Name: Anti-Krebs-Metall-Komplexe: Synthese und Zytotoxizität Bewertung durch die MTT-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Lernen Sie die Synthese luftempfindlicher Titan- und Vanadium-Antikrebsmittel sowie die Bewertung ihrer Zytotoxizität gegenüber menschlichen Krebszelllinien mittels MTT-Assay.

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Die Finanzierung wurde von der Europäischen Forschungsrates des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft (FP7/2007-2013) empfangen / ERC-Finanzhilfevereinbarung Nr. [239603]

<ol><li> Vorbereitung des V (V)-Komplex (Abbildung 2); 18 Schritte 1.1-1.4 Verhalten in einem Handschuhkasten, wenn ein Handschuhfach nicht verfügbar ist, fahren Sie mit der alternativen Schritte 2 (2,1 bis 2,6). <ol><li> Man löst 0.42 mmol des Liganden L H 2 in trockenem THF und unter Rühren zu einer Lösung äquivalenter Mengen VO (O i Pr) 3 in THF hinzu. </li><li> Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 15 min und entfernt die flüchtigen Bestandteile im Vakuum. </li><li> In kaltem Hexan und entfernen Sie es unter Vakuum. Ein dunkelviolett Pulver sollte in einer quantitativen Ausbeute erhalten werden. </li><li> Wiegen 8 mg der erhaltenen Verbindung in ein Eppendorf-Röhrchen. Fahren Sie mit Schritt 3. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die V (V)-Komplex mit einem Schlenk-Linie. <ol><li> Lösen 0,42 mmol des Liganden H 2 L in trockenem THF in einem trockenen Schlenk-Kolben mit einem Septum Kappe, bringen zu einem Schlenk-und Wechsel gelten Vakuum / Inertgas (N 2 oder Ar)-Umgebungen, empfiehlt es sich, drei s geltenuch Runden und warten 2-5 min auf den Vakuumstufen. </li><li> In trockenem THF über eine Spritze durch das Septum Kappe. </li><li> Hinzufügen äquivalente Mengen VO (O i Pr) 3 in einer THF-Lösung, die in ähnlicher Weise durch Einhaken eines richtigen trockenen Schlenk-Kolben mit der Leitung, Anlegen einer inerten Umgebung und das Hinzufügen der Reagenzien mittels einer Spritze aus der Vanadiumlösung zu der hergestellt worden war, der Ligand. </li><li> Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 15 min und entfernt die flüchtigen Bestandteile unter Vakuum, wenn es ein Anliegen der instabilen Produkten, führen Schlenk Art Destillation der flüchtigen Bestandteile unter einer inerten Atmosphäre, die Nutzung inerten Gasstrom auf die erforderliche Glaswaren, die vorgetrocknet worden war befestigen . </li><li> In kaltem Hexan und entfernen Sie es unter Vakuum. Ein dunkelviolett Pulver sollte in einer quantitativen Ausbeute erhalten werden. </li><li> Wiegen 8 mg der erhaltenen Verbindung in ein Eppendorf-Röhrchen. </li></ol></li><li> Herstellung der Ti (IV)-Komplex (Fig. 2); 28 </sbis&gt; Verhalten Schritte 3.1-3.3 in einem Handschuhkasten, wenn ein Handschuhfach nicht verfügbar ist, stellen Sie die Alternative Schritte für die Vanadium-Analogon (Schritt 2), die anstelle einer Schlenk-beschäftigen diskutiert. <ol><li> Man löst 0.35 mmol des Liganden L H 2 in trockenem THF und unter Rühren zu einer Lösung äquivalenter Mengen von Ti (O i Pr) 4 in THF hinzu. </li><li> Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Entfernen der flüchtigen Bestandteile unter Vakuum zu einem gelben Produkt in quantitativer Ausbeute zu ergeben. </li><li> Wiegen 8 mg der erhaltenen Verbindung in Eppendorf Fläschchen. </li></ol></li><li> Herstellung von HT-29-Zellen 96-Well-Platte <ol><li> Kultur HT-29-Zellen in einer 75 cm 2-Kolben mit RPMI-1640-Medium, das 1% Penicillin / Streptomycin-Antibiotika, 1% L-Glutamin und 10% fötalem Rinderserum (FBS), bei 37 ° C mit 5% CO 2 enthält, . </li><li> Entfernen Sie das Medium, wenn die HT-29-Zellen erreichen maximale Konfluenz (90-100%, alle 3-4 Tage ohne Subkultur). Waschen mit 1 mlTrypsin (0,25%) / EDTA (0,05%)-Lösung und entfernen. </li><li> 1 ml Trypsin (0,25%) / EDTA (0,05%)-Lösung und Inkubation für 5 min. </li><li> Lösen Sie die HT-29-Zellen aus dem Kolben und 10 ml des Mediums, um die Trypsin-Aktivität zu deaktivieren. Jeweils 5 ml der Zellen-Gemisch zu einer Röhre. </li><li> Verwenden Pipette ein paar Tropfen der Mischung in Zellen Zähler Kammer übertragen. Der Zähler Kammer 5 x 5 Quadrate. </li><li> Zählen Sie die Zellen in 5 repräsentative Quadrate mit einem Mikroskop: Die 4 Quadrate in den Ecken und die eine, die in der Mitte ist. </li><li> Berechnen Sie die geschätzte Menge der Zellen vorhanden. Addieren Sie die Zellen in den fünf repräsentativen Plätzen und teilen durch 20. </li><li> Teilen 0,6 durch das Ergebnis von Schritt 