^In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

Wir beschreiben eine allgemeine Protokoll für die in-vivo-Zellortung mittels MRT in einem Mausmodell mit Ex-vivo-markierten Zellen. Ein typisches Protokoll für die Zellmarkierung, Bildaufnahme und Verarbeitung Quantifizierung ist inbegriffen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Anzahl der 19 F-markierten Zellen in vivo mit Hilfe von 19 FMRI abzubilden und zu quantifizieren. Dies kann in einem klinischen oder präklinischen Umfeld erfolgen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst mit einem geeigneten 19 F-Wirkstoff markiert werden.

Dies geschieht meist ex vivo. Der zweite Schritt besteht darin, den 19 F-Gehalt pro Zelle zu quantifizieren, was unter Verwendung von 19 F und MR mit einer bekannten Referenz erfolgen kann. Es wird davon ausgegangen, dass der 19 F-Gehalt pro Zelle während des Experiments konstant bleibt, andernfalls müssen Korrekturfaktoren berechnet werden.

Als nächstes wird der Proband in vivo mit einem H und 19 FMRI abgebildet, um die übertragenen markierten Zellen zu lokalisieren. Eine bekannte Referenz und geeignete Bildgebungsparameter sind für die Quantifizierung aus den Bilddaten unerlässlich. Der letzte Schritt besteht darin, die Bilddaten zu verarbeiten, um die Anzahl der Zellen zu berechnen.

Ex-vivo-Histologie oder andere Techniken können verwendet werden, um die Daten nach Möglichkeit zu bestätigen. Letztendlich kann 19 FMRI für die in vivo-Zellverfolgung verwendet werden, um die übertragenen Zellen hinsichtlich ihrer Lokalisation und Anzahl über den relevanten Zeitraum zu untersuchen, sofern bestimmte Annahmen, wie im Text skizziert, getroffen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie einer HMRI-Methode mit superparamagnetischen Zellmarkierungen besteht darin, dass es kein störendes Hintergrundsignal gibt und dass die Anzahl der Zellen direkt aus den Bilddaten bestimmt werden kann.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der zellulären Therapeutika zu beantworten, z. B. wo sich die Zellen befinden und wie viele zu verschiedenen Zeitpunkten vorhanden sind. Um dieses Protokoll zu starten, fügen Sie zunächst unreifen dendritischen Zellen in einer Konzentration von vier Milligramm pro 1 Million Zellen in zwei Millilitern Medium eine 19 F-Markierung hinzu. Dann vorsichtig schwenken, um zu mischen.

Inkubieren Sie anschließend die dendritischen Zellen drei Tage lang mit der Markierung, bevor sie reifen und ernten. Sammeln Sie dann die Zellen und entfernen Sie überschüssige Etiketten, indem Sie sie mindestens dreimal waschen. Bei der PBS-Zählung resuspendieren die resultierenden Zellen dann in einem kleinen Volumen PBS zur Injektion oder für weitere Tests.

Beachten Sie, dass das hier beschriebene Protokoll für diese spezifischen dendritischen Zellen und Markierung relevant ist. Daher muss ein Protokoll für einen anderen Zelltyp entweder in der Literatur gefunden oder vom Forscher optimiert werden. Legen Sie eine bekannte Anzahl markierter Zellen in ein NMR-Röhrchen.

Fügen Sie dann 10 Mikroliter 5%tri Fluor oder saure Säure oder TFA hinzu. Wenn die Resonanzfrequenz von TFA aufgrund einer Überlappung mit der Markierung ungeeignet ist, verwenden Sie eine alternative lösliche Verbindung. Geben Sie eine Probe in ein NMR-Spektrometer und erhalten Sie das Fluor-19-Spektrum.

Berechnen Sie dann die relativen Flächen unter den Peaks der Referenz und der Probe oder dem Hauptpeak der Probe und berechnen Sie dann die durchschnittliche Anzahl von Fluoren pro Zelle in der Probe. Beachten Sie, dass dieser gesamte Vorgang im Durchschnitt wiederholt werden sollte, um eine statistische Signifikanz zu erreichen. Dies kann auch mittels Spektroskopie direkt am MRT-Scanner erfolgen.

Beachten Sie auch, dass dieses Verfahren nur die durchschnittliche Fluor-19-Belastung für eine große Anzahl von Zellen zeigt, nicht aber die Variabilität zwischen den Zellen. Um die Gleichmäßigkeit der Zellaufnahme zu überprüfen, ist das Vorhandensein einer fluoreszierenden Komponente mit dem 19 F-Wirkstoff erforderlich. Hier zeigt nur Szenario drei eine homogene Markierung der Zellen, obwohl dies in den Berechnungen immer angenommen wird, kann dies mit ergänzenden Techniken wie der Mikroskopie überprüft werden, die für die Bildgebung eingerichtet wird, indem eine vollständig anästhesierte Maus in eine Wiege gelegt und immobilisiert wird, um Bewegungen während des Scans zu verhindern.

Schließen Sie außerdem eine Temperatur- und Atemkontrolle für die physiologische Überwachung während des Scans an. Positionieren Sie bei Bedarf eine externe Referenz neben dem Tier, sowohl die Referenz als auch der interessierende Bereich sollten sich in der Mitte der Spule befinden. Beginnen Sie die Aufnahme mit einem konventionellen Protonen-MRT-Scan als anatomische Referenz für die 19-F-Bildgebung.

