Name: Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der Immunantworten von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes auf eine Infektion mit humanen respiratorischen Synzytialviren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Lernen Sie die Analyse immunologischer Reaktionen von humanen peripheren Blutzellen auf RSV-Infektionen. Diese Methode nutzt Dichtezentrifugation und Durchflusszytometrie, um entzündliche Signalwege zu untersuchen.

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RSV A2 wurde freundlicherweise von Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt. MV und GF werden vom Virgo-Konsortium unterstützt, das von der niederländischen Regierung mit der Projektnummer FES0908 und von der niederländischen Genomik-Initiative (NGI) mit der Projektnummer 050-060-452 finanziert wird. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Hinweis:
Experimente mit HRSV müssen in einem Sicherheitswerkbank im Biosicherheitslabor der Stufe 2 durchgeführt werden. Sammeln Sie alle virusbelasteten Abfälle und Materialien, die mit dem Virus in Kontakt gekommen sind, zur ordnungsgemäßen Entsorgung aufgrund der biologischen Gefährdung.
Besondere Vorsichtsmaßnahmen müssen bei der Verwendung von potenziell infiziertem menschlichem Blut beachtet werden.
Es ist entscheidend, endotoxinfreie Reagenzien in allen Protokollen zu verwenden.
1. Kultivierung von HRSV A2
<ol>
	<li>Kultivieren Sie HeLa- oder HEp-2-Zellen in DMEM-Medium + 10 % fetalem Kälberserum (FCS) + 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) in einer 175 cm²-Flasche bei 37 °C und 5 % CO₂.2 Kulturflasche, bis sie etwa 50 % konfluent sind.</li>
	<li>Die Zellen dreimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur waschen (PBS).</li>
	<li>Tauen Sie eine Ampulle mit HRSV-Inokulationsstammvirus bei 37 °C in einem Wasserbad. Verdünnen Sie den Virusstamm so, dass die MOI bei 0,1 oder darunter liegt. Dies verhindert die Bildung defekter interferierender Partikel (DIPs). Verdünnen Sie den Virusstamm in 4 ml/Flasche Infektionsmedium (DMEM + 1 % P/S) und geben Sie es zu den HeLa- oder HEp-2-Zellen. Halten Sie dieses Volumen so gering wie möglich, ohne dass die Zellen austrocknen. Je geringer das Volumen, desto höher ist die Infektionsrate.</li>
	<li>Inkubieren Sie 2–4 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂2. Schwenken Sie den Kolben alle 15 Minuten, um das Medium gleichmäßig umzuverteilen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Inokulum und waschen Sie einmal mit PBS.</li>
	<li>Geben Sie 15 ml Kulturmedium (DMEM + 10 % FCS + 1 % P/S) hinzu und inkubieren Sie für 3–5 Tage bei 37 °C, 5 % CO₂2. Beobachten Sie die Zellen mit normaler Hellfeldmikroskopie auf virusinduzierte zytopathologische Veränderungen. z. B. Bildung von Syncytien und Zelltod sowie schwebende Zellen.</li>
	<li>Wenn eine zytopathische Wirkung auftritt, gewinnen Sie HRSV durch Abkratzen der Zellen und sammeln die Virus-Suspension in einem sterilen 50-ml-Röhrchen. Vortexen Sie die Zellsuspension. Das Abkratzen und Vortexen der Zellen setzt mehr virale Partikel frei.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Virus-Suspension 10 min bei Raumtemperatur mit 1.800 x g, um das Zelltrümmern zu pelletieren. HRSV bleibt in diesem Schritt im Überstand, da es bei dieser Zentrifugalkraft nicht pelletiert, und der Überstand kann direkt zur Infektion mehrerer 175 cm²-Flaschen verwendet werden.2 Flaschen oder kann bei -80 °C als Ansaatbestand in 1-ml-Aliquoten für die spätere Verwendung. HRSV stets im flüssigen Stickstoff schockgefrieren, um einen Verlust infektiöser Viruspartikel zu verhindern.</li>
	<li>Wie oben angegeben, wird der mit dem obigen Protokoll hergestellte Ansatz verwendet, um mehrere 175 cm²-Flaschen zu infizieren.2 Kulturflaschen. Wiederholen Sie das exakte Protokoll, um mehr Virus für die Reinigung zu produzieren. Reinigen Sie bis zu 180 ml Virus-Suspension in einem Ultrazentrifugationszyklus.</li>
	<li>Wenn eine zytopathische Wirkung auftritt, HRSV durch Abkratzen der Zellen ernten und das Überstandmedium sammeln. Die Virus-Suspension vortexen. 10 min bei Raumtemperatur mit 1.800 × g zentrifugieren, um zelluläre Trümmer zu pelletieren. HRSV bleibt bei dieser Zentrifugationsgeschwindigkeit im Überstand und wird in Portionen zu je 15 ml pro 50-ml-Röhrchen abgefüllt. Sofort einfrieren und bei −80 °C bis zur Reinigung.</li>
</ol>
2. Reinigung von HRSV
Hinweis: Bevor Sie eine Ultrazentrifuge verwenden, beachten Sie, dass es sich um ein potenziell gefährliches Gerät handelt. Lesen Sie die Bedienungsanleitungen und führen Sie die erste Ultrazentrifugation unter Aufsicht einer erfahrenen Person durch.
