Molekulare Klonierung

Molekulares Klonen ist eine Reihe von Techniken, die verwendet werden, um rekombinante DNA aus einer prokaryotischen oder eukaryotischen Quelle in ein replizierendes Vehikel wie Plasmide oder virale Vektoren einzufügen. Klonierung bezieht sich auf die Herstellung zahlreicher Kopien eines DNA-Fragments von Interesse, wie z. B. eines Gens. In diesem Video erfahren Sie mehr über die verschiedenen Schritte des molekularen Klonens, wie Sie das Verfahren einrichten und welche Anwendungen diese Technik bietet.

Mindestens zwei wichtige DNA-Moleküle sind erforderlich, bevor die Klonierung beginnt. Zuerst und vor allem benötigen Sie das DNA-Fragment, das Sie klonen möchten, auch bekannt als Insert. Es kann von einem Prokaryoten, Eukaryoten, einem ausgestorbenen Organismus stammen oder es kann künstlich im Labor hergestellt werden. Durch den Einsatz von molekularem Klonen können wir mehr über die Funktion eines bestimmten Gens erfahren.

Zweitens benötigen Sie einen Vektor. Ein Vektor ist Plasmid-DNA, die in der Molekularbiologie als Werkzeug verwendet wird, um mehr Kopien eines bestimmten Gens herzustellen oder ein Protein daraus herzustellen. Plasmide sind ein Beispiel für einen Vektor und sind zirkuläre, extra chromosomale DNA, die von Bakterien repliziert wird.

Ein Plasmid weist typischerweise eine multiple Klonierungsstelle oder MCS auf, dieser Bereich enthält Erkennungsstellen für verschiedene Restriktionsendonukleasen, die auch als Restriktionsenzyme bekannt sind. Verschiedene Inserts können durch eine Technik namens Ligation in das Plasmid eingebaut werden. Der Plasmidvektor enthält auch einen Replikationsursprung, der es ermöglicht, ihn in Bakterien zu replizieren. Darüber hinaus besitzt das Plasmid ein antibiotisches Gen. Wenn Bakterien das Plasmid einbauen, überlebt es in Medien, die das Antibiotikum enthalten. Dies ermöglicht die Selektion von Bakterien, die erfolgreich transformiert wurden.

Das Insert und der Vektor werden in einen Wirtszellorganismus kloniert, die gebräuchlichste bei der molekularen Klonierung wird E. coli verwendet. E. coli wächst schnell, ist weit verbreitet und hat zahlreiche verschiedene Klonierungsvektoren, die kommerziell hergestellt werden. Eukaryoten können wie Hefe auch als Wirtsorganismen für Vektoren verwendet werden.

Der erste Schritt des allgemeinen molekularen Klonierungsverfahrens besteht darin, das gewünschte Insert zu erhalten, das aus DNA oder mRNA eines beliebigen Zelltyps gewonnen werden kann. Der optimale Vektor und sein Wirtsorganismus werden dann ausgewählt, basierend auf der Art des Inserts und dem, was letztendlich damit gemacht wird. Eine Polymerase-Kettenreaktion oder PCR-basierte Methode wird häufig verwendet, um das Insert zu replizieren.

Dann werden durch eine Reihe von enzymatischen Reaktionen das Insert und der Verdau miteinander verbunden und zur Massenreplikation in den Wirtsorganismus eingeführt. Replizierte Vektoren werden von Bakterien gereinigt und nach dem Restriktionsverdau auf einem Gel analysiert. Gelgereinigte Fragmente werden später zur Sequenzierung geschickt, um zu überprüfen, ob es sich bei dem Einsatz um das gewünschte DNA-Fragment handelt.

Werfen wir einen etwas genaueren Blick darauf, wie die molekulare Klonierung durchgeführt wird. Bevor Sie beginnen, sollten Sie Ihre Klonierungsstrategie planen, bevor Sie einen Klonversuch auf der Bank unternehmen. Zum Beispiel bietet Ihnen jeder gegebene Plasmidvektor eine endliche Anzahl von Restriktionsstellen, um das Insert über die multiple Klonierungsstelle zu integrieren. Sie müssen Einschränkungsseiten auswählen, die nicht in Ihrer Einlage enthalten sind, damit Sie sie nicht spalten. Es kann sein, dass Sie in eine Situation geraten, in der Sie gezwungen sind, ein stumpfes Endfragment mit einem Fragment zu verbinden, das einen Überhang hat. Wenn ja, dann ist die Verwendung des Klenow-Fragments zum Einrichten einer stumpfen Endligation möglicherweise die einzige Möglichkeit, das Insert in den gewünschten Vektor zu bekommen. Das Verständnis der verschiedenen molekularen Klonierungswerkzeuge, die Ihnen zur Verfügung stehen, sowie die Entwicklung einer sorgfältigen Strategie, bevor Sie mit dem Klonen beginnen, kann eine immense Zeitersparnis sein.

Die DNA-Quelle für die molekulare Klonierung kann durch einfache Extraktionstechniken aus fast jeder Art von Zell- oder Gewebeprobe isoliert werden. Nach der Isolierung kann die PCR verwendet werden, um das Insert zu amplifizieren.

