Name: Anti-Krebs-Metall-Komplexe: Synthese und Zytotoxizität Bewertung durch die MTT-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Lernen Sie die Synthese luftempfindlicher Titan- und Vanadium-Antikrebsmittel sowie die Bewertung ihrer Zytotoxizität gegenüber menschlichen Krebszelllinien mittels MTT-Assay.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Finanzierung wurde von der Europäischen Forschungsrates des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft (FP7/2007-2013) empfangen / ERC-Finanzhilfevereinbarung Nr. [239603]

<ol><li> Vorbereitung des V (V)-Komplex (Abbildung 2); 18 Schritte 1.1-1.4 Verhalten in einem Handschuhkasten, wenn ein Handschuhfach nicht verfügbar ist, fahren Sie mit der alternativen Schritte 2 (2,1 bis 2,6). <ol><li> Man löst 0.42 mmol des Liganden L H 2 in trockenem THF und unter Rühren zu einer Lösung äquivalenter Mengen VO (O i Pr) 3 in THF hinzu. </li><li> Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 15 min und entfernt die flüchtigen Bestandteile im Vakuum. </li><li> In kaltem Hexan und entfernen Sie es unter Vakuum. Ein dunkelviolett Pulver sollte in einer quantitativen Ausbeute erhalten werden. </li><li> Wiegen 8 mg der erhaltenen Verbindung in ein Eppendorf-Röhrchen. Fahren Sie mit Schritt 3. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die V (V)-Komplex mit einem Schlenk-Linie. <ol><li> Lösen 0,42 mmol des Liganden H 2 L in trockenem THF in einem trockenen Schlenk-Kolben mit einem Septum Kappe, bringen zu einem Schlenk-und Wechsel gelten Vakuum / Inertgas (N 2 oder Ar)-Umgebungen, empfiehlt es sich, drei s geltenuch Runden und warten 2-5 min auf den Vakuumstufen. </li><li> In trockenem THF über eine Spritze durch das Septum Kappe. </li><li> Hinzufügen äquivalente Mengen VO (O i Pr) 3 in einer THF-Lösung, die in ähnlicher Weise durch Einhaken eines richtigen trockenen Schlenk-Kolben mit der Leitung, Anlegen einer inerten Umgebung und das Hinzufügen der Reagenzien mittels einer Spritze aus der Vanadiumlösung zu der hergestellt worden war, der Ligand. </li><li> Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 15 min und entfernt die flüchtigen Bestandteile unter Vakuum, wenn es ein Anliegen der instabilen Produkten, führen Schlenk Art Destillation der flüchtigen Bestandteile unter einer inerten Atmosphäre, die Nutzung inerten Gasstrom auf die erforderliche Glaswaren, die vorgetrocknet worden war befestigen . </li><li> In kaltem Hexan und entfernen Sie es unter Vakuum. Ein dunkelviolett Pulver sollte in einer quantitativen Ausbeute erhalten werden. </li><li> Wiegen 8 mg der erhaltenen Verbindung in ein Eppendorf-Röhrchen. </li></ol></li><li> Herstellung der Ti (IV)-Komplex (Fig. 2); 28 </sbis&gt; Verhalten Schritte 3.1-3.3 in einem Handschuhkasten, wenn ein Handschuhfach nicht verfügbar ist, stellen Sie die Alternative Schritte für die Vanadium-Analogon (Schritt 2), die anstelle einer Schlenk-beschäftigen diskutiert. <ol><li> Man löst 0.35 mmol des Liganden L H 2 in trockenem THF und unter Rühren zu einer Lösung äquivalenter Mengen von Ti (O i Pr) 4 in THF hinzu. </li><li> Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Entfernen der flüchtigen Bestandteile unter Vakuum zu einem gelben Produkt in quantitativer Ausbeute zu ergeben. </li><li> Wiegen 8 mg der erhaltenen Verbindung in Eppendorf Fläschchen. </li></ol></li><li> Herstellung von HT-29-Zellen 96-Well-Platte <ol><li> Kultur HT-29-Zellen in einer 75 cm 2-Kolben mit RPMI-1640-Medium, das 1% Penicillin / Streptomycin-Antibiotika, 1% L-Glutamin und 10% fötalem Rinderserum (FBS), bei 37 ° C mit 5% CO 2 enthält, . </li><li> Entfernen Sie das Medium, wenn die HT-29-Zellen erreichen maximale Konfluenz (90-100%, alle 3-4 Tage ohne Subkultur). Waschen mit 1 mlTrypsin (0,25%) / EDTA (0,05%)-Lösung und entfernen. </li><li> 1 ml Trypsin (0,25%) / EDTA (0,05%)-Lösung und Inkubation für 5 min. </li><li> Lösen Sie die HT-29-Zellen aus dem Kolben und 10 ml des Mediums, um die Trypsin-Aktivität zu deaktivieren. Jeweils 5 ml der Zellen-Gemisch zu einer Röhre. </li><li> Verwenden Pipette ein paar Tropfen der Mischung in Zellen Zähler Kammer übertragen. Der Zähler Kammer 5 x 5 Quadrate. </li><li> Zählen Sie die Zellen in 5 repräsentative Quadrate mit einem Mikroskop: Die 4 Quadrate in den Ecken und die eine, die in der Mitte ist. </li><li> Berechnen Sie die geschätzte Menge der Zellen vorhanden. Addieren Sie die Zellen in den fünf repräsentativen Plätzen und teilen durch 20. </li><li> Teilen 0,6 durch das Ergebnis von Schritt 4.7. Die empfangene Nummer ist die Menge des Zellgemisches pro Platte erforderlich. Diese Berechnung bezieht sich auf eine Platte, die 0,6 x 10 6 Zellen (9000 Zellen pro Vertiefung) enthält. </li><li> Verwenden Pipette, die Menge des Zellgemisch pro p erforderlich übertragenEnde (wie in Abschnitt 4.8 berechnet) und fügen 13,2 ml Medium (200 ul pro Well × 66 Vertiefungen). </li><li> Fügen Sie die Mischung auf 96-Well-Platte mit 11-Kanal-Pipette (200 ul pro Well, 6 Zeilen, 66 Brunnen insgesamt). Ein gut jeder Zeile sollte für leere Steuer leer bleiben. </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 24 Stunden, damit die Zellen an der Platte zu befestigen. </li></ol></li><li> Einführen der Verbindungen <ol><li> Nach Zugabe von 200 ul (oder andere Menge entsprechend dem gewünschten Konzentrationsbereich) trockenes THF zu 8 mg jeder Verbindung gewogen, wie in Schritt 1.4 (oder 2.6) und 3.3 beschrieben. Wiegen 8 mg des Liganden L 2 H, zu. </li><li> Verdünnen Sie jede Verbindung Lösung durch Zugabe von 60 ul THF in 9 verschiedenen Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Transfer mit einer Pipette 60 ul der Mischung in Abschnitt 5.1 zur ersten Eppendorf-Röhrchen, resuspendieren und 60 ul Über zum nächsten Fläschchen, und so weiter, bis 10 verschiedene Konzentrationen obtained (einschließlich der Mutter Mischung in Abschnitt 5.1). </li><li> Verdünne 20 &amp;mgr; l jeder Konzentration in THF mit 180 &amp;mgr; l Medium. