Name: In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Erfahren Sie einen in vitro-Test zur Analyse immunregulatorischer Einflüsse auf HIV-spezifische CD4 T-Zellen. Diese Methode untersucht Zytokinsekretion und Effektorfunktion für HIV-Forschung.

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Wir danken Gordon Freeman für die Bereitstellung des anti-PD-L1 blockierenden Antikörpers. Wir danken der klinischen und Laborpersonal am Massachusetts General Hospital und allen Studienteilnehmern für ihre unschätzbare Rolle in diesem Projekt. , National Heart Lung and Blood Institute der National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK) Diese Studie wurde durch das Nationale Institut für Allergie und Infektionskrankheiten der National Institutes of Health (DEK PA1 AI-080192) gefördert. DEK ist von einem Research Scholar Career Award der Quebec Health Research Fund (FRQS) unterstützt. FP wird durch ein Stipendium Erteilung des Massachusetts General Hospital Vorstand für Forschung und der Harvard Global Health Institute (HGHI) unterstützt.

1. Entleerung und Isolierung von PBMCs durch Ficoll-Trennung <ol><li> Abbau CD8 + T-Zellen durch Zugabe von Menschen CD8 +-Depletion Cocktail bei 50 ul / ml Vollblut. </li><li> Gut mischen und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur (18-25 ° C). </li><li> Nach der Inkubation mischen Vollblut mit HBSS (Hanks Balanced Salt Solution ohne Ca 2 + oder Mg 2 +) und Schicht über Histopaque. Spin bei 340 rcf für 30 min (keine Bremse, langsame Beschleunigung). </li><li> Sammeln PBMCs und Transfer zu einem neuen 50 ml konisch. Wasch 2x mit 45 ml RPMI 1640 mit 50 IE Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1% HEPES durch Schleudern für 10 min bei 340 rcf ergänzt. </li></ol> 2. Antikörper-Blockade und Antigen-spezifische Stimulation der Zellen <ol><li> Die Zellen in 2x10 6 pro Bedingung in RPMI 1640 mit 10% Humanserum und 50 IU Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1% HEPES,Anteil von 500 ul pro Zustand. </li><li> Aliquot 500 ul Zellsuspension pro FACS-Röhrchen. </li><li> Abhängig von der Bahn untersucht, fügen PD-L1, IL-10Rα-blockierende Antikörper und / oder Isotyp-Kontrollen bei 10 ug / ml und Inkubation für 15 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Stimulierung von Zellen mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool bei 1 &amp;mgr; g / ml / Peptid-Endkonzentration. Auch eine &quot;keine Stimulation&quot;-Steuerung für jede Sperrung Zustand. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden. </li></ol> 3. Sammlung und Analyse der Überstand <ol><li> Nach 48 Stunden, Spin-down FACS-Röhrchen für 7 min bei 340 rcf. </li><li> 2 x 225 ul Überstand in Eppendorf-Röhrchen für Luminex Bead Arrays sorgfältig sammeln, ohne das Pellet zu stören. </li><li> Inaktivierung von Viren im Überstand gesammelt mit 25 ul 0,5% PBS-Tween, um eine Endkonzentration von 0,05% Tween-PBS zu ergeben. </li><li> Shop gesammelten Überstände, die nicht immed sindiately in einem -80 ° C Gefrierschrank eingesetzt. </li><li> Messen gewünschten Cytokin-Konzentrationen unter Verwendung von Millipore Luminex-Kit nach Herstellerprotokoll. </li></ol> 4. Sammlung und phänotypische Analyse von Zellen via Durchflusszytometrie <ol><li> Nach dem Sammeln der Überstand, waschen Sie die Zellen in 3 ml PBS. Spin-Zellen für 7 min bei 340 rcf und dekantieren überschüssigen Wasch. </li><li> Stain für die Lebensfähigkeit mit einem LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit nach Herstellerprotokoll. </li><li> Waschen der Zellen in PBS für 7 Minuten bei 340 RCF und bei 4 ° C. Resuspendieren in 100 &amp;mgr; l PBS, 1% FBS. </li><li> Wenn Färbung auf Monozyten oder anderen Antigen-präsentierenden Zellen, Block-Fc-Rezeptoren durch Zugabe von 1,4 ul FcR Blockingreagenz und Wirbel zu mischen. </li><li> Inkubation für 10 min bei 4 ° C. </li><li> In Oberfläche Antikörper, Vortex, und Inkubation für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS 1% FBS, dekantieren überschüssigen Wasch, und mit 200 ul 4% Paraformaldehyd. Bebrütenbei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS 1% FBS, Resuspendieren in 250 ul PBS 1% FBS und erwerben auf einer Vielfach Durchflusszytometer (zB BD LSRII oder Fortessa). </li></ol> 5. Die