<ol>
	<li>Reinigen Sie die Ultrazentrifugen-Eimer mit 70 %igem Ethanol und lassen Sie sie in einem Sicherheitswerkbank trocknen.</li>
	<li>Stellen Sie ein steriles Zentrifugenröhrchen in jeden Eimer.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 30 %ige (w/v) Saccharose-Lösung in PBS zu, filtrieren und sterilisieren Sie diese (0,2-µm-Filter) und geben Sie 5 ml auf den Boden jedes Zentrifugenröhrchens. Für eine schnellere Protokollführung können die Röhrchen mit der Saccharose-Lösung eingefroren werden. Achten Sie darauf, dass sie steril bleiben.</li>
	<li>Falls die Saccharose-Lösung nicht eingefroren wurde, geben Sie vorsichtig 30 ml HRSV-Lösung auf die Saccharose-Lösung. Pipettieren Sie langsam, um die Saccharose-Lösung nicht zu stören. Halten Sie eine klare Trennlinie. Falls die Röhrchen eingefroren waren, gießen Sie die virale Suspension auf die gefrorene Saccharose-Lösung und lassen Sie diese anschließend auftauen.</li>
	<li>Wägen Sie die sechs Ultrazentrifugen-Eimer sorgfältig mit steriler PBS aus. Stellen Sie die Waage in eine Flusswerkbank, um alles steril zu halten. Füllen Sie die Röhrchen bis 3–5 mm unter den Rand, da sonst die Zentrifugenröhrchen einbrechen können. Wägen Sie die Eimer bis auf 0,1 g genau aus und berücksichtigen Sie dabei die Schraubkappen, falls diese nicht perfekt identisch sind.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie im Ultrazentrifugator 1,5 Stunden bei 4 °C und 20.000 rcf.</li>
	<li>Entfernen Sie das Zentrifugenröhrchen vorsichtig mit sterilen Pinzetten aus dem Eimer. Die Viruspartikel sind durch die Saccharoseschicht hindurchgegangen und haben ein Pellet gebildet. Dagegen verbleiben von Zellen sezernierte lösliche Faktoren (z. B. Zytokine) in der Lösung. Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen, um die gesamte Flüssigkeit ablaufen zu lassen. Lassen Sie es kopfüber auf einer sterilen Oberfläche, z. B. einer Kulturschale, trocknen, aber achten Sie darauf, dass das Pellet nicht vollständig austrocknet.</li>
	<li>Geben Sie vorsichtig 1 ml Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) zum Pellet und kippen Sie das Zentrifugenröhrchen, um die HBSS ablaufen zu lassen. Lassen Sie das Röhrchen erneut kopfüber auf einer sterilen Oberfläche trocknen. Lassen Sie das Pellet nicht vollständig austrocknen.</li>
	<li>Lösen Sie das Pellet durch 40-maliges Auf- und Abpipettieren in 1 ml HBSS wieder auf. Versuchen Sie, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, da diese das Virus zerstören können.</li>
	<li>Portionieren Sie das Virus, schockgefrieren Sie es in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung. Verwenden Sie für jedes Experiment eine neue Portion des Virus, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen die infektiöse Titer reduziert. Zum Auftauen erwärmen Sie das Virus stets auf 37 °C, da HRSV zwischen -20 und 15 °C weniger stabil ist.</li>
</ol>
3. Quantifizierung von HRSV
Hinweis: Wiederholen Sie die Quantifizierung zur Sicherstellung reproduzierbarer Daten mindestens dreimal im Duplikat.