4.7. Die empfangene Nummer ist die Menge des Zellgemisches pro Platte erforderlich. Diese Berechnung bezieht sich auf eine Platte, die 0,6 x 10 6 Zellen (9000 Zellen pro Vertiefung) enthält. </li><li> Verwenden Pipette, die Menge des Zellgemisch pro p erforderlich übertragenEnde (wie in Abschnitt 4.8 berechnet) und fügen 13,2 ml Medium (200 ul pro Well × 66 Vertiefungen). </li><li> Fügen Sie die Mischung auf 96-Well-Platte mit 11-Kanal-Pipette (200 ul pro Well, 6 Zeilen, 66 Brunnen insgesamt). Ein gut jeder Zeile sollte für leere Steuer leer bleiben. </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 24 Stunden, damit die Zellen an der Platte zu befestigen. </li></ol></li><li> Einführen der Verbindungen <ol><li> Nach Zugabe von 200 ul (oder andere Menge entsprechend dem gewünschten Konzentrationsbereich) trockenes THF zu 8 mg jeder Verbindung gewogen, wie in Schritt 1.4 (oder 2.6) und 3.3 beschrieben. Wiegen 8 mg des Liganden L 2 H, zu. </li><li> Verdünnen Sie jede Verbindung Lösung durch Zugabe von 60 ul THF in 9 verschiedenen Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Transfer mit einer Pipette 60 ul der Mischung in Abschnitt 5.1 zur ersten Eppendorf-Röhrchen, resuspendieren und 60 ul Über zum nächsten Fläschchen, und so weiter, bis 10 verschiedene Konzentrationen obtained (einschließlich der Mutter Mischung in Abschnitt 5.1). </li><li> Verdünne 20 &amp;mgr; l jeder Konzentration in THF mit 180 &amp;mgr; l Medium. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung mit nur Steuer THF; 20 ul THF mit 180 ul Medium in jeder Messung. </li><li> Hinzufügen von 10 &amp;mgr; l der resultierenden Lösung (einschließlich des Steuer THF), zu jeder Vertiefung, das bereits 200 ul der oben erwähnten Lösung von Zellen in dem Medium bis zu einer Endkonzentration der Verbindung von bis zu 200 mg / l zu ergeben (die Konzentrationsbereich nach der Verbindung Aktivität) verändert werden. </li><li> Sie können etwas Niederschlag auf dem höchsten je nach Löslichkeit der Verbindung angewendet Konzentration zu beobachten. </li><li> Wiederholen Sie jede Messung der Verbindung 3x (3 Linien in der Platte der gleichen Verbindung), jede Zeile enthält: Zellen mit der Verbindung in 10 verschiedenen Konzentrationen, 1 Vertiefung, die Zellen mit Lösungsmittel nur zur Steuerung und ein gut behandelt ohne Zellen für leere behandelt Kontrolle. </li><li> Inkubieren der geladenen Platte für 3 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2-Atmosphäre. </li></ol></li><li> Zytotoxizität Messung unter Verwendung des MTT-Assays <ol><li> Vorbereitung der MTT-Lösung durch Zugabe von 1 g Pulver auf eine MTT 200 ml einer Lösung von RPMI-1640-Medium ohne Phenolrot. Die Stammlösung kann bis zu 15-ml-Röhrchen aufgeteilt und in -20 ° C gelagert werden </li><li> In 20 ul MTT-Lösung in jede Vertiefung mit 11-Kanal-Pipette (außer in den leeren Brunnen ohne Kontrolle der Zellen aus Schritt 4.10) und Inkubation der Platte für weitere 3 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die mittlere Lösung aus jeder Vertiefung. </li><li> In 200 ul Isopropanol in jede Vertiefung zu Formazan aufzulösen. Rühren Sie die Platte für 0,5 Stunden, bis Homogenität erreicht ist. </li><li> Die Absorption bei 550 nm für 200 ul des oben genannten Lösung mit einem Mikroplatten-Reader Spektralphotometer. </li><li> Wiederholen Sie jede Messung (das sind 3 Wiederholungen, siehe Schritt 5.8) auf drei verschiedenen Tagen. </li><li> Berechnen Sie ter Anteil der Lebensfähigkeit der Zellen durch den Abzug der Blindkontrolle Absorptionswert aus dem Messwert und teilt das Ergebnis durch die Absorption der Lösungsmittel THF Steuerwert multipliziert mit 100%. </li><li> Berechnen Sie IC 50-Werte mit GraphPad Prism-Software (oder gleichwertig). </li><li> Die berichteten IC 50 ist der Durchschnitt der IC50-Werte an mindestens drei verschiedenen Tagen gesammelt, und der Fehlerwert ist die Standardabweichung. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, sie haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Methode kombiniert die chemische Synthese mit biologischen Zelllebensfähigkeitstest. Wie bei allen biologischen Methoden zur lebensfähigen Zellen, ist es wichtig, in einer laminaren Haube arbeiten und sterilen Bedingungen, einschließlich der Verwendung von sterilen organischen Lösungsmitteln zu halten. Auch sollte der Herstellung und Lagerung von hydrolytisch instabilen Metall basierte Medikamente unter inerten Bedingungen durchgeführt werden, für das Handschuhfach oder-Schlenk-Te...