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung mit nur Steuer THF; 20 ul THF mit 180 ul Medium in jeder Messung. </li><li> Hinzufügen von 10 &amp;mgr; l der resultierenden Lösung (einschließlich des Steuer THF), zu jeder Vertiefung, das bereits 200 ul der oben erwähnten Lösung von Zellen in dem Medium bis zu einer Endkonzentration der Verbindung von bis zu 200 mg / l zu ergeben (die Konzentrationsbereich nach der Verbindung Aktivität) verändert werden. </li><li> Sie können etwas Niederschlag auf dem höchsten je nach Löslichkeit der Verbindung angewendet Konzentration zu beobachten. </li><li> Wiederholen Sie jede Messung der Verbindung 3x (3 Linien in der Platte der gleichen Verbindung), jede Zeile enthält: Zellen mit der Verbindung in 10 verschiedenen Konzentrationen, 1 Vertiefung, die Zellen mit Lösungsmittel nur zur Steuerung und ein gut behandelt ohne Zellen für leere behandelt Kontrolle. </li><li> Inkubieren der geladenen Platte für 3 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2-Atmosphäre. </li></ol></li><li> Zytotoxizität Messung unter Verwendung des MTT-Assays <ol><li> Vorbereitung der MTT-Lösung durch Zugabe von 1 g Pulver auf eine MTT 200 ml einer Lösung von RPMI-1640-Medium ohne Phenolrot. Die Stammlösung kann bis zu 15-ml-Röhrchen aufgeteilt und in -20 ° C gelagert werden </li><li> In 20 ul MTT-Lösung in jede Vertiefung mit 11-Kanal-Pipette (außer in den leeren Brunnen ohne Kontrolle der Zellen aus Schritt 4.10) und Inkubation der Platte für weitere 3 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die mittlere Lösung aus jeder Vertiefung. </li><li> In 200 ul Isopropanol in jede Vertiefung zu Formazan aufzulösen. Rühren Sie die Platte für 0,5 Stunden, bis Homogenität erreicht ist. </li><li> Die Absorption bei 550 nm für 200 ul des oben genannten Lösung mit einem Mikroplatten-Reader Spektralphotometer. </li><li> Wiederholen Sie jede Messung (das sind 3 Wiederholungen, siehe Schritt 5.8) auf drei verschiedenen Tagen. </li><li> Berechnen Sie ter Anteil der Lebensfähigkeit der Zellen durch den Abzug der Blindkontrolle Absorptionswert aus dem Messwert und teilt das Ergebnis durch die Absorption der Lösungsmittel THF Steuerwert multipliziert mit 100%. </li><li> Berechnen Sie IC 50-Werte mit GraphPad Prism-Software (oder gleichwertig). </li><li> Die berichteten IC 50 ist der Durchschnitt der IC50-Werte an mindestens drei verschiedenen Tagen gesammelt, und der Fehlerwert ist die Standardabweichung. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).</li>
<li>Hatok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+the+evaluation+of+drug+resistance+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells.</a> Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).</li>
<li>Wang, D., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processing+of+platinum+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular processing of platinum anticancer drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).</li>
<li>Muggia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platinum+compounds+30+years+after+the+introduction+of+cisplatin%3A+Implications+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).</li>
<li>Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+for+metal+complexes+with+anticancer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">New trends for metal complexes with anticancer activity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).</li>
<li>Ott, I., Gust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+platinum+metal+complexes+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+der+Pharmazie+%28Weinheim%22%5BJournal%5D)">Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs.</a> Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).</li>
<li>Desoize, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metals+and+metal+compounds+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metals and metal compounds in cancer treatment.</a> Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).</li>
<li>Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumour+metal+compounds%3A+more+than+theme+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Antitumour metal compounds: more than theme and variations.</a> Dalton Transactions. , 183-194 (2008).</li>
<li>Meléndez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+complexes+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Titanium complexes in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).</li>
<li>Evangelou, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanadium+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Vanadium in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).</li>