3.1. Infektion von A549-Zellen
<ol>
	<li>Kultivieren Sie A549-Zellen in einer 24-Loch-Platte, bis sie konfluent sind.</li>
	<li>Waschen Sie die A549-Zellen zwei Mal mit jeweils 1 ml PBS bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie 5-fache serielle Verdünnungen von HRSV in Medium mit reduziertem Serum vor. Geben Sie 100 μl der verdünnten Virenprobe in beide Vertiefungen. Erstellen Sie mindestens 4 Verdünnungen (z. B. 4-, 20-, 100- und 500-fach). Fügen Sie zwei zusätzliche Vertiefungen hinzu, die mit der höchsten Virusdosis infiziert werden (diese dienen als Isotyp-Kontrolle), sowie zwei nicht infizierte Kontrollvertiefungen (Mock-infiziert).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang bei 5 % CO2 und 37 °C. Schwenken Sie die 24-Loch-Platte alle 15 Minuten, um Austrocknung zu verhindern.</li>
	<li>Entfernen Sie die Viruslösung und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie 4 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in Medium mit reduziertem Serum vor. Sterilfiltern Sie die Lösung (0,2-μm-Filter) und geben Sie 500 μl in jede Vertiefung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben bei 5 % CO2 und 37 °C für 22 Stunden.</li>
</ol>
3.2. Vorbereitung für die FACS
<ol>
	<li>Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Geben Sie 200 μl vorgewärmtes Trypsin (37 °C) in jede Vertiefung und inkubieren Sie 10 min bei 37 °C, 5 % CO2.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen abgelöst haben. Wenn die Zellen abgelöst sind, geben Sie 800 μl DMEM + 10 % FCS + 1 % P/S hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Suspendieren Sie die Zellen erneut.</li>
	<li>Überführen Sie die Zellen in eine kegelförmige, nicht gewebekulturbehandelte 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Pellets in 200 μl kaltem PBS.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 200 μl kaltem PBS.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 150 μl eiskaltem 80 % Aceton.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 200 μl kaltem PBS + 0,1 % BSA.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 50 μl anti-NP-RSV-FITC (1:50 in PBS + 1 % BSA verdünnt) oder 50 μl IgG2 anti-Maus-FITC (dient als Isotyp-Kontrolle; daher dieselbe Antikörperkonzentration verwenden).</li>
	<li>Behandeln Sie die Röhrchen im weiteren Verlauf des Protokolls lichtgeschützt. Inkubieren Sie mindestens 1 Stunde bei 4 °C, jedoch kann die Inkubation bis über Nacht verlängert werden.</li>
	<li>Geben Sie 150 μl kaltes PBS + 0,1 % BSA hinzu.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 200 μl kaltem PBS + 0,1 % BSA.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 200 μl kaltem PBS + 0,1 % BSA. Halten Sie die Platte auf Eis und lichtgeschützt bis zur FACS-Messung.</li>
	<li>Messen Sie die infizierten Zellen an einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>
3.3. Berechnung von FITC-50
<ol>
	<li>Verwenden Sie ein Durchflusszytometrie-Analyseprogramm, um die Grenze anhand der negativen Kontrolle (Isotypkontrolle) festzulegen. Verwenden Sie den Pseudofarben-Diagrammtyp. Zeichnen Sie ein Quadrantengatter, bei dem die positiven Zellen im Feld Q3 liegen. Der Prozentsatz an falsch-positiven Ergebnissen sollte in beiden Isotypkontrollen unter 0,2 % liegen.</li>
	<li>Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm und erstellen Sie eine Tabelle mit dem Prozentsatz an FITC+ Zellen für jede Verdünnung. Subtrahieren Sie für jeden Wert den Mittelwert der falsch-positiven Ergebnisse (wie durch die Isotypkontrolle bestimmt) je Experiment.</li>
	<li>Öffnen Sie eine neue Datei (XY-Streudiagramm, einzelner X- und mehrere Y-Spalten) in einem Statistikprogramm. Übertragen Sie die Daten in dieses Programm: X = Verdünnung, Y = % infizierter Zellen, n = 3, verwenden Sie den Mittelwert aus zwei Messungen für jede Verdünnung. Führen Sie eine nichtlineare Regression durch, statistische Analyse mit einphasigem exponentiellem Zerfall. Prüfen Sie, ob die Kurve zu den Datenpunkten passt; falls nicht, wählen Sie eine andere statistische Analyse.</li>
	<li>Kopieren Sie die Gleichung der Kurve und die Werte für die Gleichung in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnen Sie den X-Wert für Y = 50 %. Bestimmen Sie entsprechend den FITC-50-Wert, indem Sie die mittels FITC nachgewiesenen infektiösen Partikel/ml (FIP/ml) bei der Verdünnung berechnen, bei der eine 50 %ige Infektion vorliegt, unter Verwendung der folgenden Gleichung: 
	<img alt="Formel zur Berechnung von FITC50; Diagramm zur Veranschaulichung der Gleichung zur Messung der Fluoreszenzintensität." fo:src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Gleichung 1"> 
	A = durchschnittliche Anzahl an A549-Zellen pro Mulde 
