Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der Immunantworten von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes auf eine Infektion mit humanen respiratorischen Synzytialviren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Reaktion menschlicher Immunzellen auf eine Infektion mit dem respiratorischen Synzytialvirus oder RSV zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein infektiöser RSV-Stamm auf Hela-Zellen kultiviert wird. Im zweiten Schritt wird der kultivierte RSV-Stamm durch Ultrazentrifugation gereinigt.

Anschließend werden primäre humane Immunzellen aus dem Blut durch Dichtezentrifugation isoliert. Im letzten Schritt werden die isolierten Immunzellen mit dem Virus stimuliert. Letztendlich kann die zelluläre Immunantwort auf eine RSV-Infektion mittels ELISA, qPCR oder Durchflusszytometrie bewertet werden.

Diese Technik ist eine wertvolle Ergänzung zur Untersuchung von Atemwegsinfektionen durch Viren in situ. RSV ist stark an den Menschen angepasst. Daher ist es wichtig, humane Immunzellen zu verwenden, um die an der Pathogenese des Virus beteiligten entzündlichen Signalwege zu untersuchen.

Obwohl in diesem Video das RSV-Virus verwendet wird, kann diese Methode leicht auch zur Untersuchung anderer Viren wie Influenzavirus oder Rhinovirus angepasst werden. Beginnen Sie damit, ein Gefäß mit humanem RSV-Stammdesignat und ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius aufzuwärmen. Sobald das Virus aufgetaut ist, verdünnen Sie den Stamm in vier Milliliter-Aliquots Infektionsmedium pro Kolben.

Unter Beibehaltung einer Multiplikation der Infektion (MOI) von 0,1 oder darunter, fügen Sie das Virus den Heli-Zellen in einem möglichst geringen Gesamtvolumen hinzu, ohne dass die Zellen austrocknen. Inkubieren Sie die Kulturen anschließend zwei bis vier Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ und schwenken Sie das Kolben alle 15 Minuten, um das Medium gleichmäßig zu verteilen. Entfernen Sie danach das Inokulum und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.

Gegeben Sie anschließend 15 Milliliter Kulturmedium in die Kolben und inkubieren Sie diese drei bis fünf Tage unter den gleichen Kulturbedingungen. Beobachten Sie die Zellen täglich einmal unter normalem Hellfeldmikroskop für virusinduzierte zytopathologische Veränderungen. Sobald diese Veränderungen sichtbar sind, schaben Sie die Zellen ab, um das RSV zu gewinnen, sammeln die Suspension in einem sterilen 50-Milliliter-Röhrchen, zentrifugieren die Zellen und anschließend zentrifugieren Sie sie 10 Minuten bei 1800 ×g und Raumtemperatur, um den Zelltrümmern zu pelletieren.

RSV pelletisiert bei dieser Geschwindigkeit nicht und das Überstand kann daher bei minus 80 Grad Celsius als Impfstamm in einer Menge von einem Milliliter aufbewahrt werden. Aliquote für die zukünftige Verwendung stets schnell durch Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff einfrieren, um den Verlust infektiöser Viruspartikel zu verhindern. Um RSV zu reinigen, beginnen Sie damit, einen sterilen Zentrifugenröhrchen in jeden Rotor einer Ultrazentrifuge zu stellen.

Anschließend fünf Milliliter frisch hergestellte, filtersterilisierte Saccharoselösung auf den Boden jedes Röhrchens geben. Danach sehr langsam 30 Milliliter der RSV-Lösung vorsichtig auf die Saccharoselösung pipettieren, wobei darauf geachtet werden muss, die Saccharoselösung nicht zu verwirbeln und die Schichten getrennt zu halten. Dann im Flusskabinett zur Aufrechterhaltung der Sterilität die sechs Ultrazentrifugenröhrchen unter Verwendung steriler PBS so sorgfältig ausbalancieren, dass sie inklusive der Verschlüsse ein Gewichtsgefälle von maximal 0,1 Gramm aufweisen. Das Virus für 1,5 Stunden bei 20.000 RCF und 4 Grad Celsius zentrifugieren.

Und dann, nach Abschluss des Schleudergangs, die Zentrifugenröhrchen mit sterilen Pinzetten vorsichtig aus den Rotoren entfernen. Die Viruspartikel sind durch die Saccharoseschicht hindurchgegangen und haben sich als Pellet abgelagert. Die Zentrifugenröhrchen in einen Behälter für virale Abfälle kippen und sie zum Abtropfen kopfüber auf einer sterilen Oberfläche abstellen.

Lassen Sie das Pellet nicht vollständig austrocknen. Lassen Sie anschließend vorsichtig ein Milliliter HPSS über das Pellet laufen und kippen Sie das Zentrifugenröhrchen erneut, um den HPSS ablaufen zu lassen. Drehen Sie dann das Röhrchen erneut auf den Kopf, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Pellet nicht austrocknet.

Vortexen Sie das Pellet nun 40-mal in einem weiteren Milliliter HBSS, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasenbildung erfolgt, da diese das Virus zerstören kann. Anschließend portionieren und schockgefrieren Sie das Virus in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie das Virus bei minus 80 Grad Celsius bis zur Quantifizierung und weiteren Verwendung. Nachdem Blut von gesunden Probanden in 10-Milliliter-EDTA-Röhrchen gewonnen wurde, verdünnen Sie das Blut mit PBS bei Raumtemperatur bis zu einer Verdünnung um das Zweifache, maximal auf 35 Milliliter verdünntes Blut in einem 50-Milliliter-Röhrchen.