<li>Djordjevic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+vanadium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Metal+ions+in+biological+systems%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of vanadium compounds.</a> Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+titanium+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Patents%22%5BJournal%5D)">Anticancer titanium agents.</a> Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+titanium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Review+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antitumor titanium compounds.</a> Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).</li>
<li>Kostova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+and+vanadium+complexes+as+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Titanium and vanadium complexes as anticancer agents.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Titanium%28IV%29+Complexes%3A+Renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance.</a> European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).</li>
<li>Buettner, K. M., Valentine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinorganic+Chemistry+of+Titanium%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bioinorganic Chemistry of Titanium.</a> Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).</li>
<li>Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+antitumor+activity+of+highly+resistant+salan-titanium%28IV%29+complexes+in+nanoparticles%3A+an+identified+active+species%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).</li>
<li>Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+cytotoxic+vanadium%28V%29+complexes+of+salan+ligands%3B+insights+on+the+role+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis.</a> Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).</li>
<li>Tzubery, A., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+Hydrolysis+of+trans-Ti%28IV%29+Complexes+of+Salen+Ligands%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies.</a> Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Peri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+cytotoxic+titanium%28IV%29+complexes%3B+Insights+on+the+enigmatic+involvement+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis.</a> Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).</li>
<li>Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+cytotoxic+reagents+based+on+non-metallocene+non-diketonato+well-defined+C-2-symmetrical+titanium+complexes+of+tetradentate+bis%28phenolato%29+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cellular+Growth+and+Survival+-+Application+to+Proliferation+and+Cyto-Toxicity+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).</li>
<li>Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Toxicity+of+Nanogenomedicine+in+MCF-7+Cell+Line%3A+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1191(2009).</li>
<li>Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hepatic+subcellular+fractions+for+Alamar+blue+and+MTT+reductase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity.</a> Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cell-Growth+and+Survival+-+Modifications+to+the+Tetrazolium+Dye+Procedure+Giving+Improved+Sensitivity+and+Reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).</li>
<li>Alley, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+drug+screening+with+panels+of+human+tumor+cell+lines+using+a+microculture+tetrazolium+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.</a> Cancer Research. 48, 589-601 (1988).</li>
<li>Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+note+on+the+use+of+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">A practical note on the use of cytotoxicity assays.</a> International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).</li>
<li>Chmura, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+4+complexes+with+aminebisphenolate+ligands+and+their+application+for+the+ring+opening+polymerization+of+cyclic+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters.</a> Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).</li>
<li>Sebaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+accurate+EC50%2FIC50+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Statistics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.</a> Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).</li>
<li>Yung, W. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Chemosensitivity+Testing+and+its+Clinical-Application+in+Human+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Review%22%5BJournal%5D)">In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas.</a> Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).</li>
<li>McCarthy, N. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarthy%2C+NJ+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22">Current Topics in Developmental Biology</a>. 36, 259-278 (1997).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, sie haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Methode kombiniert die chemische Synthese mit biologischen Zelllebensfähigkeitstest. Wie bei allen biologischen Methoden zur lebensfähigen Zellen, ist es wichtig, in einer laminaren Haube arbeiten und sterilen Bedingungen, einschließlich der Verwendung von sterilen organischen Lösungsmitteln zu halten. Auch sollte der Herstellung und Lagerung von hydrolytisch instabilen Metall basierte Medikamente unter inerten Bedingungen durchgeführt werden, für das Handschuhfach oder-Schlenk-Te...