	B = μl Virus pro Mulde, verwendet für die Infektion 
	C = Verdünnung, bei der eine 50 %ige Infektion vorliegt</li>
</ol>
4. Isolierung peripherer mononuklearer Blutzellen (PBMC) aus Blut gesunder Probanden
<ol>
	<li>Entnehmen Sie venöses Blut in 10-ml-EDTA-Röhrchen von gesunden Probanden nach schriftlicher Einwilligung. Aus einem Volumen von 10 ml Blut lassen sich etwa 107 PBMCs gewinnen.</li>
	<li>Ab diesem Schritt arbeiten Sie sterilerweise im Flusswerkbank.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Blut 1:1 mit PBS bei Raumtemperatur in einem 50-ml-Röhrchen. Pro 50-ml-Röhrchen kann ein maximales Gesamtvolumen von 35 ml verdünntem Blut verwendet werden.</li>
	<li>Nehmen Sie eine 50-ml-sterile Spritze und setzen Sie eine sterilisierte Luer-Lock-Nadel auf. Füllen Sie das Spritzengewicht mit Dichtegradientenmedium. Setzen Sie die Nadel auf den Boden eines Röhrchens mit verdünntem Blut und pipettieren Sie vorsichtig 15 ml Dichtegradientenmedium unter das verdünnte Blut. Achten Sie darauf, dass eine klare Trennlinie zwischen Dichtegradientenmedium und Blut erhalten bleibt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 20 min bei 800 x g bei Raumtemperatur mit einer Beschleunigung von 9 (maximal) und ohne Bremse. Stellen Sie nach der Zentrifugation die Temperatur des Zentrifugen auf 4 °C.</li>
	<li>Die Dichtegradientenzentrifugation führt zur Bildung mehrerer Schichten. Auf dem Boden befindet sich ein Pellet aus Erythrozyten, darüber eine silbrige Schicht, die die Neutrophilen enthält. Die klare Schicht über diesem Pellet enthält das Dichtegradientenmedium. Zwischen dem Dichtegradientenmedium und der oberen plasmatischen Schicht liegt eine dünne Schicht, die die PBMCs enthält.</li>
	<li>Sammeln Sie die PBMCs vorsichtig mit einer Pasteurpipette und überführen Sie die Zellen in ein neues 50-ml-Röhrchen. Bewahren Sie die PBMCs ab sofort auf Eis auf und verwenden Sie eiskaltes PBS. Füllen Sie eiskaltes PBS auf ein Endvolumen von 50 ml auf und zentrifugieren Sie 10 min bei 400 x g und 4 °C (mit der Bremse auf Stufe 9).</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen, resuspendieren Sie das Pellet in 50 ml eiskaltem PBS und zentrifugieren Sie erneut 10 min bei 400 x g und 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.</li>
	<li>Nach dem Absaugen des Überstandes geben Sie 1 ml eiskaltes Medium (RPMI + 1 % P/S) hinzu und zählen die Zellen mit einer Zählkammer.</li>
	<li>Stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 106 PBMCs/ml ein.</li>
</ol>
5. Stimulation von PBMCs mit lebendem HRSV
<ol>
	<li>Bereiten Sie einen Versuchsaufbau vor; schließen Sie für jede Bedingung experimentelle Duplikate ein.</li>
	<li>Verdünnen Sie alle notwendigen Stimuli in Medium (RPMI + 1 % P/S). Berücksichtigen Sie, dass das Endvolumen pro Vertiefung 200 μl beträgt. Es werden 50 μl Stimulus zugegeben, bereiten Sie daher 4fach konzentrierte Stimulationsansätze vor.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl der oben genannten Zellsuspension in jede Vertiefung einer runden 96-Loch-Platte (5 x 105 PBMC/Vertiefung).</li>
	<li>Fügen Sie 50 μl der verdünnten Stimuli zu jeder Vertiefung hinzu. Es ist möglich, zwei verschiedene Stimuli hinzuzufügen, was ein Gesamtvolumen von 200 μl ergibt. Falls nur ein Stimulus benötigt wird, stellen Sie das Volumen mit Medium auf 200 μl ein.</li>
	<li> Inkubieren Sie die 96-Loch-Platte für den erforderlichen Zeitraum bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator. Für die meisten Zytokine ist eine Inkubation von 24 Stunden ausreichend.</li>
</ol>
6. Auswertung der Stimulation
<ol>
	<li>Nach der Inkubationszeit die 96-Well-Platte 5 min bei Raumtemperatur mit 450 x g zentrifugieren, um die Zellen am Boden zu sammeln.</li>
	<li>Den Überstand (maximal 180 μl) abnehmen und für nachfolgende Zytokinanalyse bei -20 °C oder für die Virusproduktion bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Die im Pellet enthaltenen stimulierten PBMCs können entweder durch Zugabe von Lysepuffer für eine qPCR/Western Blot-Analyse aufgearbeitet oder alternativ für die Durchflusszytometrie angefärbt werden.</li>
</ol>

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<li>Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+endotoxin-stimulated+leukocytes+of+term+new+born%3A+control+of+cytokine+gene+expression+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10.</a> Plos One. 8 (1), e53641(2013).</li>
</ol>

Wir haben nichts offenzulegen.

In dieser Studie zeigen wir, dass die Infektion von PBMC mit HRSV ein schnelles und zuverlässiges Modellsystem ist, in dem Entzündungswege untersucht werden können. Um PBMC zu stimulieren, muss ein HRSV-Bestand erstellt und quantifiziert werden.
