Name: Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T19:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Erfahren Sie die MALDI-Imaging-Methode mit Dithranol zur räumlichen Analyse endogener Lipide in Rinderlinsengewebe. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Lipide ohne Verlust ihrer räumlichen Information.

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Die Autoren möchten Genome Kanada und Genome British Columbia Plattform für Finanzierung und Unterstützung danken. Wir danken auch Dr. Carol E. Parker für kritische Durchsicht des Manuskripts und Bearbeitung Unterstützung. CHL auch dank der British Columbia Proteomics Netzwerk für die Unterstützung.

1. Tissue Schnitte <ol><li> Blitz Einfrieren der Proben Frage nach der Ernte, mit flüssigem Stickstoff, versenden sie auf Trockeneis (wenn Versandkosten anfallen), und speichern Sie sie bei -80 ° C, bis die Gewebe Schnitte. (Wenn kommerzielle Proben verwendet werden, sicherzustellen, daß die Proben in dieser Weise hergestellt.) </li><li> Schneiden Organe auf eine überschaubare Größe, die MALDI-Target passen. Schneiden Sie unerwünschte Teile der Orgel. Aus diesem hier beschriebenen Studie wurden Kälberlinsen mit einer zuvor beschriebenen Verfahren 35 vor Gewebeschneide decapsulated. </li><li> Entfernen ganze Organe aus dem -80 ° C Gefrierschrank und fixieren sie auf einer kryogenen Gewebeschneiden Bühne. Um einen Kälberlinse beheben, legen Sie einen oder zwei Tropfen Wasser auf das Gewebe Senkungsstufe eines Kryostaten. Schnell stellen die Linse im Wasser, bevor es erstarrt. Alternativ kann eine optimale Schnitttemperatur (OCT)-Verbindungen auch verwendet, um ein Gewebe auf den Schneid Bühne fixieren. Wenn Oktober Verbindungen verwendet werden, ein Mini-Fehlmenge von OCT angewandt werden und darauf zu achten, dass die geschnittenen Gewebeabschnitte nicht OCT-Verbindungen, die mit Ionisation und Detektion der Analyten stören können 5,36,37 kontaminiert werden. </li><li> Damit die Temperatur im Inneren des Kryostaten auf -18 ° C äquilibriert Wärmer oder kälter Temperaturen können für weichere oder härtere Gewebe verwendet werden, beziehungsweise. Dann schneiden Sie das Gewebe äquatorial in 20 um dicke Scheiben schneiden. Verwenden Sie 10-15 um dicke Scheiben für die meisten Gewebe, aber wegen der fragilen Natur der Rinderlinsengewebe wurden 20 um dicke Scheiben eingesetzt. Für Rinderlinsengewebe, entsorgen Sie die erste Gewebeschnitten und nur Scheiben, die in der Nähe oder an der Äquatorialebene sind. </li><li> Wenn eine Augenlinse Gewebe abgebildet wird, verwenden 1,5 ul Ameisensäure (98% Reinheit, LC-MS-Klasse), um die Oberfläche einer Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichteten Glasträger vorbefeuchtet. </li><li> Die Gewebeschnitte auf der Oberfläche der ITO-co vorsichtig übertragenATED Glasobjektträger im Inneren des Kryostaten. Der Gewebeschnitt wird schnell auftauen und wird fest befestigt, um die Gleitfläche zu werden. Normalerweise können mehrere Gewebeabschnitte auf derselben ITO-beschichtete Objektträger auf diese Weise befestigt werden. </li><li> Lyophilisieren die Folie für 15 Minuten vor der MALDI-Matrix-Anwendung. </li><li> Für Matrix-Tests, lösen die einzelnen Matrizen in geeigneten Lösungsmitteln. Manuell vor Ort 1 ul jeder Matrix-Lösung auf den Gewebeschnitt. Darüber hinaus, vor Ort eine kleine Moleküle Kalibrierungsstandard auf das Gewebe für die Überprüfung der MALDI-Empfindlichkeit. </li><li> Three Lehre Markierungen auf der ITO-beschichteten Glasobjektträger, indem er auf der nicht leitenden Oberfläche der ITO-beschichteten Glasobjektträger mit einem Korrekturfluid-Stift. Nehmen Sie ein optisches Bild des Gewebes Folie mit einem Flachbettscanner und speichern Sie sie in einem geeigneten Format wie TIFF oder JPG. </li></ol> 2. Matrixbeschichtungs 2.1. Automated Coating Matrix <ol><li> ApLagenmatrixlösungen, die Acetonitril oder gemischten Acetonitril / Wasser als Lösungsmittel enthalten, automatisch an den Oberflächen der Gewebeabschnitte mit einem Bruker ImagePrep oder eine ähnliche elektronische Matrix Spritzen. </li><li> Abdeckung der Kanten der vorderen Oberfläche des ITO-beschichteten Glasobjektträger mit Band so, dass die Matrix nicht bedeckt die Ränder der Folie. Dies stellt sicher, dass die Lehre Markierungen auf der gegenüberliegenden Oberfläche für Gewebe Schieber Ausrichtung verwendet werden. Decken Sie die Ränder der Folie mit der Matrix, wie sie als Kontaktstellen verwendet werden, um die elektrische Leitfähigkeit der ITO-beschichtete Folie erhalten. </li><li> Coat Glasrutsche, indem zwanzig Zyklen der Matrixbeschichtung (2-sec-Spray, 30-sec Inkubation und 60-sec Trockenzeit pro Zyklus). </li></ol> 2.2. Manuelle Matrix-Beschichtung <ol><li> Werden organische