Die Chemotherapie ist immer noch eines der Hauptgerichte von Behandlungen in der Klinik für verschiedene Krebserkrankungen eingesetzt und damit überwiegende Teil der Forschung wird weltweit mit dem Ziel, neue und verbesserte Krebsmedikamente entwickeln, durchgeführt. Solche Studien beginnen meist in der chemischen Ebene, mit der Gestaltung und Herstellung von Verbindungen, gefolgt von biologischen Auswertung der zytotoxischen Eigenschaften in vitro. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch verschiedene Tests, die Informationen über die Zellaktivität bieten 1-2 bewertet werden. Cisplatin ist ein Beispiel eines Platinkomplexes, der weitgehend als chemotherapeutisches Arzneimittel, die als eine effiziente Behandlung hauptsächlich für Hoden-und Eierstockkrebs 3-4 verwendet wird. , Seinen engen Aktivitätsbereich und schwere Nebenwirkungen auslösen, jedoch Studien anderer potenter Übergangsmetallkomplexe 5-8. Unter anderem Titan (IV) und Vanadium (V)-Komplexe zeigten vielversprechende Ergebnisse mit hoher Aktivität und reduzierteToxizität 16.9. Ti (IV)-Komplexe waren die ersten klinischen Studien nach Cisplatin aufgrund dieser Eigenschaften geben, allerdings haben sie die Studien aufgrund Formulierungsschwierigkeiten und hydrolytische Instabilität fehlgeschlagen. Es besteht daher ein Bedürfnis, verbesserte Strom Derivate dieser Metallkomplexe, die eine hohe Anti-Krebs-Aktivität mit Wasserbeständigkeit 15,17-21 kombinieren entwickeln. Eine Herausforderung bei der Herstellung der Ti (IV) und V (V)-Komplexe bezieht sich auf die hydrolytische Instabilität der Vorläuferreagenzien, daher inerte Atmosphäre aufrechterhalten werden. Die Herstellung der Ti (IV) und V (V)-Verbindungen wird unter N 2 oder Ar Bedingungen in einem Handschuhfach oder unter Verwendung von Schlenk-Techniken durchgeführt. Test - Ein übliches Verfahren zur Bewertung der Anti-Krebs-Aktivität basiert auf dem MTT-((4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid 3) bezogen. Dieser Test ist ein Test, der farbmetrischen Rentabilität im Jahr 1983 von Mosmann präsentiert wurde22. Es ist sehr gut untersucht und charakterisiert, und es wird als sehr leistungsfähig bei der Beurteilung der Wirksamkeit der neuen zytotoxischen Verbindungen aufgrund ihrer Präzision, Schnelligkeit und seine Fähigkeit, auf einer Vielzahl von Zelllinien verwendet werden. Diese Lebensfähigkeit Assay basiert auf der Farbänderung des MTT-Molekül, wenn es um lebensfähigen Zellen ausgesetzt basiert. Messung der Absorption bestimmt, die proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen ist, und der Vergleich zu unbehandelten Kontrollen, erlaubt die Beurteilung der Zellwachstumshemmung Fähigkeiten der getesteten Verbindung. Der MTT-kolorimetrischen Assay wird in 96-Well-Plattenformat 23 geleitet. Die Zellen können Vorinkubation in den Vertiefungen vor der Zugabe des getesteten Arzneimittels erforderlich. Die Vorinkubation Zeiten 0-24 Stunden nach der Zelllinie Eigenschaften variieren. Die Zellen werden in der Regel auf die Droge für 24-96 Stunden in Abhängigkeit von der Wirkstoffaktivität ausgesetzt. MTT-Lösung wird dann zu der behandelten Zellen, in denen die Schrei hinzugefügtow MTT zu Formazan lila durch eine Vielzahl von mitochondrialer und cytosolischer Enzyme, die in betriebsfähiger Zellen (Fig. 1) 24 verringert. Der MTT-Molekül nicht durch tote Zellen oder roten Blutzellen (metabolisch inaktiven Zellen) Milzzellen (ruhende Zellen) und Concanavalin A-stimulierten Lymphozyten (aktivierte Zellen) 22 verringert. Nach 3-4 h Inkubation mit MTT Formazan die Niederschläge. Die Bildung des Formazan beginnt nach 0,5 h Inkubation aber für optimale Ergebnisse ist es am besten, um die Zellen zu MTT für mindestens 3 h 22 freizulegen. Folglich wird das Wachstumsmedium entfernt und die Formazan wird in einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt Isopropanol 25 gelöst, obwohl DMSO kann auch verwendet werden 26. Die Beseitigung des Mediums ist für genaue Ergebnisse zu erzielen, da Phenolrot, die in Wachstumsmedium weit verbreitet ist, und Ausfällen von Proteinen mit der Absorptionsmessung 25 stören. Wenn die formaZan homogene Lösung erreicht, die Absorption der Lösung wird unter Verwendung eines Mikroplatten-Lese Spektrophotometer gemessen. Die Absorption bei 550 nm ist direkt proportional zur Anzahl der Zellen im Bereich von 200-50,000 Zellen pro Vertiefung, und somit können sehr kleine Mengen von 22 Zellen nachgewiesen werden. Die Absorption zeigt die Menge an lebensfähigen Zellen, die nach der Behandlung mit dem Arzneimittel blieb, und ist mit der Absorption von Kontrollzellen, die nicht mit dem Arzneimittel ausgesetzt waren, verglichen. Analyse der Ergebnisse durch geeignete Software stellt die IC 50 (Inhibierung Konzentration, 50%)-Werte und ihre statistische Fehler auf der Grundlage mehrerer Wiederholungen der Messung. Der MTT-Assay ist weit verbreitet in Zytotoxizitätsuntersuchungen für das Screening neuer Antikrebsverbindungen aufgrund ihrer relativen Einfachheit und Genauigkeit. Jedoch bei der Verwendung des MTT-Tests, die auf enzymatische Reaktion abhängig ist, man bedenken muß, daß verschiedene Enzyminhibitoren können die Reduktion von MTT Affektd zu falschen Ergebnissen führen 27. Darüber hinaus bedeutet das MTT-Assay keine Information über den molekularen Mechanismus der zytotoxischen Aktivität des Wirkstoffs 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz/Material</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td>Biological Industries <td>04-007-1A</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hexan AR</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>Getrocknet mit einem Lösungsmitteltrocknungssystem</td></tr><tr><td>HT-29 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol AR</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Antibiotika</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 mit Phenolrot mit L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ohne Phenolrot</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>mit einem Lösungsmitteltrocknungssystem getrocknet</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>feuchtigkeitsempfindliches</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>Feuchtigkeit sensitive</td></tr><tr><td colspan="4">Ausrüstung</td></tr><tr><td>12-Kanal-Pipette 30-300 &mu; l</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-Kanal-Pipette 5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kolben</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit Deckel (flacher Boden)</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Binder</td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>Gegenkammer</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Fläschchen</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschuhfach</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader Spektralphotometer</td><td>Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 20-200 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette 5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anti-krebs-metall-komplexe: synthese und zytotoxizität bewertung durch die mtt-assay