Mehrere Zelllinien sind anfällig für eine HRSV-Infektion. Zelllinien, die am häufigsten für die HRSV-Kultivierung verwendet werden, sind HEp-2-, HeLa- und Vero-Zellen. Wir würden jedoch die Verwendung von Vero-Zellen für die Kultivierung von HRSV nicht...

Das Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV) ist die häufigste Ursache für Infektionen der unteren Atemwege bei Kindern. Jedes Jahr infizieren sich über 33 Millionen Kinder unter fünf Jahren mit HRSV, was zu über drei Millionen Krankenhausaufenthalten und fast 200.000 Todesfällen führt1. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass HRSV auch eine erhebliche Bedrohung für ältere Menschen und Erwachsene mit chronischen Grunderkrankungen darstellt2.
Die Mehrzahl der HRSV-Infektionen bei Kleinkindern zeigt leichte Symptome, vergleichbar mit einer Erkältung, und erfordert keine klinische Intervention. Ein kleiner Teil der Patienten muss jedoch aufgrund einer schweren Bronchiolitis ins Krankenhaus eingeliefert und beatmet werden.
Ein Teil der Pathogenese der HRSV-Krankheit ist die übermäßig überschwängliche und unzureichende Immunantwort des Wirts auf eine Infektion3,4. Dies wird durch mehrere Beobachtungen verdeutlicht. Der Periode der maximalen Erkrankung geht oft der Höhepunkt der Virusinfektion voraus und fällt besser mit der zellulären Infiltration infizierter Gewebe und der Freisetzung von entzündlichen Zytokinen zusammen3. Eine weitere Beweislinie stammt aus den Formalin-inaktivierten HRSV (FI-RSV)-Versuchen in den 1960er Jahren. Anstatt bei kleinen Säuglingen einen Schutz zu induzieren, führte der Impfstoff zu einer übertriebenen Immunantwort, die zu einer verstärkten Atemwegserkrankung und einer höheren Morbidität und Mortalität führte.
Mehrere Modelle wurden entwickelt, um die Pathogenese von HRSV-Infektionen zu untersuchen. Kontinuierliche Zelllinien wie HEp-2 und A549 wurden ausgiebig zur Untersuchung von HRSV-Infektionen in vitro eingesetzt. Epithelzellen sind die primären Ziele der HRSV-Infektion5, daher wurde viel Wert auf diese Zelltypen gelegt. Die in vivo-Situation ist jedoch viel komplexer und nicht auf einen Zelltyp beschränkt. Um diese komplexen Wechselwirkungen zu untersuchen, wurden mehrere tierische Infektionsmodelle entwickelt, um die HRSV-Pathogenese zu untersuchen. Bisher wurden zwei verschiedene Strategien verfolgt, die sich entweder auf heterologe (nichtmenschliche) Modelle sowie auf verwandte Wirt-Pneumovirus-Modelle konzentrierten. Beispiele für heterologe Modelle für HRSV sind Schimpansen, Schafe, Baumwollratten und Mäuse. Die RSV-Infektion in seinem natürlichen Wirt wurde bei Rindern und Mäusen mit Rinder-RSV bzw. Pneumoviren untersucht.
Obwohl jedes dieser Modelle wichtige Einblicke in die Krankheitspathogenese geliefert hat, ist HRSV stark an den Menschen angepasst. Daher schlagen wir vor, zusätzlich zu den derzeit verwendeten Zelllinien und Tiermodellen humane primäre PBMCs als Modell für die Stimulation mit HRSV zu verwenden. Humane PBMCs können von einer Reihe von Personen bezogen werden, um spezifische Forschungsfragen zu beantworten, darunter Kleinkinder6, immungeschwächte Personen sowie gesunde Erwachsene7 oder ältere Personen8. PBMCs können verwendet werden, um angeborene Aspekte der Infektion sowie die adaptive Reaktion auf das Virus zu untersuchen. Aktivierte Entzündungswege, die für die Pathogenese der HRSV-Erkrankung wichtig sind, können auf mRNA- und Proteinebene untersucht werden. Darüber hinaus kann die Virusinfektion von (Untergruppen von) Immunzellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden. Wir haben dieses Modell bereits verwendet, um die synergistischen Effekte einer HRSV-Infektion zusammen mit dem bakteriellen Liganden Muramyldipeptid (MDP) auf die Induktion von proinflammatorischen Zytokinenzu identifizieren 7. Wir schlagen vor, die HRSV-Stimulation von humanen primären PBMCs als robustes, einfaches und schnelles in vitro-Modell zu verwenden, um Entzündungswege zu untersuchen, die an der Pathogenese der HRSV-Erkrankung beteiligt sind.