Die Chemotherapie ist immer noch eines der Hauptgerichte von Behandlungen in der Klinik für verschiedene Krebserkrankungen eingesetzt und damit überwiegende Teil der Forschung wird weltweit mit dem Ziel, neue und verbesserte Krebsmedikamente entwickeln, durchgeführt. Solche Studien beginnen meist in der chemischen Ebene, mit der Gestaltung und Herstellung von Verbindungen, gefolgt von biologischen Auswertung der zytotoxischen Eigenschaften in vitro. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch verschiedene Tests, die Informationen über die Zellaktivität bieten 1-2 bewertet werden. Cisplatin ist ein Beispiel eines Platinkomplexes, der weitgehend als chemotherapeutisches Arzneimittel, die als eine effiziente Behandlung hauptsächlich für Hoden-und Eierstockkrebs 3-4 verwendet wird. , Seinen engen Aktivitätsbereich und schwere Nebenwirkungen auslösen, jedoch Studien anderer potenter Übergangsmetallkomplexe 5-8. Unter anderem Titan (IV) und Vanadium (V)-Komplexe zeigten vielversprechende Ergebnisse mit hoher Aktivität und reduzierteToxizität 16.9. Ti (IV)-Komplexe waren die ersten klinischen Studien nach Cisplatin aufgrund dieser Eigenschaften geben, allerdings haben sie die Studien aufgrund Formulierungsschwierigkeiten und hydrolytische Instabilität fehlgeschlagen. Es besteht daher ein Bedürfnis, verbesserte Strom Derivate dieser Metallkomplexe, die eine hohe Anti-Krebs-Aktivität mit Wasserbeständigkeit 15,17-21 kombinieren entwickeln. Eine Herausforderung bei der Herstellung der Ti (IV) und V (V)-Komplexe bezieht sich auf die hydrolytische Instabilität der Vorläuferreagenzien, daher inerte Atmosphäre aufrechterhalten werden. Die Herstellung der Ti (IV) und V (V)-Verbindungen wird unter N 2 oder Ar Bedingungen in einem Handschuhfach oder unter Verwendung von Schlenk-Techniken durchgeführt. Test - Ein übliches Verfahren zur Bewertung der Anti-Krebs-Aktivität basiert auf dem MTT-((4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid 3) bezogen. Dieser Test ist ein Test, der farbmetrischen Rentabilität im Jahr 1983 von Mosmann präsentiert wurde22. Es ist sehr gut untersucht und charakterisiert, und es wird als sehr leistungsfähig bei der Beurteilung der Wirksamkeit der neuen zytotoxischen Verbindungen aufgrund ihrer Präzision, Schnelligkeit und seine Fähigkeit, auf einer Vielzahl von Zelllinien verwendet werden. Diese Lebensfähigkeit Assay basiert auf der Farbänderung des MTT-Molekül, wenn es um lebensfähigen Zellen ausgesetzt basiert. Messung der Absorption bestimmt, die proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen ist, und der Vergleich zu unbehandelten Kontrollen, erlaubt die Beurteilung der Zellwachstumshemmung Fähigkeiten der getesteten Verbindung. Der MTT-kolorimetrischen Assay wird in 96-Well-Plattenformat 23 geleitet. Die Zellen können Vorinkubation in den Vertiefungen vor der Zugabe des getesteten Arzneimittels erforderlich. Die Vorinkubation Zeiten 0-24 Stunden nach der Zelllinie Eigenschaften variieren. Die Zellen werden in der Regel auf die Droge für 24-96 Stunden in Abhängigkeit von der Wirkstoffaktivität ausgesetzt. MTT-Lösung wird dann zu der behandelten Zellen, in denen die Schrei hinzugefügtow MTT zu Formazan lila durch eine Vielzahl von mitochondrialer und cytosolischer Enzyme, die in betriebsfähiger Zellen (Fig. 1) 24 verringert. Der MTT-Molekül nicht durch tote Zellen oder roten Blutzellen (metabolisch inaktiven Zellen) Milzzellen (ruhende Zellen) und Concanavalin A-stimulierten Lymphozyten (aktivierte Zellen) 22 verringert. Nach 3-4 h Inkubation mit MTT Formazan die