Sobald das Insert amplifiziert ist, werden sowohl es als auch der Vektor von Restriktionsenzymen, auch Restriktionsendonukleasen genannt, verdaut.

Nach der Verdauung können das Insert und der Vektor auf einem Gel ausgeführt und durch einen Prozess namens Gelreinigung gereinigt werden. In Bezug auf den Vektor wird dieser Schritt dazu beitragen, linearisiertes Plasmid von ungeschnittenem Plasmid zu reinigen, das dazu neigt, als Abstrich mit hohem Molekulargewicht auf einem Gel zu erscheinen.

Nach der Gelreinigung der Aufschlüsse wird das Insert über ein Enzym namens DNA-Ligase mit dem Plasmid ligiert oder verbunden.

Im Allgemeinen ist es immer eine gute Idee, Ligationen so einzurichten, dass das Verhältnis von Insert zu Vektor 3 zu 1 beträgt, was sicherstellt, dass nur eine kleine Menge Vektor sich selbst ligiert. Sobald die Ligatur auf Eis aufgebaut ist, wird sie irgendwo zwischen 14 und 25 inkubiert? C von 1 Std. bis Übernachtung.

Als nächstes wird eine Transformation durchgeführt, um den Plasmidvektor in den Wirt einzuführen, der ihn repliziert.

Nach der Transformation werden die Bakterien mit Antibiotikum auf Agarplatten plattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Da das Plasimid ein Antibiotikaresistenzgen enthält, führt eine erfolgreiche Transformation zu Bakterienkolonien, wenn es auf Agarplatten in Gegenwart von Antibiotika gezüchtet wird. Einzelne Kolonien können dann aus der transformierten Platte entnommen, in nummerierten Röhrchen in flüssige Wachstumsmedien gegeben und zur Expansion in einen Schüttelbrutkasten gegeben werden. Ein kleines Volumen der Flüssigkultur wird auf eine nummerierte Agarplatte gegeben, während der Rest der Kultur zur Plasmidreinigung übergeht. Das Nummerierungsschema, das die Identität der Bakterienkolonien angibt, aus denen die Plasmide schließlich gereinigt werden, wird während des gesamten Plasmidreinigungsprozesses beibehalten.

Eine Probe des gereinigten Plasmids wird dann mit Restriktionsenzymen geschnitten. Der Verdau wird dann geladen und auf dem Gel ausgeführt, um das Vorhandensein von Insert zu überprüfen, das bestätigt, dass die Bakterienkolonie mit einem Plasmid transformiert wurde, das ein Insert und kein selbstligiertes Plasmid enthält. Bakterien, bei denen nachgewiesen wurde, dass sie mit einem inserthaltigen Plasmid transformiert wurden, werden für die weitere Plasmidreinigung expandiert. Die Sequenzierung wird als letzter Verifizierungsschritt verwendet, um zu bestätigen, dass das gewünschte Gen kloniert wurde.

Die molekulare Klonierung kann für eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Wenn beispielsweise ein mRNA-Template von einem Enzym namens reverse Transkriptase zur Bildung von cDNA oder komplementärer DNA transkribiert wird und dann PCR zur Amplifikation der cDNA verwendet wird, kann die molekulare Klonierung verwendet werden, um eine cDNA-Bibliothek zu erstellen ? Eine Bibliothek aller Gene, die von einem bestimmten Zelltyp exprimiert werden.

Die molekulare Klonierung kann auch eingesetzt werden, um eine Reihe von Genen oder Genclustern aus einem Bakterienstamm in Plasmide umzuwandeln, die in einem anderen Stamm umgewandelt werden, so dass ein gesamter Biosyntheseweg nachgebildet werden kann, um ein komplexes Molekül herzustellen.

Durch molekulare Klonierung kann eine Mutantenbibliothek erzeugt werden, indem ein Zielplasmid in einem speziellen Bakterienstamm exprimiert wird, der bei bestimmten Temperaturen eine fehleranfällige Polymerase verwendet. Die Mutationen können durch Sequenzierung charakterisiert werden. Bakterien, die mit mutierten Genen transformiert wurden, können dann mit verschiedenen Medikamenten oder Chemikalien getestet werden, um zu sehen, welche Bakterienkolonien sich so entwickelt haben, dass sie Arzneimittelresistenzen aufweisen.

Dank der molekularen Klonierung können Reportergene in DNA-Plasmide eingebaut werden, ein häufiges Reportergen ist das grün fluoreszierende Protein oder GFP, das eine grüne Fluoreszenz aussendet, wenn es UV-Licht ausgesetzt wird. Ein Reportergen kann auch in ein Alphavirus eingefügt werden, um eine Infektion bei Mücken und die Übertragbarkeit in Zellen zu zeigen.

Sie haben sich gerade das Video von JoVE über molekulares Klonen angesehen. Sie sollten nun verstehen, wie das molekulare Klonen funktioniert und wie die Technik in der Molekularbiologie eingesetzt werden kann. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!