Lösungsmittel (z. B. Chloroform und Ethylacetat), die mit den Herstellungsmaterialien der elektronischen Matrixspritzen unvereinbar sind Erforrot, mit einem pneumatisch unterstützten Airbrush-Spritzgerät, um die Matrix anzuwenden. In die vorbereitete Matrix-Lösung auf den Lösungsmittelbehälter der Airbrush-Pistole und eine milde Strömung von Druckstickstoffgas auf der Haupt Spray. </li><li> Abdeckung der Kanten der vorderen Oberfläche der ITO-beschichteten Glasobjektträger mit Band so, dass die Matrix nicht bedeckt die Ränder der Folie. Dies stellt sicher, dass die Lehre Markierungen auf der gegenüberliegenden Oberfläche für Gewebe Schieber Ausrichtung verwendet werden. Decken Sie die Ränder der Folie mit der Matrix, wie sie als Kontaktstellen verwendet werden, um die elektrische Leitfähigkeit der ITO-beschichtete Folie erhalten. </li><li> Nach stabil und feinen Sprays eingehalten worden, manuell sprühen die Matrix, so dass es völlig Mäntel die Gewebeschnitt. Den minimalen Menge erforderlich, um gerade die Oberfläche zu benetzen, um während jedes Zyklus möglich Analyten Delokalisierung verhindern Matrixlösung. Im Allgemeinen verwenden ungefähr 10 Zyklen der Matrix zu beschichten, Spray ein Gewebeschnitt, die Anzahl der Zyklen istabhängig vom Gewebetyp und Matrixzusammensetzung. </li></ol> 3. MALDI-MS <ol><li> Bereiten Sie eine Massenkalibrierungslösung durch Verdünnen der &quot;ES-Tuning Mix&quot; Standardlösung mit einem Faktor von 1:200 in 60:40 Isopropanol: Wasser (mit 0,1% Ameisensäure in der fertigen Mischung). </li><li> Einführen 2 ul / min des verdünnten &quot;ES Tuning Mix&quot;-Lösung in die Dual-Mode-Elektrospray-Ionisation (ESI) / MALDI-Ionenquelle auf der FTICR-Massenspektrometer vom ESI Seite. </li><li> Bedienung des FTICR Instrument im Positiv-Ionen-ESI-Modus, mit Breitband-Erkennung und eine Datenerfassungsgröße von 1,024 kb / sec. Typische Parameter sind ESI Elektrospray-Kapillare Spannung 3.900 V; sprühen Schild Spannung 3.600 V; Vernebler Gas (N 2) Fluss, 2 L / min; Trockengas (N 2) Durchfluss und Temperatur, 4 L / min und 200 ° C; Skimmer-1-Spannung, 15 V; Flugzeit (TOF), 0,009 sec; Kollisionsgas (Ar) fließen, 0,4 l / s, Quelle Ionenakkumulation Zeit 0,1 sec;und Kollisionszelle Ionenakkumulationszeit 0,2 sek. Stimmen Sie die FTICR Betriebsparameter, um die analytische Sensitivität über den Massenbereich von m / z 200 auf 1.400 steigern und gleichzeitig gute Zeit-Domain kostenlos-Induktionszerfall (FID)-Signale. Typischerweise sind die ICR Betriebsparameter Kumpel Spannung, 8 V; Sidekick-Offset-Spannung, 8 V; Anregung Verstärkung von 10; Anregungspulszeit, 0,01 bis 0,015 sec; Frontplatte Falle Spannung, 1,5 V; zurück Falle Plattenspannung, 1,6 V und Analysator Eingangsspannung, -4 V. Nach einer Reihe von FTICR Betriebsparameter bestimmt worden ist, erwerben die ESI-Massenspektren und kalibrieren Sie das Gerät unter Verwendung der Bezugsmassen der Standardverbindungen in der &quot;ES-Tuning Mix&quot;-Lösung. </li><li> Stimmen des Instruments für die MALDI-Betrieb löst mehrere 1 ul Aliquots eines gemischten Terfenadin und Reserpin-Standardlösung in der Matrix-Lösung bei einer Konzentration von 1 &amp;mgr; M von jedem, und erkennen diese Lösungen direkt auf eine der tissue Abschnitte (dh ein Test Gewebeschnitt), die auf einer ITO-beschichteten Objektträger montiert worden ist. Legen Sie die ITO-beschichtete Folie in ein Gewebe Schiebeadapter (dh eine spezielle MALDI-Target) und laden Sie den Adapter aus der MALDI-Seite in die Dual-ESI / MALDI-Ionenquelle. Optimierung der geeigneten MALDI Betriebsparameter der Laserleistung und der Anzahl der Laserschüsse für MALDI-Signal Akkumulation für jeden Massenscan usw. MALDI Typische Betriebsparameter sind: Laserschüsse, 50 und eine MALDI-Platte Spannung von 300 V. </li><li> Nach dem Tuning, Kalibrierung und Optimierung der Instrument für die MALDI-MSI-Experimente, richten Sie den physischen Standort von einem Gewebeschnitt mit seinen aufgezeichneten optischen Bild innerhalb der Imaging-Software abgebildet werden. Mit den drei &quot;Korrektur-Fluid&quot; Marken, die vorher auf der gegenüberliegenden Seite der ITO-beschichteten Gleitfläche (Schritt 1.9) gesetzt worden war, für diese Ausrichtung unter Verwendung eines Dreipunkt-Triangulationsverfahren. </li><li> Führen Sie eine gleichzeitige ESI und MALDI Betrieb, so dass jede Massenspektrum enthält die Referenzmasse Gipfel der &quot;ES Tuning Mix&quot;-Lösung für Post-Akquisition-interne Massenkalibrierung. Dies wird in der genauesten Massenmessung während der MALDI-MS führen. Um dies zu tun, zuerst der ESI-Signal abzuschwächen durch die Verringerung der Kapillare Spannung, bis die MALDI-Signale dominieren die Spektren während die ESI Eichsignale sind immer noch hoch