Niederschläge. Die Bildung des Formazan beginnt nach 0,5 h Inkubation aber für optimale Ergebnisse ist es am besten, um die Zellen zu MTT für mindestens 3 h 22 freizulegen. Folglich wird das Wachstumsmedium entfernt und die Formazan wird in einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt Isopropanol 25 gelöst, obwohl DMSO kann auch verwendet werden 26. Die Beseitigung des Mediums ist für genaue Ergebnisse zu erzielen, da Phenolrot, die in Wachstumsmedium weit verbreitet ist, und Ausfällen von Proteinen mit der Absorptionsmessung 25 stören. Wenn die formaZan homogene Lösung erreicht, die Absorption der Lösung wird unter Verwendung eines Mikroplatten-Lese Spektrophotometer gemessen. Die Absorption bei 550 nm ist direkt proportional zur Anzahl der Zellen im Bereich von 200-50,000 Zellen pro Vertiefung, und somit können sehr kleine Mengen von 22 Zellen nachgewiesen werden. Die Absorption zeigt die Menge an lebensfähigen Zellen, die nach der Behandlung mit dem Arzneimittel blieb, und ist mit der Absorption von Kontrollzellen, die nicht mit dem Arzneimittel ausgesetzt waren, verglichen. Analyse der Ergebnisse durch geeignete Software stellt die IC 50 (Inhibierung Konzentration, 50%)-Werte und ihre statistische Fehler auf der Grundlage mehrerer Wiederholungen der Messung. Der MTT-Assay ist weit verbreitet in Zytotoxizitätsuntersuchungen für das Screening neuer Antikrebsverbindungen aufgrund ihrer relativen Einfachheit und Genauigkeit. Jedoch bei der Verwendung des MTT-Tests, die auf enzymatische Reaktion abhängig ist, man bedenken muß, daß verschiedene Enzyminhibitoren können die Reduktion von MTT Affektd zu falschen Ergebnissen führen 27. Darüber hinaus bedeutet das MTT-Assay keine Information über den molekularen Mechanismus der zytotoxischen Aktivität des Wirkstoffs 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz/Material</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td>Biological Industries <td>04-007-1A</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hexan AR</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>Getrocknet mit einem Lösungsmitteltrocknungssystem</td></tr><tr><td>HT-29 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol AR</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Antibiotika</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 mit Phenolrot mit L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ohne Phenolrot</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>mit einem Lösungsmitteltrocknungssystem getrocknet</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>feuchtigkeitsempfindliches</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>Feuchtigkeit sensitive</td></tr><tr><td colspan="4">Ausrüstung</td></tr><tr><td>12-Kanal-Pipette 30-300 &mu; l</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-Kanal-Pipette 5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kolben</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit Deckel (flacher Boden)</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Binder</td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>Gegenkammer</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Fläschchen</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschuhfach</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader Spektralphotometer</td><td>Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 20-200 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette 5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anti-krebs-metall-komplexe: synthese und zytotoxizität bewertung durch die mtt-assay

