In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zytokinsekretion, Transkription und morphologische Wirkung von stimulierten T-Zellen zu analysieren. Zuerst wird ein FI-Call-Gradient verwendet, um die peripheren CD zu isolieren: acht abgereicherte mononukleäre Blutzellen von den HIV-infizierten Personen inkubieren die Zellen entweder mit der Isotypkontrolle oder dem blockierenden Antikörper von Interesse. Stimulieren Sie dann die Zellen mit dem gewünschten Antigen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellkulturen, um Überstände für Zytokinmessungen und Zellpellets für die phänotypische Analyse oder Transkriptionsanalyse zu sammeln, falls gewünscht. Passen Sie dieses Protokoll so an, dass es die Sortierung der einzelnen Zelltypen durch Durchflusszytometrie einschließt. Ergebnisse zur Zytokinsekretion. Phänotypische oder transkriptionelle Analysen können den Einfluss der Antikörperblockade von inhibitorischen Signalwegen auf die Wiederherstellung der Effektorfunktion von HIV-spezifischen Zöliakie-T-Zellen zeigen.

Dieser In-vitro-Assay kann effektiv zur Quantifizierung von Zytokinspiegeln verwendet werden, die durch die Blockade von Hemmwegen wiederhergestellt wurden, zur Untersuchung einer breiten Palette von Effektormolekülen und auch zur Bewertung der Auswirkungen von Zytokinen, die von HIV-spezifischem C für T-Zellen produziert werden, auf andere Zelluntergruppen. Megan Hart, eine Forschungstechnikerin aus unserem Labor, wird nun dieses Verfahren demonstrieren: Deplete the CD eight positive T-Zellen durch Zugabe des menschlichen CD 8 positiven Depletionscocktails bei 50 Mikrolitern pro Milliliter Vollblut, mische gut und inkubiere 20 Minuten lang. Mischen Sie bei Raumtemperatur das Vollblut mit dem Puffer des Strangs.

Schichten Sie nun das Blut vorsichtig auf das Histo-Pack, dann zentrifugieren Sie den Gradienten bei 540 RCF für 30 Minuten. Sammeln Sie die Schicht der mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Füllen Sie die Zellen in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie sie zweimal mit 45 Millilitern vollständigem RPMI 1640.

Suspendieren Sie die gewaschenen Zellen wieder in vollständigem RPMI 1640. Aliquotieren Sie dann 500 Mikroliter Zellsuspension pro Faxschlauch. Je nach untersuchtem Signalweg fügen Sie die blockierenden Antikörper hinzu.

Fügen Sie auch die Isotyp-Regler zu den entsprechenden Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 15 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Als nächstes stimulieren Sie die Zellen mit einem HIV-One-Gag-Peptidpool.

Fügen Sie auch eine Kontrolle ohne Stimulation für jede Blockierungsbedingung hinzu. Setzen Sie die Kultivierung der Zellen 48 Stunden lang fort. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, ohne das Pellet zu stören.

Zweimal 225 Mikroliter Überstand in EOR-Röhrchen für die Luminex Speed Arrays übertragen, um das Virus bei 25 Mikrolitern 0,5 %PBS Tween zu inaktivieren. Messen Sie dann die gewünschten Zytokinkonzentrationen mit dem Millipore-Luminex-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Nachdem Sie die Zellen in drei Millilitern PBS gewaschen haben, färben Sie sie auf Lebensfähigkeit, resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS mit 1 % FBS, wenn Sie auf Monozyten oder andere Antigen-präsentierende Zellen bei 1,4 Mikrolitern FCR-blockierendem Reagenzvortex färben, um sich zu mischen und 10 Minuten bei vier Grad Celsius zu inkubieren.

Als nächstes fügen Sie die Oberflächenantikörper hinzu und inkubieren 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Nach einmaliger Wäsche bei 200 Mikrolitern 4%para Formaldehyd und 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach einer Wäsche suspendieren wir die Zellen in 250 Mikrolitern 1%FBS zur Analyse auf einem Multi-Laser-Durchflusszytometer für quantitative R-T-P-C-R, lycieren die Zellen in 300 Mikrolitern Kyogenpuffer, RLT, der 1%Beamer Keto-Ethanol-Isolat-RNA enthält, unter Verwendung eines RNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Synthetisieren Sie nun CD NA aus der RNA mit einem CD NA-Synthesekit und nach dem Protokoll des Herstellers. Erstellen Sie als Nächstes eine Primermischung für jeden Primer, einschließlich der Haushaltsgene, indem Sie Primer zu nukleasefreiem Wasser hinzufügen und auf Eis halten. Für jeden Amplifikations-Mastermix fügen Sie 10,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser, 12,5 Mikroliter Cybergrün und einen Mikroliter Primermischung pro Platte hinzu.

