Optische Detektion von E. coli Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, einen markierungsfreien optischen Biosensor für den schnellen Bakteriennachweis auf Basis eines nanostrukturierten porösen Siliziums zu entwickeln. Dies wird durch die Konstruktion von oxidiertem porösem Silizium erreicht, das als optisches Wandlerelement des Biosensors verwendet wird. In einem zweiten Schritt werden spezifische Capture-Sonden, wie z. B. Antikörper, auf der porösen Oberfläche immobilisiert, um die aktive Komponente des Biosensors bereitzustellen.

Anschließend wird der Biosensor den Zielbakterien ausgesetzt, um die Bakterienzellen direkt auf dem Antikörper einzufangen. Es werden Ergebnisse der modifizierten oxidierten porösen Siliziumoberfläche erzielt, die Intensitätsänderungen im optischen Interferenzspektrum der Dünnschicht des Biosensors zeigen. Aufgrund des Bakterieneinfangs wird die Lichtmikroskopie verwendet, um das Vorhandensein der Bakterien auf der Oberfläche des Biosensors zu bestätigen.

Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Methoden wie herkömmlichen Kulturen und Techniken besteht darin, dass unsere Methode das Vorhandensein von Bakterien sehr schnell in weniger als einer Stunde erkennt. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Herausforderungen bei der Umweltüberwachung bestimmter Mikroorganismen zu bewältigen und die Wasser- und Lebensmittelsicherheit zu gewährleisten. Es ermöglicht auch den Nachweis bestimmter Bakterienarten in Echtzeit und in Point-of-Care-Umgebungen: Beginnen Sie das Ätzen von Siliziumwafern in einer Drei-zu-Eins-Lösung aus wässrigem Fluorwasserstoff und Ethanol für 30 Sekunden bei einer konstanten Stromdichte von 385 Milliampere pro Quadratzentimeter.

Bitte beachten Sie, dass Fluorwasserstoff eine stark korrosive Flüssigkeit ist und mit äußerster Vorsicht behandelt werden sollte. Spülen Sie die Oberfläche des entstehenden schlechten Silikonfilms mehrmals mit Ethanol ab. Anschließend trocknen Sie die Filme unter einem trockenen Stickstoffgas und oxidieren anschließend die frisch geätzten porösen Siliziumproben in einem Rohrofen bei 800 Grad Celsius für eine Stunde an der Umgebungsluft.

Um die oxidierte poröse Siliziumprobe zu biofunktionalisieren, inkubieren Sie zunächst den Film eine Stunde lang und eine 95%ige MPTS-Lösung. Nach dem Spülen mit Toluol, Methanol und Aceton trocknet die mit Sinus behandelte oxidierte poröse Siliziumprobe unter einem trockenen Stickstoffgas. Als nächstes inkubieren Sie die sinusmodifizierte Probe 30 Minuten lang in einem Milliliter 100 millimolare PEOI-Ato-Acetylbiotin-Lösung.

Spülen Sie die resultierende mit Biotin behandelte Probe mehrmals mit 0,1 molar Phosphat, gepufferter Kochsalzlösung oder PBS-Lösung. Inkubieren Sie die Probe anschließend 30 Minuten lang in einem Milliliter mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Streptokokken-Evidenzlösung, bevor Sie sie mehrmals mit der PBS-Lösung spülen. Inkubieren Sie dann die Streptavidin-modifizierte oxidierte poröse Siliziumprobe 30 Minuten lang in einem Milliliter mit 100 Mikrogramm pro Milliliter, biotinylierten E-coli, monoklonalem IgG-Antikörper oder mit 100 Mikrogramm pro Milliliter.

Biotinyliertes Kaninchen-IgG zum fluoreszenzmarkierten Gerüst. Inkubieren Sie die IgG-modifizierten Oberflächen mit 15 Mikrogramm pro Milliliter. Fluorescein-markiertes Anti-Kaninchen-IgG für 40 Minuten.