genug für interne Massenkalibrierung. </li><li> Danach können Sie einen automatisierten Rasterverfahren für Laserbestrahlung. Die Gewebebereiche definieren, die abgebildet werden, und legen Sie die entsprechende Laserrasterschrittweite. Beachten Sie, dass kleinere Rasterschrittweiten bieten eine höhere Auflösung Gewebebilder, erfordern aber eine deutlich längere Massenspektrenerfassung Zeit und mehr Datenspeicherplatz. Die Anzahl der Bildpunkte ist abhängig von der Laserrasterschrittgröße einzurichten und das Gewebe Größe. Für ein typisches Rinderlinse, die eine 1 cm 2-Gewebegröße hat, wird ein Gewebebild typischerweise von ca. zusammensetzt. </em&gt; 5.000 Pixel, wenn ein Laserrasterschrittweite von 200 um auf einer FT-ICR Instrument eingesetzt. Verwenden Sie ein &quot;random-Spot&quot;-Analyse, wie dies verhindert, dass Standort-basierte Verzerrung durch allmähliche Signaldämpfung während des Experiments. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Kalibrieren Sie den MALDI-Massenspektren mit interner Kalibrierung für den ersten Vergleich und Spitzen für MS / MS zu wählen. De-Isotop und wählen Sie die monoisotopischen Spitzen, wie zuvor beschrieben, mit Hilfe einer angepassten VBA-Skript 38. </li><li> Exportieren Sie die resultierende monoisotopischen Peaklisten und Eingabe die gemessenen m / z-Werte in die METLIN 39 und / oder 40 HMDB Metabolom-Datenbanken für Massenabgleich mit den Bibliothekseinträgen. Betrachten Sie die (M + H) +, (M + Na) + und (M + K) +-Ionen während der Datenbank-Suche, mit einem zulässigen Massenfehler von ± 1 ppm. </li><li> Generieren MALDI Bilder für alle der über die gesamte Gewebeschnitt mit imag erkannt Lipid UnternehmenE-Analyse-Software, mit einem Massenfilter Breite von 1 ppm an der Peakspitze. </li><li> Sobald Bilder wurden für alle m / z-Werte, die Datenbank-Einträge entsprechen generiert wurde, erzeugen Bilder für alle anderen Spitzen als auch für einzigartige Verteilungsmuster, die später untersucht werden können suchen. </li></ol> 5. Bestätigung der Identitäten der abgebildeten Lipide <ol><li> Bestätigen Sie die Identität der Hoch Fülle Lipide, die charakteristische Fragment-Ionen, die mit Hilfe der FT-ICR Gerät (zB 184,073 für Phospholipide) festgestellt werden können, durch MALDI-MS/MS haben. Führen MALDI-MS/MS mit stoßinduzierte Dissoziation (CID) direkt auf das Gewebe. </li><li> Für die Lipidarten, die nicht direkt von MALDI-MS/MS bestätigt werden können, verwenden Sie eine UPLC System zu einem q-TOF-Massenspektrometer 34 gekoppelt. <ol><li> Manuell sezieren Aliquots enthaltend ~ 10 mg Gewebe aus dem Bereich, in dem die Spezies von Interesse lokalisiert wurde. Legen Sie diese Gewebe Aliquots in 2ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Homogenisieren jedes Gewebe Aliquot in 250 ul Wasser, mit einer Schwingmühle mit zwei 5-mm-Edelstahlmetallkugeln. </li><li> 1 ml Chloroform-Methanol-Lösung (1:3, v / v), und die Wirbelrohre. Als nächstes zentrifugieren Verwendung einer Mikrozentrifuge bei 12.000 × g für 10 min. </li><li> Sammeln Sie die Überstände und trocknen Sie sie in einer Drehzahl-Vakuum-Konzentrator. </li><li> Lösen Sie die Rückstände in 100 ul 30:70 Isopropanol: Wasser. Speisen Sie einen 10-ul-Aliquot auf die UPLC-Säule für die Trennung mittels Gradientenelution. </li><li> Verwenden Sie die chromatographischen Bedingungen für Online-Lipid LC-MS/MS, die bisher 34 erschienen sind. </li><li> Generieren Sie extrahierten Ionenstrom (XIC) Chromatogramme mit den theoretischen m / z-Werte, mit einem Fenster von ± 50 ppm um den theoretischen Massen. </li><li> Wenn authentischen Verbindungen für die Lipide sind, entsprechen den Retentionszeiten der authentischen Verbindungen mit denen der entsprechendenchenden XIC Spitzen aus den Gewebeproben. Wenn die Verbindungen die gleichen sind, sollten die Retentionszeiten und die MS / MS-Spektren überein. </li></ol></li><li> Wenn eine authentische Verbindung nicht verfügbar ist, verwenden Sie den Fragmentierungsmuster der detektierten Lipid einen Standard MS / MS-Spektrum aus einer Metabolom Datenbank wie METLIN oder HMDB entsprechen. Verwenden de novo spektrale Massen Interpretation, um eine mögliche Struktur für die Lipid bestimmen. </li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die wichtigsten Überlegungen für eine erfolgreiche MALDI MSI sind: 1) Gewebepräparation, 2)-Matrix Wahl, 3)-Matrix-Anwendung, und 4) die Interpretation der Daten und Analysen. Wenn die Probe und die Matrix in geeigneter Weise hergestellt wurde, wird die MS-Datenerfassung automatisiert. Die Analyse der Daten aus dieser Art von Test ist sehr arbeitsintensiv. Entsprechende Gewebeaufbereitung ist entscheidend für eine erfolgreiche MALDI MSI Experimenten. Die Quelle des Gewebes und die Handhabung...

Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) ist ein Analyseverfahren zur Bestimmung der räumlichen Lokalisierung und Verteilung der Verbindungen auf der Oberfläche eines Gewebeschnitts 1,2. Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation (MALDI) MSI für die Analyse von Peptiden und Proteinen ist seit über zehn Jahren verwendet worden und es wurden große Fortschritte bei Verfahren zur Probenvorbereitung, Nachweisempfindlichkeit, räumliche Auflösung, Reproduzierbarkeit und Datenverarbeitung 3,4. Durch die Kombination von Informationen aus histologisch gefärbten Schnitten und MSI Experimente sind Pathologen in der Lage, die Verteilungen von spezifischen Verbindungen mit pathophysiologisch interessanten Features 5 korrelieren. Die Verteilungsmuster von kleinen Molekülen, einschließlich 6,7 exogene Drogen und deren Metaboliten 8-10 wurden auch durch MALDI-MS Tissue Imaging 11 verhört worden. Lipide sind vielleicht die am weitesten untersuchten class von Verbindungen mit MALDI-Bildgebung sowohl in den 12-17 MS und MS / MS-18-Modus. Die Verwendung von MALDI MSI für kleine Molekül Bildgebung durch mehrere Faktoren begrenzt: 1) MALDI-Matrizes sind selbst kleine Moleküle (typischerweise m / z &lt;500), die reichlich Ionensignale zu erzeugen. Diese reichlich Signale der Ionisation von niedermolekularen Analyten zu unterdrücken und stören ihre Detektion 19,20. Lösemittelfreie Matrix-Beschichtung 21, Matrix Sublimation 22 und Matrix schwemmt MALDI-MS-23, unter anderem, wurden entwickelt, um MSI kleiner Moleküle zu verbessern. New Matrizen, die die Analyse von Low-MW-Verbindungen verbessern können, sind von großem Interesse in kleinen Molekülen MSI. Diese Matrizen erhöht Analyten Signale mit verminderter Matrix Signale zu liefern. Im positiven Ionenmodus, 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA) sind die beiden häufigsten verwendeten MALDI MS Matrizen für MSI 24 </sup&gt;. Die ideale Matrix würde kleine Kristalle bilden, um so die räumliche Lokalisierung der Analyten zu erhalten. DHB eher größere Kristalle zu bilden, damit die Anwendung der Matrix mittels Sublimation wurde entwickelt, um dieses Problem teilweise zu lösen, und hat die Verwendung dieser Matrix für empfindliche Abbildungs ​​von Phospholipiden 22,25 erlaubt. 9-Aminoacridin für MSI protischer Analyten in der Positiv-Ionen-Modus 26 und für Nucleotide und Phospholipiden im Negativionen-Modus 26-29 verwendet. 2-Mercaptobenzothiazol ist gefunden worden, um eine effiziente Detektion von Lipiden MALDI 30 zu geben, und ist für die Abbildung des Gehirns der Maus 31 Ganglioside verwendet. Die Ultrahochauflösung von Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz (FT-ICR)-Massenspektrometer kann etwas Linderung dieses Problems durch die Lösung Signale von Analyt-Matrix-Signale 32 auf. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von FT-ICR-MS, dass die Intensitäten der metastabilen Matrix Cluster ReduktionED-33, das ebenfalls eine Verringerung dieser Störungen 27. Die Verwendung von Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung zuvor berichtet worden 34. In dieser aktuellen Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DT für das MSI von endogenen Lipiden auf den Oberflächen der Rinderlinse Gewebeabschnitte versehen ist, in dem Positiv-Ionen-Modus.