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titan (IV) und Vanadium (V)-Komplexe sind hochwirksamen Antikrebsmittel. Eine Herausforderung bei ihrer Synthese bezieht sich auf ihre hydrolytische Instabilität, deshalb sollte deren Herstellung unter einer inerten Atmosphäre durchgeführt werden. Bewertung der Antitumor-Aktivität dieser Komplexe können durch den MTT-Assay erzielt werden. Der MTT-Test ist ein kolorimetrischer Assay, der auf Lebensfähigkeit enzymatischen Reduktion von MTT zu Formazan-Molekül, wenn es um lebensfähigen Zellen ausgesetzt ist. Das Ergebnis der Reduzierung ist ein Farbwechsel des MTT-Molekül. Absorptionsmessungen relativ zu einem Regler zum Einstellen des Prozentsatzes der verbleibenden lebensfähigen Krebszellen nach der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen einer Testverbindung, die Aktivität gegen Krebs der Verbindung und ihrer IC 50-Werte umgerechnet wird. Der MTT-Assay ist in Zytotoxizität Studien aufgrund ihrer Genauigkeit, Schnelligkeit und relative Einfachheit weit verbreitet. Hier stellen wir vorschickte detailliertes Protokoll für die Synthese von luftempfindlichen Metall basierte Medikamente und die Lebensfähigkeit der Zellen-Messungen, einschließlich der Vorbereitung der Zellplatten, die Inkubation der Verbindungen mit den Zellen, die Lebensfähigkeit Messungen unter Verwendung des MTT-Tests, und die Bestimmung der IC 50-Werte.