Befestigen Sie als Nächstes eine sterile Lure-Lock-Nadel an einer sterilen 50-Milliliter-Spritze und saugen Sie das Dichtegradientenmedium in die Spritze auf. Setzen Sie die Nadel auf den Boden des mit verdünntem Blut befüllten Gefäßes und pipettieren Sie vorsichtig 15 Milliliter Dichtegradientenmedium unter das Blut, wobei eine saubere Trennlinie zwischen dem Dichtegradienten und dem Blut erhalten bleibt. Trennen Sie die Zellen anschließend 20 Minuten lang bei 800 ×g bei Raumtemperatur mit maximaler Beschleunigung und ohne Bremse. Nach der Trennung befinden sich die Erythrozyten im Pellet am Boden des Gefäßes, darüber eine silbrige Schicht aus Neutrophilen.

Die klare Schicht über dem Pellet enthält das Dichtegradientenmedium, und die dünne Schicht zwischen dem Dichtegradientenmedium und der Blutplasmaschicht oben enthält die PBMC. Mit einer Pasteurpipette die PBMC vorsichtig abpipettieren und die Zellen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführen. Kaltes PBS bis zu einem Endvolumen von 50 Milliliter hinzufügen und die Zellen nach Beendigung der Zentrifugation pelletieren.

Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal mit je 50 Milliliter eiskaltem PBS. Nach der zweiten Wäsche geben Sie ein Milliliter eiskaltes Medium zum Pellet hinzu, zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Zellkonzentration auf fünf mal 10 hoch sechs PBMC pro Milliliter ein. Um die PBMC zunächst mit lebendem RSV zu stimulieren, geben Sie 100 Mikroliter PBMC in jedes Loch einer 96-Loch-Rundbodenplatte. Anschließend geben Sie 50 Mikroliter frisch verdünnter Stimuli in jeweils zweifacher Verdünnung zu jedem Loch hinzu.

Die Platte 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2 gut inkubieren und anschließend die Platte zentrifugieren, das Überstand für spätere Analyse mittels ELISA sammeln. Die stimulierten PBMCs im Pellet können mittels QPCR analysiert oder zur Durchflusszytometrie angefärbt werden. Bei der Durchführung eines A-P-B-M-C-Stimulationsversuchs wird die Stimuli-Fraktionsmethode in Kombination mit dieser Methode empfohlen.

Die Bedingungen werden in Standardstimuli wie RPMI oder humanem RSV sowie Testfraktionsbedingungen wie Mial, Dipeptid oder LPS unterteilt. Wichtig ist, dass in jedem Experiment stets eine negative Kontrolle wie RPMI allein und eine positive Kontrolle wie LPS enthalten sind. Nach 24-stündiger Stimulation mit RSV zeigen verschiedene PBMC-Populationen eine dosisabhängige Infektionsrate und einen Unterschied in der RSV-Infektionseffizienz. Nach 24-stündiger Stimulation mit dem Virus ermöglicht die qPCR-Analyse der PBMCs zur Expression von TNF-alpha oder Interferon-gamma nachzuweisen, dass RSV eine starke Hochregulation der Transkription dieser beiden entzündlichen Zytokine induziert. Umgekehrt führt die Stimulation mit Mial, Dipeptid oder LPS nur zu einer schwachen mRNA-Expression.

Wenn P-BMCs gleichzeitig mit RSV und dem MIAL-Dipeptid stimuliert werden, wird eine starke synergistische Hochregulation beobachtet. Stimulierte PBMCs wurden außerdem auf ihre Produktion von TNF-α oder Interferon-γ mittels ELISA analysiert. Im Gegensatz zu den Beobachtungen auf transkriptioneller Ebene ist RSV ein schwacher Induktor der TNF-α- und Interferon-γ-Proteinausschüttung; die Stimulation von P-BMCs mit dem MIAM-Dipeptid führt zur Produktion geringer Mengen an TNF-α und keines Interferon-γ.

Ähnlich wie bei den transkriptionellen Analysen zeigen sowohl TNF-alpha als auch Interferon-gamma eine synergistische Hochregulation, wenn sie gleichzeitig mit RSV und dem Dipeptid MIAM stimuliert werden, wobei MIAM als Kontrolle dient, um zu überprüfen, ob die Zytokininduktion von der Replikation von RSV abhängt. PBMCs wurden mit lebendem oder durch Beta-Propal-Lacton inaktiviertem RSV stimuliert, wie in den Grafiken dargestellt; sowohl lebendes als auch inaktiviertes RSV induzierte die Produktion proinflammatorischer Zytokine. Beachten Sie, dass Experimente mit RSV in einem生物-Sicherheitswerkbank in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 durchgeführt werden müssen.

Außerdem ist es wichtig, bei der Anwendung dieser Methode darauf zu achten, während des gesamten Verfahrens endotoxinfreie Reagenzien und Materialien zu verwenden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie humane PBMCs mit RSV stimuliert werden können, und über mehrere Assays, die zur Analyse der Immunantwort verwendet werden können.