Anti-Krebs-Metall-Komplexe: Synthese und Zytotoxizität Bewertung durch die MTT-Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung von Krebsmedikamenten gegen Metallo und die Bewertung ihrer Zytotoxizität durch den MTT-Assay. Dies wird erreicht, indem zunächst metallbasierte Anti-Krebs-Verbindungen synthetisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, 96-Well-Platten mit Krebszellen vorzubereiten.

Anschließend werden die metallbasierten Anti-Krebs-Wirkstoffe in die Krebszellen eingebracht. Der letzte Schritt besteht darin, die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem MTT-Assay zu messen, wobei die Reduktion von MTT durch mitochondriale und zytosolische Enzyme zur Bildung von Zen gemessen wird, letztendlich die Anti-Krebs-Aktivität und die halbe maximale Hemmkonzentration. Oder ich sehe, dass 50 Werte der Verbindungen bestimmt werden.

Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es sich um ein mehrstufiges Verfahren handelt, das die volle Aufmerksamkeit des Labormitarbeiters erfordert und einem strengen Zeitplan unterliegt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Vorbereitung der Zellplatte nicht einfach ist, da die Arbeit mit lebensfähigen Zellen die Befolgung bestimmter Richtlinien erfordert. Bereiten Sie den Vanadium-Fünf-Komplex in einer Handschuhbox vor, indem Sie 0,42 Millimol des Ligandenvorläufers in trockenem THF auflösen.

Dann wird es zu einer Rührlösung mit äquivalenten Mengen an Vanadium oder Trisisopoxid in THF gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor die flüchtigen Bestandteile unter Vakuum entfernt werden. Fügen Sie als nächstes ein kaltes Hexan hinzu und entfernen Sie es unter Vakuum.

Es sollte ein dunkelviolettes Pulver in einer quantitativen Ausbeute erhalten werden. Acht Milligramm der erhaltenen Verbindung werden in einer Durchstechflasche mit Epi orph gewogen. Zur Herstellung des Titan-Vier-Komplexes lösen Sie 0,35 Millimol des Ligandenvorläufers in trockenem THF und fügen Sie es einer Rührlösung hinzu, die den Mengen an Titantetraisopoxid in THF entspricht.

Das Reaktionsgemisch wird zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Entfernen Sie dann die flüchtigen Bestandteile unter Vakuum, um ein gelbes Produkt in quantitativer Ausbeute zu erhalten. Wiegen Sie acht Milligramm der erhaltenen Verbindung in einem Eph-Fläschchen, um HT 29-Zellen in einer ersten Kultur mit 96-Well-Platte vorzubereiten.

Die Zellen in einem 75-Quadratzentimeter-Kolben, wie im Textprotokoll beschrieben, entfernen das Medium, wenn die HT 29-Zellen die maximale Kofluenz erreichen. Nachdem Sie die Zellen in einem Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung gewaschen haben, fügen Sie einen Milliliter derselben Lösung hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Die HT-29-Zellen werden aus dem Kolben genommen und 10 Milliliter des Mediums zugegeben, um die Trypsinaktivität zu deaktivieren.

Übertragen Sie fünf Milliliter des Zellgemisches in ein Röhrchen. Füllen Sie mit einer Pipette einige Tropfen der Zellmischung in eine Gegenkammer um. Die Gegenkammer besteht aus zwei Teilen von fünf mal fünf Quadraten.

Zählen Sie die Zellen mit einem Mikroskop in fünf repräsentativen Quadraten jedes Teils. Vier Quadrate in den Ecken und ein Quadrat in der Mitte. Berechnen Sie die geschätzte Anzahl der vorhandenen Zellen.

Summieren Sie die Zellen in den fünf repräsentativen Quadraten jedes Teils. Berechnen Sie die durchschnittliche Summe der beiden Teile und dividieren Sie durch 20. Als nächstes dividieren Sie 0,6 durch den Quotienten.

Die empfangene Zahl ist die Menge an Zellmischung, die pro Platte benötigt wird. Diese Berechnung bezieht sich auf eine Platte, die 9.000 Zellen pro Vertiefung enthält. Mischen Sie mit einer Pipette die pro Platte benötigte Menge des Zellgemisches mit 13,2 Millilitern des Mediums.

Gib die Mischung auf eine 96-Well-Platte. Mit einer 11-Kanal-Pipette mit 200 Mikrolitern pro Vertiefung über sechs Linien mit insgesamt 66 Vertiefungen. Ein Well jeder Leitung sollte für das leere Steuerelement leer bleiben.

Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, damit sich die Zellen an der Platte anheften können, um die Verbindungen zuerst einzusetzen, fügen Sie 200 Mikroliter trockenes THF zu acht Milligramm der Gewichtsverbindung hinzu. Verdünnen Sie die Verbundlösung weiter, indem Sie zuerst 60 Mikroliter THF in neun verschiedene Einor-Dateien hinzufügen. Verwenden Sie für jede Lösung eine Pipette, um 60 Mikroliter aus der zusammengesetzten Lösung in die erste Einor-Datei zu übertragen.