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titan (IV) und Vanadium (V)-Komplexe sind hochwirksamen Antikrebsmittel. Eine Herausforderung bei ihrer Synthese bezieht sich auf ihre hydrolytische Instabilität, deshalb sollte deren Herstellung unter einer inerten Atmosphäre durchgeführt werden. Bewertung der Antitumor-Aktivität dieser Komplexe können durch den MTT-Assay erzielt werden. Der MTT-Test ist ein kolorimetrischer Assay, der auf Lebensfähigkeit enzymatischen Reduktion von MTT zu Formazan-Molekül, wenn es um lebensfähigen Zellen ausgesetzt ist. Das Ergebnis der Reduzierung ist ein Farbwechsel des MTT-Molekül. Absorptionsmessungen relativ zu einem Regler zum Einstellen des Prozentsatzes der verbleibenden lebensfähigen Krebszellen nach der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen einer Testverbindung, die Aktivität gegen Krebs der Verbindung und ihrer IC 50-Werte umgerechnet wird. Der MTT-Assay ist in Zytotoxizität Studien aufgrund ihrer Genauigkeit, Schnelligkeit und relative Einfachheit weit verbreitet. Hier stellen wir vorschickte detailliertes Protokoll für die Synthese von luftempfindlichen Metall basierte Medikamente und die Lebensfähigkeit der Zellen-Messungen, einschließlich der Vorbereitung der Zellplatten, die Inkubation der Verbindungen mit den Zellen, die Lebensfähigkeit Messungen unter Verwendung des MTT-Tests, und die Bestimmung der IC 50-Werte.