Nun, pipettieren Sie jetzt 24 Mikroliter Mastermix in jede Reaktion. Nun, fügen Sie auch jeweils einen Mikroliter CD NA hinzu, gut nach der Vorlage. Verschließen Sie die Vertiefungen und zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 1500 RCF.

Führen Sie die Platte dann auf einem QRT-PCR-R-Gerät für die Färbung der Zelloberfläche aus. Fügen Sie die Felden- und Monin-Färbungen etwa sechs Stunden vor der intrazellulären Zytokinfärbung hinzu. Waschen Sie dann die Zellen mit 1%FBS in PBS und färben Sie sie nach dem Waschen der Zellen mit einem Fixationspermeationslösungskit und einem Protokoll auf intrazelluläre Zytokine.

Nachdem wir die Pellets in 250 Mikrolitern 1%FBS suspendiert haben, führen wir die Proben 16 Stunden nach der Stimulation auf einem Multi-Laser-Durchflusszytometer durch, um die Lebensfähigkeit mit dem Live Dead Fixable Dead Cell Stain-Kit zu gewährleisten. Gemäß dem Protokoll des Herstellers suspendieren wir die Zellen nach einer PBS-Wäsche in 100 Mikrolitern 1%FBS an der Oberfläche des Antikörperwirbels, um die Zellen 20 Minuten lang im Dunkeln auf Eis zu mischen und zu inkubieren. Waschen Sie die Zellen einmal und suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern kalter Nahrung, ergänzt mit RPMI 1640.

Anschließend filtrieren die Medien die Zellen durch eine Kappe des Zellsiebs in ein fünf Milliliter schweres Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Als nächstes werden 200 Mikroliter komplementäres RPMI 1640-Medium in jedes Sammelröhrchen gegeben. Halten Sie alle Röhrchen während der Sortierung auf Eis, sortieren Sie die interessierenden Zelluntergruppen auf einem Instrument, das sich in einer Einrichtung befindet, die für die Kultivierung von biogefährlichen Materialien ausgestattet ist.

Die sortierten Zellen für die gewünschte Zeitspanne. Nach der Analyse von Luminex- und PCR-Analysen in diesem Experiment führt die Stimulation von CD 8 mit abgereichertem pbmc mit einem HIV V One Gag-Peptidpool zu einer durchschnittlichen 800-fachen Steigerung der Interferon-Gamma-Produktion. Der Spiegel der Interferon-Gamma-Transkripte war nach der Stimulation median um das Zehnfache erhöht.

Die Ergebnisse der In-vitro-Analyse der HIV-spezifischen Zölia-Vier-T-Zell-Funktion deuten auf eine starke Korrelation zwischen der Interferon-Gamma-Proteinsekretion und den Interferon-Gamma-mRNA-Spiegeln hin. Interessanterweise führt die Stimulation durch den HIV-Gag-Peptid-Pool zu einer größeren Interferon-Gamma-Sekretion als die bakteriellen Antigene von Tetanus. Weitere Ergebnisse mit dem IL 13-Sekret deuten auf die unterschiedlichen Zytokinprofile von HIV- und Tetanus-spezifischen Zöliakie-4-T-Zell-Antworten hin.

Die Blockade des PD-Eins-Signalwegs hat im Allgemeinen keinen signifikanten Einfluss auf die Zytokinsekretion ohne Antigenstimulation, erhöht jedoch die Interferon-Gamma- und IL-2-Sekretion. Wenn Zellen mit HIV stimuliert werden, sammelt sich ein Gag-Peptid. Wenn Zöliakie drei Zellen aus dem pbmc depletiert werden, wird kein Interferon gamma oder IL zwei als Reaktion auf die Antigenstimulation produziert.

Diese Daten deuten darauf hin, dass die Sekretion von Interferon, gamma und IL two als Reaktion auf HIV-spezifische CD four-, T-Zell- und Antigen-spezifische Stimulation induziert wird. Dieses Experiment verwendet den demonstrierten Arbeitsablauf mit faktensortierten CD-4-T-Zellen, um den Einfluss der PD-1-Blockade auf Interferon-Gamma und IL zwei zu untersuchen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, zu untersuchen, wie immunregulatorische Moleküle das Zusammenspiel von HIV-spezifischen Zölia-Vier-T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen regulieren.

Hier wurde das Protokoll so angepasst, dass eine intrazelluläre Zytokinfärbung 48 Stunden nach der Stimulation durchgeführt wird. Die Ergebnisse zeigen, dass Monozyten nach Stimulation mit HIV-One-Gag-Peptidpools die primäre Quelle für IL 12 sind. Dieser experimentelle In-vitro-Ansatz ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der T-Zell-Immunologie, den Einfluss immunregulatorischer Signalwege auf die Regulierung der effektiven Funktion von Addison-spezifischen T-Zellen in menschlichen Proben zu untersuchen.