Analyse der Zellen über qRT-PCR <ol><li> Für Zellen, die nicht über Durchflusszytometrie analysiert: Nach der Überstand Sammlung, lysieren Zellen in 300 ul Qiagen Buffer RLT mit 1% beta-Mercaptoethanol. Wenn nicht mit dem Protokoll weiter, können die Zellen bei -80 ° C nach diesem Zeitpunkt eingefroren werden. </li><li> Isolieren RNA unter Verwendung einer RNA Isolation Kit nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Synthetisieren von cDNA aus RNA unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kit nach Herstellerprotokoll. </li><li> Führen quantitative PCR mit SYBR Green Technologie. </li><li> Erstellen einer Primer-Gemisch für jeden Primer durch Zugabe von Primern, um Nuklease-freies Wasser bis zu einer Endkonzentration von 10 geben, verwendet werden, einschließlich Haushaltsgene (z. B. IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH)uM. Halten Sie auf dem Eis. </li><li> Erstellen Sie ein Master-Mix für jeden Primer durch Zugabe von 10,5 ul Nuklease-freies Wasser, 12,5 ul SYBR Grün und 1 ul Primer-Mix pro Platte auch. Halten Sie auf dem Eis. </li><li> Pipette 24 ul Master-Mix in jede Vertiefung der Platte, die verwendet werden. </li><li> 1 ul cDNA in jede Vertiefung nach Vorlage. </li><li> Cap Brunnen und Zentrifugenplatte für 3 min bei 800 rcf. </li><li> Führen Platte auf einem qRT-PCR-Maschine, zB eine Stratagene Mx3005P Instrument. </li></ol> 6. Die Anpassung für die intrazelluläre Zytokin-Färbung bei 48 h In Brefeldin und Monensin 6 Stunden vor der intrazellulären Zytokin-Färbung. Brefeldin in einer Konzentration von 10 ug / ml zugegeben, während Monensin wird gemäß den Anweisungen des Herstellers zugegeben. Der Einfachheit halber können Brefeldin 12 Stunden vor in einer Konzentration von 5 ug / ml Fleck hinzugefügt werden. <ol><li> Nach der Oberflächen Fleck, waschen Sie die Zellen mit PBS 1% FBS und Fleck inzellulären Zytokinen wie IL-12, IFN-γ und TNF-α unter Verwendung einer Fixierung / Permeabilisierung Lösung Satz und Protokoll. </li><li> Waschen der Zellen, Resuspendieren in 250 ul PBS 1% FBS, und auf einer Vielfach Durchflusszytometer (zB BD LSR II oder Fortessa). </li></ol> 7. Anpassung zum Sortieren Cells <ol><li> 16 Stunden nach der Stimulation, Flecken für die Lebensfähigkeit mit LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit nach Herstellerprotokoll. Halten Zellen auf Eis während der gesamten Prozedur. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS für 7 Minuten bei 340 RCF und bei 4 ° C. Resuspendieren in 100 &amp;mgr; l PBS, 1% FBS. </li><li> In Oberfläche Antikörper, Vortex zu mischen, und Inkubation Zellen auf Eis im Dunkeln für 20 min. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS, 1% FBS bei 340 RCF und bei 4 ° C und Resuspension in 500 &amp;mgr; l kaltem RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum mit 50 IU Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1% HEPES. </li><li> Filterzellen unter Verwendung von 5 ml Polystyrolrene-Rundrohr mit den Cell-Sieb Kappe. </li><li> Vorbereitung Röhrchen für Sortier durch Zugabe von 200 &amp;mgr; l RPMI 1640, enthaltend 10% fötales Rinderserum, ergänzt mit 50 IU Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1% HEPES in jedes Röhrchen. Halten Sie alle Röhrchen auf Eis beim Sortieren. </li><li> Sortieren Sie die Live-Zell-Untergruppen von Interesse an einem Instrument (zB BD FACS Aria II) in einer Einrichtung für biologische Gefahrenstoffe ausgestattet entfernt. </li><li> Nachdem die Zellen wurden sortiert, Ortszellen zurück in den Inkubator für die gewünschte Menge an Zeit und folgen mit Überstand Sammlung / Luminex Analyse und Zellpellet Sammlung / PCR-Analyse. </li></ol>

<ol><li>Zajac, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+immune+evasion+due+to+persistence+of+activated+T+cells+without+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function.</a> J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).</li>
<li>Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+persistence+alters+CD8+T-cell+immunodominance+and+tissue+distribution+and+results+in+distinct+stages+of+functional+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment.</a> J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).</li>