Die Komplexe wurden basierend auf den festgelegten Verfahren 18,28 und ihre Reinheit durch NMR und Elementaranalyse ausgewertet werden vorbereitet. Die aus dem MTT-Test erhaltenen Daten analysiert, um die Zytotoxizität der Verbindung 18,21 auszuwerten. Zunächst Subtraktion des Blindkontrolle Absorptionswert von allen anderen Werten durchgeführt wird. Zweitens wird das Lösungsmittel THF Steuerwert auf 100% Rentabilität eingestellt, da keine wachstumshemmende Verbindung w...

Verfahren zur Synthese von luftempfindlichen Titan-und Vanadiumantikrebsmitteln wird beschrieben, zusammen mit der Bewertung der zytotoxischen Aktivität gegenüber menschlichen Krebszelllinie mit dem MTT-Assay.

Anti-Krebs-Metall-Komplexe: Synthese und Zytotoxizität Bewertung durch die MTT-Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, metallhaltige Arzneistoffe gegen Krebs herzustellen und ihre Zytotoxizität mittels des MTT-Assays zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst metallbasierte Antikrebsverbindungen synthetisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, 96-Well-Platten mit Krebszellen vorzubereiten.Anschließend werden metallbasierte Anti-Krebs-Verbindungen in die Krebszellen eingebracht. Im letzten Schritt wird die Zellviabilität mittels des MTT-Assays gemessen, bei dem die Reduktion von MTT durch mitochondriale und zytoplasmatische Enzyme zur Bildung von Formazan gemessen wird, was letztendlich die Anti-Krebs-Aktivität und die halbmaximale hemmende Konzentration widerspiegelt. Die IC50-Werte der Verbindungen werden ermittelt.Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es sich um ein mehrstufiges Verfahren handelt, das die vollständige Aufmerksamkeit des Laborarbeiters erfordert und strikt zeitlich geplant ist. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Herstellung der Zellplatte nicht einfach ist, da das Arbeiten mit lebensfähigen Zellen bestimmte Richtlinien erfordert.

anticancer-metal-complexes-synthesis-cytotoxicity-evaluation-mtt

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Der MTT-Test ist eine einfache und reproduzierbare Farbtestverfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen basiert auf Reduktion der gelben MTT und Produktion von wasserunlöslichen Formazan lila. Hier hat sich die Rentabilität der MCF-7 Zellen nach Behandlung von nanogenomedicine ausgewertet worden.