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS ohne Ca2+ Mg2+ oder Phenolrot</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td>HBSS, Calcium, Magnesium, kein Phenolrot</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX, Pyruvat</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>72400054</td><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES</td></tr><tr><td>Reduced Serum Medium (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX</td></tr><tr><td>FCS Greiner</td><td>Bio-one</td><td></td><td>FBS (Fötales Rinderserum)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Albumin aus Rinderserum</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Penicillin-Streptomycin, flüssiges</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>0,05% Trypsin-EDTA (1x), Phenolrot</td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>A549 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>Saccharose BioXtra, &ge; 99,5%</td></tr><tr><td>IgG2 Anti-Maus-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555057</td><td>Ms IgG2b K FITC Isotypkontrolle</td></tr><tr><td>Anti-NP-RSV-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab25849</td><td>Anti-Respiratory Syncytial Virus Antikörper [671] (FITC)</td></tr><tr><td>Density gradient medium (Lymphoprep)</td><td>Axis-Shield</td><td>1114545</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck Millipore</td><td>1000141000</td><td>Aceton für die Analyse</td></tr><tr><td colspan="4">Material </td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, Polyallomer, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>SureSpin 630 Rotor mit 36 ml</td><td>Bechern Sorvall</td><td>79368</td><td>Ausschwingschaufel Titanrotor</td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultrazentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>CB 150l CO2 Inkubator</td><td>Binden</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein in-vitro-modell zur untersuchung der immunantworten von mononukleären zellen des humanen peripheren blutes auf eine infektion mit humanen respiratorischen synzytialviren

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Infektionen mit dem humanen Respiratorischen Synzytial-Virus (HRSV) weisen ein breites Spektrum an Krankheitsschweregraden auf, das von leichten Infektionen bis hin zu lebensbedrohlicher Bronchiolitis reicht. Ein wichtiger Teil der Pathogenese schwerer Krankheitsverläufe ist eine verstärkte Immunantwort, die zur Immunpathologie führt.	Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet wird, um die Immunantwort menschlicher Immunzellen auf eine HRSV-Infektion zu untersuchen. Zunächst beschreiben wir Methoden zur Kultivierung, Reinigung und Quantifizierung von HRSV. Anschließend beschreiben wir ein humanes in vitro Modell, in dem mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) mit lebendem HRSV stimuliert werden. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um mehrere Parameter zu untersuchen, die zur Schwere der Erkrankung beitragen können, einschließlich der angeborenen und adaptiven Immunantwort. Diese Reaktionen können auf transkriptioneller und translationaler Ebene gemessen werden. Darüber hinaus kann eine Virusinfektion von Zellen leicht mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden. Zusammengenommen bietet die Stimulation von PBMC mit lebender HRSV ein schnelles und reproduzierbares Modellsystem zur Untersuchung von Mechanismen, die an der HRSV-induzierten Erkrankung beteiligt sind.

Die hier beschriebene Kultivierungs- und Reinigungsmethode für HRSV A2 liefert eine Ausbeute zwischen 2&nbsp;x&nbsp;107 und 2&nbsp;x&nbsp;108 FITC-50-quantifizierten infektiösen Viruspartikeln/ml. Die Ergebnisse der mikroskopischen Analyse, bei der FITC-gefärbte infizierte Zellen gezählt wurden (Ergebnisse nicht gezeigt), wurden mit den Ergebnissen der Quantifizierung durch FACS verglichen (Abbildung 1). Beide Methoden führten zu ähnlichen Titerwerten, wobei die FACS-Methode eine de...

Das humane Respiratorische Synzytial-Virus (HRSV) kann bei jungen Säuglingen schwere Bronchiolitis verursachen. Ein Teil der Pathogenese der schweren HRSV-Erkrankung wird durch die Immunantwort des Wirts verursacht. Die Stimulation primärer humaner Immunzellen mit HRSV bietet ein schnelles und reproduzierbares Modellsystem zur Untersuchung der Aktivierung von Entzündungswegen und Infektionen.

Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der Immunantworten von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes auf eine Infektion mit humanen respiratorischen Synzytialviren

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Reaktion menschlicher Immunzellen auf eine Infektion mit dem respiratorischen Synzytialvirus oder RSV zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein infektiöser RSV-Stamm auf Hela-Zellen kultiviert wird. Im zweiten Schritt wird der kultivierte RSV-Stamm durch Ultrazentrifugation gereinigt.Anschließend werden primäre humane Immunzellen aus dem Blut durch Dichtezentrifugation isoliert. Im letzten Schritt werden die isolierten Immunzellen mit dem Virus stimuliert. Letztendlich kann die zelluläre Immunantwort auf eine RSV-Infektion mittels ELISA, qPCR oder Durchflusszytometrie bewertet werden.Diese Technik ist eine wertvolle Ergänzung zur Untersuchung von Atemwegsinfektionen durch Viren in situ. RSV ist stark an den Menschen angepasst. Daher ist es wichtig, humane Immunzellen zu verwenden, um die an der Pathogenese des Virus beteiligten entzündlichen Signalwege zu untersuchen.Obwohl in diesem Video das RSV-Virus verwendet wird, kann diese Methode leicht auch zur Untersuchung anderer Viren wie Influenzavirus oder Rhinovirus angepasst werden. Beginnen Sie damit, ein Gefäß mit humanem RSV-Stammdesignat und ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius aufzuwärmen. Sobald das Virus aufgetaut ist, verdünnen Sie den Stamm in vier Milliliter-Aliquots Infektionsmedium pro Kolben.Unter Beibehaltung einer Multiplikation der Infektion (MOI) von 0,1 oder darunter, fügen Sie das Virus den Heli-Zellen in einem möglichst geringen Gesamtvolumen hinzu, ohne dass die Zellen austrocknen. Inkubieren Sie die Kulturen anschließend zwei bis vier Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ und schwenken Sie das Kolben alle 15 Minuten, um das Medium gleichmäßig zu verteilen. Entfernen Sie danach das Inokulum und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.Gegeben Sie anschließend 15 Milliliter Kulturmedium in die Kolben und inkubieren Sie diese drei bis fünf Tage unter den gleichen Kulturbedingungen. Beobachten Sie die Zellen täglich einmal unter normalem Hellfeldmikroskop für virusinduzierte zytopathologische Veränderungen. Sobald diese Veränderungen sichtbar sind, schaben Sie die Zellen ab, um das RSV zu gewinnen, sammeln die Suspension in einem sterilen 50-Milliliter-Röhrchen, zentrifugieren die Zellen und anschließend zentrifugieren Sie sie 10 Minuten bei 1800 ×g und Raumtemperatur, um den Zelltrümmern zu pelletieren.RSV pelletisiert bei dieser Geschwindigkeit nicht und das Überstand kann daher bei minus 80 Grad Celsius als Impfstamm in einer Menge von einem Milliliter aufbewahrt werden. Aliquote für die zukünftige Verwendung stets schnell durch Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff einfrieren, um den Verlust infektiöser Viruspartikel zu verhindern. Um RSV zu reinigen, beginnen Sie damit, einen sterilen Zentrifugenröhrchen in jeden Rotor einer Ultrazentrifuge zu stellen.Anschließend fünf Milliliter frisch hergestellte, filtersterilisierte Saccharoselösung auf den Boden jedes Röhrchens geben. Danach sehr langsam 30 Milliliter der RSV-Lösung vorsichtig auf die Saccharoselösung pipettieren, wobei darauf geachtet werden muss, die Saccharoselösung nicht zu verwirbeln und die Schichten getrennt zu halten. Dann im Flusskabinett zur Aufrechterhaltung der Sterilität die sechs Ultrazentrifugenröhrchen unter Verwendung steriler PBS so sorgfältig ausbalancieren, dass sie inklusive der Verschlüsse ein Gewichtsgefälle von maximal 0,1 Gramm aufweisen. Das Virus für 1,5 Stunden bei 20.000 RCF und 4 Grad Celsius zentrifugieren. Und dann, nach Abschluss des Schleudergangs, die Zentrifugenröhrchen mit sterilen Pinzetten vorsichtig aus den Rotoren entfernen. Die Viruspartikel sind durch die Saccharoseschicht hindurchgegangen und haben sich als Pellet abgelagert. Die Zentrifugenröhrchen in einen Behälter für virale Abfälle kippen und sie zum Abtropfen kopfüber auf einer sterilen Oberfläche abstellen.Lassen Sie das Pellet nicht vollständig austrocknen. Lassen Sie anschließend vorsichtig ein Milliliter HPSS über das Pellet laufen und kippen Sie das Zentrifugenröhrchen erneut, um den HPSS ablaufen zu lassen. Drehen Sie dann das Röhrchen erneut auf den Kopf, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Pellet nicht austrocknet.Vortexen Sie das Pellet nun 40-mal in einem weiteren Milliliter HBSS, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasenbildung erfolgt, da diese das Virus zerstören kann. Anschließend portionieren und schockgefrieren Sie das Virus in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie das Virus bei minus 80 Grad Celsius bis zur Quantifizierung und weiteren Verwendung. Nachdem Blut von gesunden Probanden in 10-Milliliter-EDTA-Röhrchen gewonnen wurde, verdünnen Sie das Blut mit PBS bei Raumtemperatur