<table><tbody><tr><td>Rattenleber</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56023-2</td><td></td></tr><tr><td>Rinderkalbslinse</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>57114-2</td><td>Die Probe sollte vor Gebrauch entkapselt werden29</td></tr><tr><td>Dithranol (DT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10608</td><td>MALDI-Matrix</td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxy-zimtsäure (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70990</td><td>MALDI-Matrix</td></tr><tr><td>2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td>MALDI Matrix</td></tr><tr><td>Reserpin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td><td></td></tr><tr><td>Terfenadin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9652</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumformiat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14266</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>320145</tr><tr><td>Trifluoressigsäure (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34972</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Kommerzielle Alkohole</td><td></td><td>95%</td></tr><tr><td>ES Tuning Mix</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2431A</td><td></td></tr><tr><td>ITO Beschichtete Glasobjektträger</td><td>Hudson Surface Technology</td><td>PSI1207000</td><td>Stellen Sie sicher, dass die Proben auf der elektrisch leitfähigen Seite platziert</td></tr> werden <tr><td>Ohne Shake-N-Squeeze-Korrekturstift</td><td>Bic</td><td>WOSQP11</td><td></td></tr><tr><td>Airbrush-Sprühgerät</td><td>Iwata</td><td>Eclipse HP-CS</td><td></td></tr><tr><td>ImagePrep</td><td>Bruker</td><td>249500-LS</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Adapter</td><td>Bruker</td><td>235380</td><td></td></tr></tbody></table>