Die Komplexe wurden basierend auf den festgelegten Verfahren 18,28 und ihre Reinheit durch NMR und Elementaranalyse ausgewertet werden vorbereitet. Die aus dem MTT-Test erhaltenen Daten analysiert, um die Zytotoxizität der Verbindung 18,21 auszuwerten. Zunächst Subtraktion des Blindkontrolle Absorptionswert von allen anderen Werten durchgeführt wird. Zweitens wird das Lösungsmittel THF Steuerwert auf 100% Rentabilität eingestellt, da keine wachstumshemmende Verbindung w...

Verfahren zur Synthese von luftempfindlichen Titan-und Vanadiumantikrebsmitteln wird beschrieben, zusammen mit der Bewertung der zytotoxischen Aktivität gegenüber menschlichen Krebszelllinie mit dem MTT-Assay.

Anti-Krebs-Metall-Komplexe: Synthese und Zytotoxizität Bewertung durch die MTT-Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, metallhaltige Arzneistoffe gegen Krebs herzustellen und ihre Zytotoxizität mittels des MTT-Assays zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst metallbasierte Antikrebsverbindungen synthetisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, 96-Well-Platten mit Krebszellen vorzubereiten.Anschließend werden metallbasierte Anti-Krebs-Verbindungen in die Krebszellen eingebracht. Im letzten Schritt wird die Zellviabilität mittels des MTT-Assays gemessen, bei dem die Reduktion von MTT durch mitochondriale und zytoplasmatische Enzyme zur Bildung von Formazan gemessen wird, was letztendlich die Anti-Krebs-Aktivität und die halbmaximale hemmende Konzentration widerspiegelt. Die IC50-Werte der Verbindungen werden ermittelt.Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es sich um ein mehrstufiges Verfahren handelt, das die vollständige Aufmerksamkeit des Laborarbeiters erfordert und strikt zeitlich geplant ist. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Herstellung der Zellplatte nicht einfach ist, da das Arbeiten mit lebensfähigen Zellen bestimmte Richtlinien erfordert. Arbeiten Sie in einer Handschuhbox und stellen Sie den Vanadium-Pentakomplex her, indem Sie 0,42 Millimol des Ligandenvorstufen in trockenem THF lösen.Danach zu einer gerührten Lösung äquivalenter Mengen Vanadiumtris(isopropoxid) in THF hinzufügen. Das Reaktionsgemisch 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren umsetzen, anschließend die Flüchtigen unter Vakuum abziehen. Danach kaltes Hexan zugeben und erneut unter Vakuum entfernen.Es sollte ein dunkelviolettes Pulver in quantitativer Ausbeute erhalten werden. Wiegen Sie acht Milligramm der erhaltenen Verbindung in ein Epi- oder Vialgefäß ab. Zur Herstellung des Titancarbons l&ouml;sen Sie 0,35&nbsp;Millimol des Ligandenvorstufen in trockenem THF und geben diese L&ouml;sung zu einer ger&uuml;hrten L&ouml;sung mit &auml;quivalenten Mengen an Titan-tetraisopropoxid in THF hinzu.Rühren Sie das Reaktionsgemisch zwei Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend entfernen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um ein gelbes Produkt in quantitativer Ausbeute zu erhalten. Wiegen Sie acht Milligramm der erhaltenen Verbindung in einem Eppendorf-Röhrchen ab, um HT 29-Zellen in einer 96-Well-Platte für die Erstkultur vorzubereiten.Die Zellen in einem 75 Quadratzentimeter großen Kolben, wie im Textprotokoll beschrieben, das Medium entfernen, wenn die HT 29-Zellen maximale Konfluenz erreicht haben. Nach dem Waschen der Zellen mit einem Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung ein Milliliter derselben Lösung hinzufügen und fünf Minuten lang inkubieren. Die HT 29-Zellen vom Kolben lösen und 10 Milliliter Medium hinzufügen, um die Trypsinaktivität zu stoppen.Übertragen Sie fünf Milliliter der Zellmischung in ein Reagenzglas. Übertragen Sie mithilfe einer Pipette einige Tropfen der Zellmischung in eine Zählkammer. Die Zählkammer besteht aus zwei Teilen mit jeweils fünf mal fünf Quadraten.Zählen Sie die Zellen in fünf repräsentativen Quadraten jedes Teils mithilfe eines Mikroskops. Vier Quadrate in den Ecken und ein Quadrat in der Mitte. Berechnen Sie die geschätzte Anzahl der vorhandenen Zellen.Addieren Sie die Zellen in den fünf repräsentativen Quadraten jedes Teils. Berechnen Sie den durchschnittlichen Summenwert der beiden Teile und dividieren Sie diesen durch 20. Anschließend dividieren Sie 0,6 durch den Quotienten.Die erhaltene Zahl entspricht der Menge der Zellmischung, die pro Platte benötigt wird. Diese Berechnung bezieht sich auf eine Platte mit 9.000 Zellen pro Vertiefung. Geben Sie mithilfe einer Pipette die pro Platte benötigte Menge der Zellmischung zu 13,2 Milliliter Medium hinzu.Geben Sie die Mischung in eine 96-Loch-Platte. Verwenden Sie eine 11-Kanal-Pipette mit 200 µL pro Loch über sechs Zeilen mit insgesamt 66 Löchern. Ein Loch pro Zeile sollte für die Leerprobe frei bleiben.Die Platte 