Inkubieren Sie mit 15 Mikrogramm pro Milliliter. Fluorescein markierte Anti-US-IgG als Kontrolle. Untersuchen Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop, nachdem Sie die modifizierten Proben mehrmals mit der PBS-Lösung gespült haben.

Kultivieren Sie e coli K 12-Bakterien in einem 10-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Luria britani oder LB-Medium. Inkubieren Sie die Bakterien über Nacht unter Schütteln bei 37 Grad Celsius nach dem Wachstum über Nacht. Im LB-Medium wird die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern oder OD 600 mit einem Spektralphotometer abgelesen, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen.

Die Anzahl der Zellen ist direkt proportional zur OD 600-Messung. Ort. Das IgG modifizierte oxidierte poröse Siliziumgerüste und die Steuerung. Saubere oxidierte poröse Siliziumproben in einer speziell angefertigten Plexiglas-Durchflusszelle.

Befestigen Sie die Durchflusszelle, um sicherzustellen, dass das Reflexionsvermögen der Probe bei allen Messungen an der gleichen Stelle gemessen wird. Die Proben werden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit der Coli K 12-Suspension inkubiert. Entfernen Sie dann die Bakteriensuspension, indem Sie die Zelle 30 Minuten lang mit Kochsalzlösung von 0,85 % Gewicht pro Volumen spülen.

Überwachen Sie die Änderungen der Reflektivitätsdaten während des gesamten Experiments auf einem CCD-Spektrometer. Führen Sie alle optischen Messungen in einer wässrigen Umgebung durch, nachdem Sie Spektren auf einem CCD-Spektrometer gesammelt haben, das durch Anwendung einer schnellen Vier-Ohr-Transformation analysiert wurde. Bestätigen Sie abschließend das Vorhandensein der Bakterien auf der Oberfläche des Biosensors, indem Sie die Proben unmittelbar nach dem Biosensor-Experiment unter einem aufrechten Lichtmikroskop beobachten.

Hier ist eine hochauflösende rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der porösen Siliziumschichten nach thermischer Oxidation zu sehen. Die oxidierte poröse Siliziumschicht zeichnet sich durch gut definierte zylindrische Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 30 bis 80 Nanometern aus. Die Bindung der Antikörper an die oxidierte poröse Siliziumoberfläche wird durch Fluoreszenzmarkierung bestätigt, gefolgt von der Beobachtung der Oberfläche unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Darüber hinaus ermöglichen Fluoreszenzstudien die Charakterisierung der Aktivität und antigenen Spezifität der oberflächenimmobilisierten Antikörper durch Bindung von fluoreszenzmarkiertem Anti-Kaninchen-IgG und Anti-Maus-IgG als Kontrolle. Ebenfalls gezeigt wird das Kontrollexperiment ohne IgG, um zu demonstrieren, dass die Veränderungen der Amplitude oder Intensität des von der oxidierten porösen Silizium-Nanostruktur reflektierten Lichts bei der Bakterienbiosensorik schnell für Ihr Transformationsspektrum des Biosensors vor und nach der Einführung der E-Coli-Bakterien überwacht werden. Es wird eine Intensitätsabnahme von sieben plus oder minus 1 % festgestellt, während für die unmodifizierte oxidierte poröse Siliziumoberfläche unbedeutende Änderungen beobachtet werden.

Um das Vorhandensein von eingefangenen Zellen auf der oxidierten porösen Siliziumoberfläche zu bestätigen, werden die Biosensoren unmittelbar nach Abschluss des gezeigten Biosensor-Experiments unter einem Lichtmikroskop beobachtet. Hier befinden sich immobilisierte Bakterienzellen auf der Oberfläche des Biosensors. Während auf den unveränderten Steuerflächen keine Zellen zu sehen sind: Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen bestimmten optischen Biosensor für die Überwachung eines Zielanalyten planen.