dithranol als matrix für matrix assisted laser desorption / ionisation imaging auf einem fourier-transformations-ionen-zyklotron-resonanz-massenspektrometer

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) bestimmt die räumliche Lokalisierung und Verteilung der Verbindungen auf der Oberfläche eines Gewebeschnittes, vor allem unter Verwendung von MALDI (Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation)-basierten analytischen Techniken. Neue Matrizen für niedermolekulare MSI, was die Analyse von niedrigem Molekulargewicht (MW)-Verbindungen verbessern können, sind erforderlich. Diese Matrizen erhöht Analyten Signale liefern, während abnehm MALDI Hintergrundsignale. Darüber hinaus ist die Verwendung von ultrahochauflösenden Instrumente, wie Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz (FT-ICR)-Massenspektrometer, hat die Fähigkeit, Signale von Analyten Matrixsignale beheben, und dies kann teilweise viele Probleme mit dem Hintergrund der MALDI Ursprung überwinden Matrix. Die Verringerung der Intensitäten der metastabilen Matrix-Clustern durch FT-ICR MS kann auch helfen, einige der Interferenzen mit Matrixspitzen auf andere Instrumente zu überwinden. Hochauflösendesind Instrumente wie die FT-ICR-Massenspektrometer vorteilhaft, da sie Verteilungsmuster von vielen Verbindungen gleichzeitig herstellen kann, während immer noch Vertrauen in chemische Identifikationen. Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung gemeldet. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Verwendung von DT für MALDI-Imaging von endogenen Lipiden aus den Oberflächen von Säugergewebeschnitte, von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Hybrid-Quadrupol-FTICR Instrument bereitgestellt wurde.