Stellen Sie dann das System auf die 19 F-Frequenz des Zellmarkers ein und führen Sie einen 19 FMRI-Scan durch. Im Idealfall hat der 19 FMRI-Scan das gleiche Sichtfeld und die gleiche Schichtauswahl wie ein herkömmliches MRT, wenn auch wahrscheinlich mit geringerer Auflösung. Bestimmen Sie als Nächstes die Referenzimpulsverstärkung von 19 F mit der hier gezeigten Formel und erfassen Sie ein 19 FNMR-Spektrum, um die Frequenz von 19 F zu bestimmen.

Schätzen Sie den von der Hochfrequenzspule abhängigen Faktor C in einem separaten in vitro Experiment. Die Verwendung einer Hochfrequenzspule mit einem homogenen B-Eins-Profil, wie z. B. einer Oberflächenspule, kann die Quantifizierung von 19 F-Daten erschweren. Denn das Signal hängt nicht nur von der 19 F Konzentration ab, sondern auch vom Abstand zur Spule.

Erfassen Sie daher eine B-Karte auf dem einen H-Kanal, um 19 F-Daten nachträglich zu korrigieren. Dies setzt voraus, dass ein H- und ein 19 F-Spulenprofil mit Ausnahme des Proportionalitätsfaktors C identisch sind und dass in Bereichen von 19 F ausreichend ein H-Hintergrundsignal bereitgestellt wird.Hier sehen wir Flip-Winkel-Maps von Rohren mit TFA in Wasser, die an einem H- und 19 F-Kanal aufgenommen wurden. Um die 19 F-Daten zu korrigieren, erfassen Sie zunächst eine Karte mit einem H-Flip-Winkel mit der Methode mit zwei Flip-Winkeln.

Verwenden Sie einen Gradienten-Echo-Scan, bei dem ein sehr langer TR dreimal so lang ist wie ein HT-Scan mit einem geschätzten Schwenkwinkel von knapp unter 90 Grad in der Nähe der Spule. Nehmen Sie dann einen zweiten Gradienten-Echo-Scan mit dem doppelten Flip-Winkel des ersten Scans auf. Berechnen Sie den Klappwinkel alpha von H bei vle X, Y, Z über das Signal und die Sensorik des ersten und zweiten Gradienten-ECHO-Scans.

Der Flip-Winkel von 19 F ist identisch, mit Ausnahme des Faktors eins, C, da proportional B eins die Dämpfung der Signalintensität von 19 F aus einer Spin-Echo-Sequenz mit Anregung, Flip-Winkel, Alpha-Refokussierung, Flip-Winkel zwei und Alpha während des Signalempfangs auf dem Bildschirm zu sehen ist. Hier ist die Dämpfung durch unvollkommene Anregung zu sehen. Dann kann die Gesamtdämpfung berechnet werden.

Beachten Sie, dass es im Falle eines perfekten 90-Grad-, 180-Grad-Anregungs-Refokussierungs-Flip-Winkels auf eins normalisiert wird, die B korrigierten 19 F-Bildsignalintensitäten SI 19 F korrigiert werden über diese Formel berechnet, um ein H- und 19 F-Überlagerungsbild zu erstellen. Exportieren Sie die Bilddaten und öffnen Sie die Dateien in einem Bildbearbeitungsprogramm wie image J, wenden Sie bei Bedarf Bildanpassungen an und achten Sie darauf, dass die Anpassungen für alle Bilder gleich bleiben. Rendern Sie dann die 19 F-Bilder in Falschfarben und überlagern Sie sie dann mit den entsprechenden H-Bildern.

Um das Signal zu lokalisieren, wählen Sie das Bild mit einer Größe von 19 F mit den relevanten Zellen und der sichtbaren Referenz aus, die ROIs über die relevanten Zellen, die Referenz und einen Bereich außerhalb des Motivs für den Rauschwert zeichnen, wie in der Stichprobe gezeigt. Beachten Sie, dass hier aus Gründen der Übersichtlichkeit der eine anatomische Scan H gezeigt wird. Die einfache Proportionalität und der Wert von 19 F pro Zelle können dann verwendet werden, um die Anzahl der Zellen im ROI zu schätzen.

Diese Bilder stammen von typischen Ergebnissen eines Protokolls, das den Transfer von 19 F-markierten Zellen zu einem drainierenden Lymphknoten beinhaltet. Hier sehen wir ein 19-FNMR-Spektrum von 1 Million markierten Zellen unter Verwendung einer A-TFA-Referenz, und hier sehen wir ein repräsentativ verarbeitetes Bild für die in vivo-Bildgebung. Eine Referenz, bestehend aus einem versiegelten Behälter mit dem gleichen Etikett, das für die Zellen verwendet wurde, wurde zwischen die Füße der Maus gelegt.

Durch Anwendung des beschriebenen Protokolls berechneten wir eine Zellzahl von etwa 1,2 Millionen auf der Grundlage des Rohbildes mit einer Magnitude von 19 F. Das 19-F-Bild wird in Falschfarben über das anatomische Graustufen-Protonenbild gelegt. Beim Aufbau eines neuen Experiments ist es wichtig, Fluor zu validieren.

MRT-Ergebnisse mit Histologie, optischer Bildgebung oder anderen Methoden. Zum Beispiel ist es wichtig zu beachten, dass die Fluormarkierung im Gewebe verbleiben kann, wenn die Zellen absterben, und zu einem falsch positiven Signal führen kann.