Enteric bakterielle Invasion von intestinalen Epithelzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe des vertikalen Diffusionskammer-Modells (VDC-Modell) bakterielle Wechselwirkungen mit einer Invasion intestinaler Epithelzellen zu untersuchen. Zunächst wird dazu ein spezieller Filter verwendet, der mit einer polarisierten Monoschicht von Caco-2-Darmepithelzellen bestückt ist, um im VDC getrennte apikale und basolaterale Kompartimente zu schaffen. Im zweiten Schritt wird das gewünschte bakterielle Inokulum dem apikalen Kompartiment zugegeben.

Unter mikroaeroben Bedingungen und Zellkultur wird das Kulturmedium unter aeroben Bedingungen dem basolateralen Kompartiment zugegeben. Anschließend wird zu den gewünschten Zeitpunkten während der Kokultur der Filter entfernt und die Anzahl der interagierenden oder intrazellulären Bakterien bestimmt. Letztendlich kann mittels des VDC-Modells im Vergleich zu standardmäßigen aeroben Kulturbedingungen ein Anstieg der Anzahl an interagierenden und intrazellulären Bakterien beobachtet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie den standardmäßigen Adhäsions- und Invasionstests in der Gewebekultur, liegt darin, dass die Kokultur von Bakterien und intestinalen Epithelzellen unter in-vitro-Bedingungen durchgeführt wird, die den in-vivo-Bedingungen des menschlichen Darms stärker ähneln.

Die Prozedur wird N Vida nas, eine Doktorandin aus meinem Labor, und Dominic Mills, ein Postdoktorand, der das vertikale Diffusionskammermodell im Rahmen seiner Promotion in meinem Labor entwickelt hat, demonstrieren. Beginnen Sie damit, vier mal 10 hoch fünf Caco-2-Darmepithelzellen pro 0,4-Mikron-Filter in Kulturmedium anzusiedeln, anschließend werden die Zellen 21 Tage lang zur Polarisation kultiviert, wobei das Medium alle zwei bis drei Tage gewechselt wird, um den Polarisationsstatus der Zellschicht zu überprüfen. Zur Messung des trans-epithelialen elektrischen Widerstands verwenden Sie ein Volt-Ohm-Messgerät.

24 Stunden vor Beginn des VDC-Kokultur-Assays *Campylobacter jejuni* auf einer frischen Blutagarplatte unter mikroaeroben Bedingungen in einem Inkubator mit variabler Atmosphäre inkubieren. Gleichzeitig am Tag des Experiments 30 Milliliter Bruce-Bouillon unter denselben Bedingungen vorinkubieren und die VDC-Halbkammern sowie die O-Ringe und Stopfen in eine Sterilisationslösung eintauchen. Anschließend mit einer sterilen 20-Milliliter-Spritze die Lösung eine Stunde lang durch die Gaszuführungen in beiden Halbkammern spülen. Danach die VDC-Bauteile mit einer weiteren sterilen 20-Milliliter-Spritze mit frischem sterilem Wasser nachspülen, wobei auch die Gaszuführungen gereinigt werden.

Anschießend wird die Hälfte der CJ-Jui-Blutagarplattenkultur in ein Milliliter vorgeheizter Barella-Brühe geerntet, um etwa 10 hoch 10 KBE pro Milliliter zu erhalten. Die optische Dichte der bakteriellen Suspension wird bei 600 Nanometern gemessen, um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) halbquantitativ zu bestimmen, und anschließend die bakterielle Suspension auf das gewünschte Inokulum in insgesamt vier Milliliter vorgeheizter Bruce-Brühe eingestellt. Anschließend wird eine serielle Verdünnung aus dieser endgültigen bakteriellen Suspension durchgeführt, die geeignete Verdünnung auf Blutagarplatten ausgeplattet (jeweils im Triplikat) und die Platten 48 Stunden im Inkubator mit variabler Atmosphäre inkubiert.

Platzieren Sie nun die untere Kammerhälfte des VDC flach auf den Arbeitsplatz und setzen Sie einen O-Ring darauf. Trennen Sie anschließend einen Filter mit den intestinalen Epithelzellen vom Träger ab und waschen Sie ihn dreimal mit jeweils 400 Mikrolitern sterilem PBS. Setzen Sie den Filter auf die untere Kammerhälfte, wobei sichergestellt sein muss, dass der O-Ring an seiner Position bleibt, und senken Sie dann vorsichtig die obere Kammerhälfte ein.

Nachdem die beiden Halbkammern zusammengesetzt wurden, klemmen Sie sie mithilfe der Ringklemmen zusammen und stellen die VDC horizontal auf die Laboroberfläche, wobei die beiden Öffnungen nach oben zeigen. Geben Sie das bakterielle Inokulum in die apikale Halbkammer und fügen Sie anschließend vier Milliliter Zellkulturmedium in die basolaterale Halbkammer hinzu. Setzen Sie die Endstücke in die Öffnungen beider Halbkammern ein und stellen Sie die VDC dann in den Inkubator mit variabler Atmosphäre.