<html> Gewebeproben, die geschnitten werden und Tauwetter montiert auf die ITO-beschichtete Glasobjektträger sollte intakt sein, ohne sichtbare Reißen. Für viele Gewebe, ist die direkte Montage auf Tauwetter Gewebe einer ITO-beschichteten Objektträger akzeptabel. Für einige spezifische Gewebe, wie Rinder Linse, umfangreiche Reißen des Gewebes oft gesehen, wenn eine direkte Tauwetter Montage verwendet wird (Abbildung 1a). Vorbeschichtung der ITO-Glasobjektträger mit Ethanol oder Ameisensäure (Fig....

Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung für kleine Moleküle berichtet wurde, Protokolle für die Verwendung von DT für die MALDI-Imaging von endogenen Lipiden auf die Hier werden Oberflächen von Gewebeschnitten von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Quadrupol-FTICR Instrument zur Verfügung gestellt.

Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Dieses Verfahren lokalisiert mehrere endogene Lipide räumlich innerhalb einer Rinderlinse. Unter Verwendung der Technik der matrixunterstützten laserdesorptiven Ionisierung wird eine Massenspektrometrie-Bildgebung durchgeführt. Zunächst wird ein dünner Gewebeschnitt der Rinderlinse präpariert und mit einer Multimatrix beschichtet, anschließend wird ein MALDI-Massenspektrometrie-Datensatz aufgenommen.Verarbeiten Sie den Datensatz zu einer visuellen Darstellung der nachgewiesenen Lipide im Linsengewebeschnitt. Zusammen können diese Ergebnisse die Lokalisation und relative Häufigkeit der Lipide in einer bovinen Linse bestimmen und eine visuelle Darstellung dieser Verteilung erzeugen. Im Vergleich zu anderen Methoden wie der Lipidextraktion gefolgt von LC-MS-Analyse ermöglicht die MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Lipide, ohne deren räumliche Lokalisation zu verlieren. Entnehmen Sie die flashgefrorenen Gewebeproben der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.Entfernen Sie die Kapsel von der Oberfläche der Linse, um einen gesamten Abschnitt einer Rinderkälberlinse zu fixieren. Geben Sie ein oder zwei Tropfen Wasser auf die Gewebeschnittplatte eines Kryostaten. Platzieren Sie die Linse schnell in das Wasser, bevor es erstarrt, sobald der Kryostat die optimale Temperatur erreicht hat.Schneiden Sie das Gewebe äquatorial in Schnitte mit einer Dicke von 20 Mikrometer. Entsorgen Sie die ersten Gewebeschnitte und verwenden Sie nur Schnitte, die nahe an oder in der Äquatorialebene liegen, zur Abbildung des Augenlinsengewebes. Geben Sie 1,5 Mikroliter Ameisensäure hinzu, um die Oberfläche eines ITO-beschichteten Objektträgers vorzuwetten.Überführen Sie die Gewebeschnitte dann vorsichtig auf den Objektträger innerhalb des Kryostaten. Anschließend lyophilisieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang, bevor die MALDI-Matrix aufgetragen wird. Tragen Sie mit einem Korrekturflüssigkeitsstift drei Orientierungsmarkierungen auf die nichtleitende Oberfläche des ITO-beschichteten Glasobjektträgers auf.Nun nehmen Sie ein optisches Bild des Gewebeschnitts mit einem Flachbettscanner auf und speichern Sie es in einem geeigneten Format wie TIFF oder JPEG. Bedecken Sie zunächst die Kanten auf der Vorderseite der mit ITO beschichteten Objektträger mit Klebeband, damit die Matrix nicht auf die Kanten des Objektträgers aufgetragen wird. Bereiten Sie die Matrix in einem geeigneten Lösungsmittel vor.Tragen Sie anschließend Matrixlösungen auf die Oberflächen der Gewebeschnitte auf. Beschichten Sie den Objektträger durch 20 Beschichtungszyklen mit der Matrix. Alternativ kann ein pneumatisch betriebener Airbrush-Sprüher verwendet werden, um die Matrizes aufzutragen, falls ein Lösungsmittel mit dem elektronischen Matrix-Sprüher nicht kompatibel ist.Für die Massenkalibrierungslösung verdünnen Sie die Standardlösung des ES-Abgleichgemischs im Verhältnis 1 zu 200 in 60 % Isopropanol. Leiten Sie zwei Mikroliter pro Minute der verdünnten ES-Abgleichgemischlösung in die Dualmodus-Elektrospray-Ionisations-Ionenquelle am Gerät für eine Fourier-Transform-Ion-Cyclotron-Resonanz-Massenspektrometrie ein. Betreiben Sie das FT-ICR-Gerät im positiven Ionen-ESI-Modus mit Breitbanddetektion und einer Datenerfassungsgröße von 1024 Kilobyte pro Sekunde. Stellen Sie typischerweise die ESI-Parameter auf 3.900 Volt Kapillar-Elektrospray-Spannung ein.Eine Spray-Shield-Spannung von 3.600 Volt, Nebulisierungs-Stickstoffgasfluss bei zwei Litern pro Minute. Trockener Stickstoffgasfluss bei vier Litern pro Minute und einer Temperatur von 200 Grad Celsius. Stellen Sie außerdem die Skimmer-Einspannung auf 15 Volt ein.Flugzeit auf 0,01 Sekunden, Argon-Kollisionsgasfluss auf 0,4 Liter pro Sekunde, Ionenanreicherungszeit in der Quelle auf 0,1 Sekunde und Ionenanreicherungszeit in der Kollisionszelle auf 0,2 Sekunden einstellen. Anschließend die F-T-I-C-R-Betriebsparameter optimieren, um die analytische Empfindlichkeit im Massenbereich von m/z 200 bis 1400 zu maximieren, wobei gleichzeitig gute zeitdomänige Free-Induction-Decay-Signale erhalten bleiben sollen. Danach die ESI-Massenspektren aufnehmen und das Gerät unter Verwendung der Referenzmassen der Standardverbindungen in der E es-Abstimmungs-Mischlösung kalibrieren.Um das Instrument für den MALDI-Betrieb einzustellen, lösen Sie mehrere Aliquots zu je einem Mikroliter einer gemischten Turin- und INE-Standardlösung in der Matrixlösung bei einer Konzentration von jeweils einem Mikromolar auf und pipettieren Sie diese Lösungen direkt auf einen der Gewebeprobenabschnitte. Legen Sie den Objektträger in einen Gewebe-Objektträger-Adapter und laden Sie den Adapter von der MALDI-Seite in die duale ESI-MALDI-Ionenquelle ein. Anschließend optimieren Sie die geeigneten MALDI-Betriebsparameter für die Laserleistung und die Anzahl der Laserimpulse zur MALDI-Signalerfassung für jeden Massenscan.Nach der Abstimmung, Kalibrierung und Optimierung des Instruments für MALDI-MSI-Experimente muss die physische Position eines zu bildgebenden Gewebeschnitts mit dem entsprechenden aufgezeichneten optischen Bild innerhalb der Bildgebungssoftware ausgerichtet werden. Richten Sie die drei Korrekturflüssigkeitsmarkierungen mithilfe einer Dreipunkt-Triangulationsmethode aus. Starten Sie anschließend einen simultanen ESI-MALDI-Betrieb, sodass jedes Massenspektrum die Referenzmassenpeaks der ESI-Tuning-Mix-Lösung für die interne Massenkalibrierung nach der Datenaufnahme enthält.Dämpfen Sie zunächst das ESI-Signal, indem Sie die Kapillarspannung so weit verringern, bis die MALDI-Signale die Spektren dominieren, während die ESI-Kalibriersignale noch ausreichend hoch für eine interne Massenkalibrierung sind. Richten Sie danach eine automatisierte Methode zur schrittweisen Erhöhung der Laserstrahlung ein. Verwenden Sie eine zufällige Spot-Analyse.Definieren Sie die zu bildgebenden Geweberegionen und stellen Sie die geeignete Schrittgröße für die Laser-RA ein. Kalibrieren Sie die MALDI-Massenspektren mittels interner Kalibrierung für den initialen Vergleich und zur Auswahl von Peaks für die MS/MS-Deisotopierung, und wählen Sie die monoisotopen Peaks mithilfe eines angepassten VBA-Skripts aus. Exportieren Sie die resultierenden Listen der monoisotopen Peaks. Geben Sie die gemessenen Werte des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses in die Melin-nine- und/oder die HMDB-Metabolom-Datenbanken ein, um eine Massenabgleichung mit den Bibliothekseinträgen durchzuführen.Als Nächstes erzeugen Sie MALDI-Bilder für alle Lipidentitäten, die über den gesamten Gewebeschnitt hinweg detektiert wurden, unter Verwendung einer Bildgebungssoftware mit einer Massenfilterbreite von einem Teil pro Million am Peak-Apex. Sobald Bilder für alle Masse-zu-Ladung-Verhältniswerte generiert wurden, die mit Datenbankeinträgen übereinstimmen, erzeugen Sie zusätzlich Bilder für alle anderen Peaks, um einzigartige Verteilungsmuster zu identifizieren, die später für bestimmte Gewebe, wie beispielsweise die Rinderlinse, näher untersucht werden können. Umfangreiche Geweberisse werden häufig beobachtet, wenn die direkte Auftaumontage verwendet wird.Die Vorbehandlung des IT-OAS-Objektträgers mit Ethanol oder Ameisensäure trägt dazu bei, die Integrität der Gewebeschnitte während der Gewebemontage zu bewahren. Sowohl die Wahl der Matrix als auch die Auswahl des Lösungsmittels sind wichtige Faktoren, die die Qualität der MALDI-Spektren beeinflussen. Diese Beispiele vergleichen ein Spektrum, das mit einem effizienten Matrixlösungsmittel erzeugt wurde, mit einer ungeeigneten Wahl des Matrixlösungsmittels für Diol.Nachdem der Satz von Massenspektren aus einem Maldi-MSI-Experiment erfasst wurde, kann das Bild für jedes der detektierten Ionen generiert werden, wobei jedes Pixel einen Laserbestrahlungspunkt von der Oberfläche eines Gewebeschnitts darstellt. Die relativen Konzentrationen der Analyten können in den verschiedenen Bereichen des Gewebeschnitts detailliert dargestellt werden.Bei den meisten Experimenten wird die Daten auf den Gesamtionenstrom innerhalb jedes Spektrums normalisiert. Ohne diese Normalisierung könnten Bereiche mit besserer Analyt-Matrix aufgrund der COC-Kristallisation stärkere Signale für die Analyten erzeugen, was die Daten verfälschen würde. Auch die Gewebepräparation kann das erzeugte Bild erheblich verändern.Wenn die Probe zu feucht ist, werden die Analyten sich im Gewebe verteilen und ein Großteil der räumlichen Information geht verloren. Diese Demonstration eines Gewebeimaging-Experiments an der Augenlinse verwendete Diol als Multi-Matrixx, um die räumliche Verteilung von Lipiden mittels F-T-I-C-R-M-S zu bestimmen. Die Abbildung von Lipiden in verschiedenen Gewebetypen kann auf ähnliche Weise unter Verwendung von Diol oder einer anderen Matrix erreicht werden.