Dann beleben, suspendieren und 60 Mikroliter in das nächste Fläschchen überführen und so weiter, bis 10 verschiedene Konzentrationen erreicht sind. Fahren Sie fort, 20 Mikroliter jeder Konzentration in THF mit 180 Mikrolitern Medium zu verdünnen. Bereiten Sie außerdem eine reine Lösungsmittelkontrolllösung vor, indem Sie 20 Mikroliter THF zu 180 Mikrolitern Medium hinzufügen.

Geben Sie als Nächstes 10 Mikroliter aus jeder resultierenden Lösung in jede Vertiefung. Diese enthält bereits 200 Mikroliter der oben genannten Lösung von Zellen in dem Medium, um Endkonzentrationen der Verbindung von bis zu 200 Milligramm pro Liter zu erhalten. Jede Linie enthält Zellen, die mit der Verbindung in 10 verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden.

Eine Kontrollvertiefung mit Zellen, die nur mit Lösungsmittel behandelt wurden, und eine Vertiefung ohne Zellen. Richten Sie für die Blindkontrolle die Linien so ein, dass jede Messung der Verbindung dreimal wiederholt wird. Inkubieren Sie die beladene Platte drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Bereiten Sie die MTT-Lösung wie im Textprotokoll beschrieben mit einer 11-Kanal-Pipette vor.

Geben Sie 20 Mikroliter MTT-Lösung in jede Vertiefung mit Ausnahme der blinden Kontrollvertiefungen. Inkubieren Sie die Platte nach der Inkubation weitere drei Stunden. Entfernen Sie die mittlere Lösung aus jeder Vertiefung und fügen Sie 200 Mikroliter Isopropanol in jede Vertiefung hinzu.

Um das Formin aufzulösen, rühren Sie die Platte 30 Minuten lang, bis sie homogen ist. Messen Sie die Extinktion bei 550 Nanometern für 200 Mikroliter der homogenen Lösung mit einem Mikroplatten-Reader, einem Spektralphotometer, das jede Messung an drei verschiedenen Tagen wiederholt. Berechnen Sie als Nächstes den Prozentsatz der Zellviabilität, indem Sie den Absorptionswert der Blindkontrolle vom gemessenen Wert abziehen, das Ergebnis durch die Absorption des THF-Lösungsmittelkontrollwerts dividieren und mit 100 % multiplizieren. Berechnen Sie die halben maximalen Hemmkonzentrationswerte mit Hilfe einer Grafiksoftware.

Der gemeldete IC 50 ist der Durchschnitt aller IC 50-Werte, die an mindestens drei verschiedenen Tagen erfasst wurden, und der Fehlerwert ist die Standardabweichung. Die vom MTT-Assay erhaltenen Daten werden analysiert, um die Zytotoxizität der Verbindung zu bewerten. Die Messungen sollten an einem Konzentrationsbereich durchgeführt werden, der ein Diagramm mit einer gleichmäßigen Punktverteilung von mindestens drei Punkten auf jedem Plateau und drei Punkten zur Definition der Steigung ergibt.

Unzureichende Messungen bei hohen oder niedrigen Konzentrationen beeinträchtigen die nichtlineare Regressionsanpassung der Kurve, die für die Bestimmung der IC 50-Werte erforderlich ist, und verringern damit deren Genauigkeit. Die relativen IC 50-Werte, die durch die nichtlineare Regressionsanpassung bestimmt werden, entsprechen den Konzentrationen, die zu 50 % der von der getesteten Verbindung möglichen Zellwachstumshemmung führen. Dies wird als Mittelpunkt zwischen der gemessenen maximalen und minimalen Zellviabilität berechnet, die nicht unbedingt 100 % bzw. 0 % betragen.

Bei der Einsichtnahme in die Ergebnisse der im Protokoll beschriebenen Versuche. Klar ist, dass sowohl Cisplatin als auch die Titan- und Vanadiumkomplexe hochaktiv sind. Es ist auch auffällig, dass je näher der maximale Hemmwert einer gegebenen Verbindung an 100 % liegt, desto näher ist der relative IC 50-Wert an dem absoluten, wenn man die IC 50-Werte zwischen den verschiedenen Verbindungen vergleicht.

Der Titan-Vier-Komplex weist die höchste Zytotoxizität auf und seine IC-50-Werte sind niedriger als die von Cisplatin und dem Vanadium-Fünf-Komplex. Der freie Ligand zeigt jedoch eine deutlich verringerte Aktivität, da der Ligand in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt wurde. Die Lebensfähigkeit der Zellen sinkt nicht so stark wie bei ihren Komplexen.

Dies stellt sicher, dass die hohe Anti-Krebs-Aktivität der Komplexe auf den Metallzentren beruht, während dieses Verfahren versucht wird. Es ist wichtig, jederzeit sterile Bedingungen einzuhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Zytotoxizität Ihrer Anti-Krebs-Wirkstoffe mit dem M-T-T-S-A bewerten können.