Zelluläre Toxizität von Nanogenomedicine in MCF-7 Zelllinie: MTT-Assay

Dieses Video beschreibt den kolorimetrischen Assay, Methylthiazol-Tetrazolium (MTT) Assay, um die arzneimittelinduzierte Zytotoxizität in Krebszellen zu messen und ihre metabolische Aktivität zu bestimmen. Dieser Assay basiert auf der metabolischen Umwandlung von Tetrazoliumsalzen in farbige Produkte, die die mitochondriale Aktivität der Zellen widerspiegeln.

Methylthiazolyltetrazolium oder MTT-Assay: ein kolorimetrischer Assay zur Messung der Arzneimittelresistenz durch Bestimmung der Stoffwechselaktivität in Krebszellen

Hier wird die Echtzeitüberwachung des Tumorzellstoffwechsels, kombiniert mit einem in vivo Modell der Chorio-Allantoismembran (CAM) der Metastasierung von Hühnerembryonen, verwendet, um neuartige Anti-Krebs-Ziele/Wirkstoffe auf ihre Fähigkeit hin zu bewerten, Tumorzellen für DNA-schädigende Chemotherapeutika zu sensibilisieren.

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Dieses Protokoll beschreibt die Synergien zwischen einem Anti-Krebs-Antikörper und Zytostatika in präklinischen Modellen zu bewerten, indem Sie unter Verwendung der Kombination Index Gleichung von Chou und Talalay.

Potenzierung der Anti-Krebs-Antikörper-Wirksamkeit von Zytostatika: Nachweis von Antikörper-Wirkstoff-Synergismus mit der Kombination-Index-Gleichung

Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.

Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

Diese Methodik zielt darauf ab, die Zytotoxizität von Biomaterialien durch die Herstellung löslicher Extrakte unter Verwendung von Viabilitätstests und phänotypischen Analysen, einschließlich Durchflusszytometrie, RT-PCR, Immunzytochemie und anderen zellulären und molekularbiologischen Techniken, zu bewerten.

Zugang zur Zytotoxizität und Zellantwort auf Biomaterialien

Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.

Funktionalisierte spirozyklische Heterocyclensynthese und Zytotoxizitätstest

Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.

High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Tumore. Es werden detaillierte Protokolle zur Charakterisierung der Ionenkanalfunktion in Krebszellen und zur Untersuchung der Auswirkungen von Ionenkanalmodulatoren auf die Lebensfähigkeit von Krebs bereitgestellt.

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Identifizierung von Verbindungen vor, die den ADCC-Mechanismus, einen wichtigen Krebszell-Abtötungsmechanismus von Antitumor-Antikörpern, modulieren. Die zytotoxische Wirkung von NK-Zellen wird in Brustkrebszell-Sphäroiden in Gegenwart von Trastuzumab gemessen. Die Bildanalyse identifiziert lebende und tote Killer- und Zielzellen in Sphäroide.

Quantifizierung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität in einem Tumor-Sphäroid-Modell: Anwendung für die Wirkstoffforschung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für einen Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizitäts-Assay (ADCC) unter Verwendung eines ADCC-Bioassay-Kits vor. Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug, um den ADCC-Mechanismus aufzuklären und das therapeutische Potenzial von Antikörpern in der Krebsimmuntherapie zu bewerten.

Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays

Lernen Sie die Synthese luftempfindlicher Titan- und Vanadium-Antikrebsmittel sowie die Bewertung ihrer Zytotoxizität gegenüber menschlichen Krebszelllinien mittels MTT-Assay.

Anti-Krebs-Metall-Komplexe: Synthese und Zytotoxizität Bewertung durch die MTT-Assay

Weitere Videos entdecken