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren, damit die Zellen an der Platte anhaften. Um die Verbindungen zunächst einzufügen, 200 Mikroliter trockenes THF zu acht Milligramm der Wirkstoffverbindung hinzufügen. Die Verbindungslösung weiter verdünnen, indem zunächst 60 Mikroliter THF in neun verschiedene Eppendorf-Gefäße gegeben werden. Für jede Lösung 60 Mikroliter der Verbindungslösung mittels Pipette in das erste Eppendorf-Gefäß überführen.Danach erneut suspendieren und 60 Mikroliter in das nächste Gefäß überführen, und so weiter, bis 10 verschiedene Konzentrationen erhalten sind. Verdünnen Sie anschließend jeweils 20 Mikroliter jeder Konzentration in THF mit 180 Mikrolitern Medium. Bereiten Sie außerdem eine Kontrolllösung mit nur Lösungsmittel vor, indem Sie 20 Mikroliter THF zu 180 Mikrolitern Medium hinzufügen.Fügen Sie anschließend 10 Mikroliter von jeder resultierenden Lösung in jedes Brunnen hinzu, das bereits 200 Mikroliter der oben genannten Zelllösung im Medium enthält, um Endkonzentrationen der Verbindung von bis zu 200 Milligramm pro Liter zu erreichen. Jede Reihe enthält Zellen, die mit der Verbindung in 10 unterschiedlichen Konzentrationen behandelt wurden.Ein Kontrollkolben mit Zellen, die nur mit Lösungsmittel behandelt wurden, und ein Kolben ohne Zellen für die Leerprobe. Richten Sie die Reihen so ein, dass jede Messung der Verbindung dreimal wiederholt wird. Inkubieren Sie die beladene Platte drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Bereiten Sie die MTT-Lösung wie im Textprotokoll beschrieben unter Verwendung einer 11-Kanal-Pipette vor.Fügen Sie 20 µL MTT-Lösung zu jedem Well hinzu, außer zu den leeren Kontrollwells. Inkubieren Sie die Platte weitere drei Stunden nach der Inkubation. Entfernen Sie die Mediumlösung aus jedem Well und geben Sie 200 µL Isopropanol zu jedem Well hinzu. Um das Formin aufzulösen, mischen Sie die Probe 30 Minuten lang, bis eine homogene Lösung vorliegt. Messen Sie die Absorption bei 550 Nanometern für 200 Mikroliter der homogenen Lösung mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts oder eines Spektralphotometers, wobei jede Messung an drei verschiedenen Tagen dreifach wiederholt wird. Berechnen Sie anschließend den Prozentsatz der Zellviabilität, indem Sie den Absorptionswert der Leerprobe vom gemessenen Wert subtrahieren, das Ergebnis durch den Absorptionswert der THF-Lösungsmittelkontrolle dividieren und mit 100 % multiplizieren. Ermitteln Sie die halbmaximale hemmende Konzentration (IC50-Werte) mithilfe einer geeigneten Software zur Kurvenanalyse.Die angegebene IC50 ist der Durchschnitt aller IC50-Werte, die an mindestens drei verschiedenen Tagen erhoben wurden, und der Fehlerwert entspricht der Standardabweichung. Die aus dem MTT-Assay erhaltenen Daten werden analysiert, um die Zytotoxizität der Substanz zu bewerten. Die Messungen sollten über einen Konzentrationsbereich durchgeführt werden, der eine Grafik mit gleichmäßiger Punktverteilung ergibt, mit mindestens drei Punkten auf jeder Plattform und drei Punkten zur Definition der Steigung.Unzureichende Messungen bei hohen oder niedrigen Konzentrationen beeinträchtigen die nichtlineare Regressionsanpassung der Kurve, die zur Bestimmung der IC50-Werte erforderlich ist, und verringern dadurch deren Genauigkeit. Die mittels nichtlinearer Regressionsanpassung ermittelten relativen IC50-Werte entsprechen den Konzentrationen, die zu einer 50%igen Hemmung des durch die getestete Verbindung erzielbaren Zellwachstums führen. Dies wird als Mittelwert zwischen der maximalen und der minimalen gemessenen Zellviabilität berechnet, die nicht notwendigerweise 100 % bzw. 0 % betragen.Bei der Auswertung der Ergebnisse der im Protokoll beschriebenen Experimente zeigt sich, dass Cisplatin sowie die Titan- und Vanadiumkomplexe eine hohe Aktivität aufweisen. Auffällig ist außerdem, dass je näher der maximale Hemmwert einer gegebenen Verbindung an 100 % liegt, desto näher der relative IC50-Wert an dem absoluten liegt, wenn die IC50-Werte zwischen den verschiedenen Verbindungen verglichen werden.Der Titanvierfachkomplex weist die höchste Zytotoxizität auf, und seine IC50-Werte liegen niedriger als die von Cisplatin und dem Vanadiumfünfkomplex. Der freie Ligand zeigt hingegen eine deutlich verminderte Aktivität, da nach Zugabe des Liganden in unterschiedlichen Konzentrationen die Zellviabilität nicht so stark abnimmt wie bei dessen Komplexen.Dies stellt sicher, dass die hohe Anti-Krebs-Aktivität der Komplexe auf den Metallzentren beruht, während dieser Verfahren durchgeführt wird. Es ist wichtig, zu jeder Zeit sterile Bedingungen beizubehalten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Zytotoxizität Ihrer Anti-Krebs-Verbindungen mittels des M-T-T-S-A. beurteilen können.