bis zu einer Verdünnung um das Zweifache, maximal auf 35 Milliliter verdünntes Blut in einem 50-Milliliter-Röhrchen.Befestigen Sie als Nächstes eine sterile Lure-Lock-Nadel an einer sterilen 50-Milliliter-Spritze und saugen Sie das Dichtegradientenmedium in die Spritze auf. Setzen Sie die Nadel auf den Boden des mit verdünntem Blut befüllten Gefäßes und pipettieren Sie vorsichtig 15 Milliliter Dichtegradientenmedium unter das Blut, wobei eine saubere Trennlinie zwischen dem Dichtegradienten und dem Blut erhalten bleibt. Trennen Sie die Zellen anschließend 20 Minuten lang bei 800 ×g bei Raumtemperatur mit maximaler Beschleunigung und ohne Bremse. Nach der Trennung befinden sich die Erythrozyten im Pellet am Boden des Gefäßes, darüber eine silbrige Schicht aus Neutrophilen.Die klare Schicht über dem Pellet enthält das Dichtegradientenmedium, und die dünne Schicht zwischen dem Dichtegradientenmedium und der Blutplasmaschicht oben enthält die PBMC. Mit einer Pasteurpipette die PBMC vorsichtig abpipettieren und die Zellen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführen. Kaltes PBS bis zu einem Endvolumen von 50 Milliliter hinzufügen und die Zellen nach Beendigung der Zentrifugation pelletieren.Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal mit je 50 Milliliter eiskaltem PBS. Nach der zweiten Wäsche geben Sie ein Milliliter eiskaltes Medium zum Pellet hinzu, zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Zellkonzentration auf fünf mal 10 hoch sechs PBMC pro Milliliter ein. Um die PBMC zunächst mit lebendem RSV zu stimulieren, geben Sie 100 Mikroliter PBMC in jedes Loch einer 96-Loch-Rundbodenplatte. Anschließend geben Sie 50 Mikroliter frisch verdünnter Stimuli in jeweils zweifacher Verdünnung zu jedem Loch hinzu.Die Platte 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2 gut inkubieren und anschließend die Platte zentrifugieren, das Überstand für spätere Analyse mittels ELISA sammeln. Die stimulierten PBMCs im Pellet können mittels QPCR analysiert oder zur Durchflusszytometrie angefärbt werden. Bei der Durchführung eines A-P-B-M-C-Stimulationsversuchs wird die Stimuli-Fraktionsmethode in Kombination mit dieser Methode empfohlen.Die Bedingungen werden in Standardstimuli wie RPMI oder humanem RSV sowie Testfraktionsbedingungen wie Mial, Dipeptid oder LPS unterteilt. Wichtig ist, dass in jedem Experiment stets eine negative Kontrolle wie RPMI allein und eine positive Kontrolle wie LPS enthalten sind. Nach 24-stündiger Stimulation mit RSV zeigen verschiedene PBMC-Populationen eine dosisabhängige Infektionsrate und einen Unterschied in der RSV-Infektionseffizienz. Nach 24-stündiger Stimulation mit dem Virus ermöglicht die qPCR-Analyse der PBMCs zur Expression von TNF-alpha oder Interferon-gamma nachzuweisen, dass RSV eine starke Hochregulation der Transkription dieser beiden entzündlichen Zytokine induziert. Umgekehrt führt die Stimulation mit Mial, Dipeptid oder LPS nur zu einer schwachen mRNA-Expression.Wenn P-BMCs gleichzeitig mit RSV und dem MIAL-Dipeptid stimuliert werden, wird eine starke synergistische Hochregulation beobachtet. Stimulierte PBMCs wurden außerdem auf ihre Produktion von TNF-α oder Interferon-γ mittels ELISA analysiert. Im Gegensatz zu den Beobachtungen auf transkriptioneller Ebene ist RSV ein schwacher Induktor der TNF-α- und Interferon-γ-Proteinausschüttung; die Stimulation von P-BMCs mit dem MIAM-Dipeptid führt zur Produktion geringer Mengen an TNF-α und keines Interferon-γ.Ähnlich wie bei den transkriptionellen Analysen zeigen sowohl TNF-alpha als auch Interferon-gamma eine synergistische Hochregulation, wenn sie gleichzeitig mit RSV und dem Dipeptid MIAM stimuliert werden, wobei MIAM als Kontrolle dient, um zu überprüfen, ob die Zytokininduktion von der Replikation von RSV abhängt. PBMCs wurden mit lebendem oder durch Beta-Propal-Lacton inaktiviertem RSV stimuliert, wie in den Grafiken dargestellt; sowohl lebendes als auch inaktiviertes RSV induzierte die Produktion proinflammatorischer Zytokine. Beachten Sie, dass Experimente mit RSV in einem生物-Sicherheitswerkbank in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 durchgeführt werden müssen.Außerdem ist es wichtig, bei der Anwendung dieser Methode darauf zu achten, während des gesamten Verfahrens endotoxinfreie Reagenzien und Materialien zu verwenden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie humane PBMCs mit RSV stimuliert werden können, und über mehrere Assays, die zur Analyse der Immunantwort verwendet werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der Immunantworten von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes auf eine Infektion mit humanen respiratorischen Synzytialviren (Video) | JoVE Journal

Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der Immunantworten von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes auf eine Infektion mit humanen respiratorischen Synzytialviren

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