um nach einzigartigen Verteilungsmustern zu suchen, die später für bestimmte Gewebe, wie z. B. Rinderlinsen, untersucht werden können. Ein großflächiges Reißen des Gewebes wird häufig beobachtet, wenn eine direkte Auftaumontage verwendet wird.

Preco des IT OAS-Objektträgers mit Ethanol oder Ameisensäure hilft, die Integrität der Gewebeschnitte während der Gewebemontage zu erhalten. Sowohl die Wahl der Matrix als auch die Wahl des Lösungsmittels sind wichtige Faktoren, die die Qualität der MALDI-Spektren beeinflussen. In diesen Beispielen wird ein Spektrum, das mit einem effizienten Matrixlösungsmittel hergestellt wurde, mit einer schlechten Wahl des Matrixlösungsmittels für Diol verglichen.

Sobald die Massenspektren eines Maldi-MSI-Experiments aufgenommen wurden, kann das Bild für jedes der detektierten Ionen erzeugt werden. Dabei stellt jedes Pixel einen Laserbestrahlungspunkt von der Oberfläche eines Gewebeschnitts dar. Die relativen Konzentrationen der Analyten können in den verschiedenen Abschnitten des Gewebeschnitts detailliert dargestellt werden.

In den meisten Experimenten werden die Daten als Gesamtionenstrom innerhalb jedes Spektrums normiert. Ohne diese Normalisierung von Bereichen mit besserer Analytmatrix könnte die COC-Kristallisation stärkere Signale für die Analyten verursachen, was die Daten verzerren würde. Die Gewebevorbereitung kann auch das erzeugte Bild dramatisch verändern.

Wenn die Probe zu nass ist, delokalisieren sich die Analyten auf dem Gewebe und ein Großteil der räumlichen Informationen geht verloren. Bei dieser Demonstration eines Gewebebildgebungsexperiments an einer Augenlinse wurde Diol als Multi-Matrixx verwendet, um die räumliche Verteilung von Lipiden mit F-T-I-C-R-M-S zu bestimmen. Die Bildgebung von Lipiden in verschiedenen Gewebetypen kann unter Verwendung von Diol oder einer anderen Matrix auf ähnliche Weise erfolgen.