In unmittelbarer Nähe zum Gasverteiler öffnen Sie den Gaszuführungsregler, der mit dem Gasverteiler verbunden ist. Schließen Sie das Rohr vom Verteiler an den Gaszulauf der basolateralen Halbkammer des VDC an und verbinden Sie anschließend das Gasabflussrohr, das aus dem Inkubator mit variabler Atmosphäre austritt, mit einem der Auslässe am Endstück der basolateralen Halbkammer. Verschließen Sie den anderen Auslass am Endstück der basolateralen Halbkammer.

Öffnen Sie dann die Gaszufuhr am Gasverteiler sehr langsam, um einen Überdruck zu vermeiden und nach der entsprechenden Co-Kulturzeit einen Gasfluss von einer Blase alle zwei bis fünf Sekunden zu erreichen. Schließen Sie den am Gasverteiler angeschlossenen Gasregler. Dann bläst man den Gasfluss am Verteiler in die VDC ab und trennt den Gaszulauf, den Gasablauf und den Stopfen von der VDC.

Entfernen Sie anschließend den VDC aus dem Inkubator mit variabler Atmosphäre. Entfernen Sie dann die apikalen und basolateralen Überstände und lagern Sie diese bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Analyse. Entfernen Sie die Ringklemmen und nehmen Sie den VDC vorsichtig auseinander.

Entfernen Sie den Filter aus der Halbkammer und überführen Sie ihn in eine sterile sechsgängige Zellkulturschale. Waschen Sie anschließend den VDC mit steriler Wasser und lagern Sie ihn für die nächste Versuchsreihe zur Bestimmung der Gesamtanzahl interagierender Bakterien. Waschen Sie die intestinalen Epithelzellen drei- bis viermal mit jeweils 400 µL steriler PBS und lysieren Sie sie dann 20 Minuten bei Raumtemperatur in 400 µL steriler PBS, die Triton X-100 enthält. Führen Sie eine serielle Verdünnung des Zelllysats durch und impfen Sie anschließend die geeigneten Verdünnungen im Dreifachansatz auf Blutagarplatten aus.

Anschließend die Platten 48 Stunden lang im variablem Atmosphäreninkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Gesamtanzahl der eindringenden Bakterien zu bestimmen. Die intestinalen Epithelzellen mit 400 µL Zellkulturmedium, das 150 µg/mL Gentamycin enthält, zwei Stunden lang in einem standardmäßigen Zellkulturinkubator inkubieren, um die extrazellulären Bakterien abzutöten. Danach die koloniebildenden Einheiten nach Zelllyse, serieller Verdünnung und Kultur wie gerade gezeigt quantifizieren.

Die folgenden Daten zeigen einen Vergleich der Anzahl von CJ jui, die nach drei, sechs oder 24 Stunden der Co-Kultur unter standardmäßigen Zellkultur-Assay-Bedingungen bzw. unter Verwendung des VDC-Modells mit Caco-2-Zellen interagieren oder diese invadieren. Nach 24 Stunden Co-Kultur können beispielsweise unter standardmäßigen Zellkultur-Bedingungen weniger als 10^7 KBE von CJ Juna beobachtet werden, die mit Caco-2-Zellen interagieren. Nach 24 Stunden Co-Kultur im VDC-Modell hingegen können etwa 10^8 KBE von CJ jui beobachtet werden, die mit Caco-2-Zellen interagieren, was einer nahezu zehnfachen Steigerung der CJ jui-IEC-Interaktionen entspricht.

Beim Vergleich der Anzahl eindringender CJ jui unter Standard- und VDC-Kulturbedingungen können etwa 10 hoch 5 intrazelluläre CFU von CGE jui nach 24 Stunden aus den CACO-2-Zellen unter Standardzellkulturbedingungen isoliert werden. Dagegen können nach 24-stündiger Ko-Kultur im VDC-Modell etwa 10 hoch 7 intrazelluläre CFU aus den CACO-2-Zellen isoliert werden, was einem Anstieg der intrazellulären CGE um nahezu das 100-Fache entspricht. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, den Gasfluss in der basolateralen Kammer nach deren Entwicklung zu überwachen.

Diese Technik hat den Weg dafür geebnet, dass Forscher auf dem Gebiet der Abuc-Patheogenese sowohl die genetische Grundlage der bakteriellen Interaktion mit intestinalen epithelialen Zellen als auch die Reaktion des Wirts im angeborenen Immunsystem gegenüber bakteriellen Infektionen untersuchen können. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Modell der vertikalen Diffusionskammer verwendet, um die Wechselwirkungen anderer enterischer Bakterien mit intestinalen epithelialen Zellen sowie Bedingungen zu untersuchen, die jenen im menschlichen Darm stärker ähneln.