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Biologie

Genaue Massenmessung stellt einen wichtigen Schritt bei der Untersuchung von Proteinen. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) für eine solche Bestimmung verwendet werden, und deren wesentliche Vorteil ist die Toleranz zu Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen. Hier veranschaulichen wir eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

Ein Protokoll für die Sublimation der DAN-Matrix auf Rattenhirngewebe zum Nachweis von Gangliosiden mittels MALDI Imaging Massenspektrometrie wird vorgestellt.

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

Ein Protokoll für die Matrix-assisted Laser Desorption ionisation Zeit des Fluges, die Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) Charakterisierung von synthetischen Polymeren beschrieben wird unter anderem die Optimierung der Probenvorbereitung, spektrale Beschaffung und Analyse von Daten.

Charakterisierung von synthetischen Polymeren Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF)

Molekularer Bildgebung mit der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-basierte bildgebende Massenspektrometrie (MALDI-IMS) erlaubt die gleichzeitige Zuordnung von mehreren Analyten in biologischen Proben. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erfassung und Visualisierung von Amyloid β Protein Hirngewebe von Alzheimer-Krankheit und zerebralen Amyloid-Angiopathie Proben mit MALDI-IMS.

Visualisierung von Amyloid-β-Einlagen in das menschliche Gehirn mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung bildgebende Massenspektrometrie

Ein Protokoll für die Verbesserung der Kohlenhydrat Ionen-Signale in der MALDI-Massenspektrometrie durch Reform kristallinen Strukturen während der Probe Herstellungsverfahren wird demonstriert.

Eine effiziente Vorbereitung Beispielmethode Kohlenhydrat Ionen-Signale in der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie verbessern

Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur richtigen Probenvorbereitung für die Lipid- und Metabolitenanalyse in kleinen Geweben wie dem Drosophila-Gehirn unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie bereitzustellen.

Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung

Eine neuartige Probenvorbereitungsmethode wird für die Analyse von agarbasierten, bakteriellen Makrokolonien mittels matrixunterstützter Laserdesorptions-/Ionisationsbildgebungs-Massenspektrometrie demonstriert.

Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gezüchtet wurden

Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen und Beispiele für die Probenvorbereitung, Datenerfassung und Datenanalyse zur Charakterisierung synthetischer Polymere mit unterschiedlicher Dispersion und Endgruppen unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie.

MALDI-ToF MS-Methode zur Charakterisierung von synthetischen Polymeren mit unterschiedlicher Dispersität und Endgruppen

Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

Genetische Studien in Hefe kann eingesetzt werden, um die molekularen und zellulären Funktionen der menschlichen Gene in Zellen DNA-Stoffwechsel zu untersuchen. Es werden Methoden für die genetische Charakterisierung des menschlichen...

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Erfahren Sie die MALDI-Imaging-Methode mit Dithranol zur räumlichen Analyse endogener Lipide in Rinderlinsengewebe. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Lipide ohne Verlust ihrer räumlichen Information.

Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer (Video) | JoVE Journal

Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

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