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Forschung

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Chemistry

Chemie

Der MTT-Test ist eine einfache und reproduzierbare Farbtestverfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen basiert auf Reduktion der gelben MTT und Produktion von wasserunlöslichen Formazan lila. Hier hat sich die Rentabilität der MCF-7 Zellen nach Behandlung von nanogenomedicine ausgewertet worden.

Zelluläre Toxizität von Nanogenomedicine in MCF-7 Zelllinie: MTT-Assay

Dieses Video beschreibt den kolorimetrischen Assay, Methylthiazol-Tetrazolium (MTT) Assay, um die arzneimittelinduzierte Zytotoxizität in Krebszellen zu messen und ihre metabolische Aktivität zu bestimmen. Dieser Assay basiert auf der metabolischen Umwandlung von Tetrazoliumsalzen in farbige Produkte, die die mitochondriale Aktivität der Zellen widerspiegeln.

Methylthiazolyltetrazolium oder MTT-Assay: ein kolorimetrischer Assay zur Messung der Arzneimittelresistenz durch Bestimmung der Stoffwechselaktivität in Krebszellen

Hier wird die Echtzeitüberwachung des Tumorzellstoffwechsels, kombiniert mit einem in vivo Modell der Chorio-Allantoismembran (CAM) der Metastasierung von Hühnerembryonen, verwendet, um neuartige Anti-Krebs-Ziele/Wirkstoffe auf ihre Fähigkeit hin zu bewerten, Tumorzellen für DNA-schädigende Chemotherapeutika zu sensibilisieren.

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Dieses Protokoll beschreibt die Synergien zwischen einem Anti-Krebs-Antikörper und Zytostatika in präklinischen Modellen zu bewerten, indem Sie unter Verwendung der Kombination Index Gleichung von Chou und Talalay.

Potenzierung der Anti-Krebs-Antikörper-Wirksamkeit von Zytostatika: Nachweis von Antikörper-Wirkstoff-Synergismus mit der Kombination-Index-Gleichung

Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.

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Diese Methodik zielt darauf ab, die Zytotoxizität von Biomaterialien durch die Herstellung löslicher Extrakte unter Verwendung von Viabilitätstests und phänotypischen Analysen, einschließlich Durchflusszytometrie, RT-PCR, Immunzytochemie und anderen zellulären und molekularbiologischen Techniken, zu bewerten.

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Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.

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Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.

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In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Identifizierung von Verbindungen vor, die den ADCC-Mechanismus, einen wichtigen Krebszell-Abtötungsmechanismus von Antitumor-Antikörpern, modulieren. Die zytotoxische Wirkung von NK-Zellen wird in Brustkrebszell-Sphäroiden in Gegenwart von Trastuzumab gemessen. Die Bildanalyse identifiziert lebende und tote Killer- und Zielzellen in Sphäroide.

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In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für einen Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizitäts-Assay (ADCC) unter Verwendung eines ADCC-Bioassay-Kits vor. Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug, um den ADCC-Mechanismus aufzuklären und das therapeutische Potenzial von Antikörpern in der Krebsimmuntherapie zu bewerten.

Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays

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