<li>Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+detrimental+roles+of+IL-10+in+HIV+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cytokine+Netw%22%5BJournal%5D)">Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis.</a> Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).</li>
<li>Porichis, F., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PD-1+in+HIV+pathogenesis+and+as+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).</li>
<li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">T cell exhaustion.</a> Nat. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8%2B+T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).</li>
<li>Day, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expression+on+HIV-specific+T+cells+is+associated+with+T-cell+exhaustion+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression.</a> Nature. 443, 350-354 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+is+up-regulated+in+multiple+cell+types+during+viremic+HIV+infection+and+reversibly+inhibits+virus-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells.</a> Blood. 114, 346-356 (2009).</li>
<li>Barber, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+function+in+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Nature. 439, 682-687 (2006).</li>
<li>Zhang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+up-regulation+is+correlated+with+HIV-specific+memory+CD8%2B+T-cell+exhaustion+in+typical+progressors+but+not+in+long-term+nonprogressors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors.</a> Blood. 109, 4671-4678 (2007).</li>
<li>Ndhlovu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+immunomonitoring+models+of+HIV-1-specific+CD8+T-cell+responses+accurately+identify+subjects+achieving+spontaneous+viral+control%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control.</a> Blood. 121, 801-811 (2013).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+HIV-specific+CD4+T+cells+to+PD-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade.</a> Blood. 118, 965-974 (2011).</li>
<li>Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Der Überstand Sammlung ist ein Imperativ Teil dieser experimentellen Design. Bei der Ernte der Überstände zur Luminex-Assay wurden Aliquote hergestellt und bei -80 ° C gehalten, um den Proteinabbau durch Zyklen Einfrieren-Auftauen zu verhindern. Einfrieren und Auftauen kann hart Verfahren für Proteine ​​und durch Gefrier taut minimiert sein, werden in Tests Signal maximiert werden. Daher ist es einfacher, wiederholbare und genaue Daten beim Arbeiten von Aliquots, die gefriertaut die gleiche Anzahl von Zeiten zu erhalten...

Während der anhaltenden viralen Infektionen, Virus-spezifischen T-Zellen-erwerben Funktionsstörungen in einem Prozess als T-Zell-Erschöpfung bekannt. Früh in-vivo-Studien im murinen Modell der LCMV chronische Virusinfektion angegeben, dass erschöpft Virus-spezifische T-Zellen gegen zytolytische Funktion viral infizierte Zellen reduziert, verlieren ihre Fähigkeit zu vermehren und haben Fähigkeit, Zytokine wie IL-2, TNF-produzieren reduziert α und IFN-γ 1,2. Ein komplexes Netzwerk von immunWege, wie PD-1 und IL-10, während chronische Infektionen hochreguliert und zur T-Zell-Funktionsstörung (in 3,4 bewertet). In vivo-Verabreichung von blockierenden Antikörpern gegen diese hemmenden Bahnen in der LCMV-Maus Modell restauriert Funktion erschöpft virusspezifischen T-Zellen und eine verbesserte Virenfreiheit, die anzeigt, dass T-Zell-Erschöpfung ist ein Phänomen teilweise reversibel (in 5 Bewertung). Erkenntnisse über thE LCMV-Modell wurden schnell die menschliche chronische Virusinfektionen wie HBV, HCV und HIV 5 verlängert. Bei der chronischen HIV-1-Infektion, sind PD-1 und IL-10 Wege in infizierten Patienten hochreguliert und korrelieren mit den Parametern der Krankheitsprogression, direkt mit der Viruslast und umgekehrt mit der CD4-Zellzahl 6-8. Antikörper Blockade der PD-1 oder IL-10 in vitro Wege wiederhergestellt Proliferation von HIV-spezifischen CD4-und CD8-T-Zellen, was anzeigt, dass, ähnlich der LCMV-Maus-Modell, ist T-Zell-Erschöpfung bei Menschen eine teilweise reversible Phänomen. Aufgrund der empfindlichen Natur von Experimenten an menschlichen Proben sowie Einschränkungen in der Empfindlichkeit der in-vitro-Assays, gründliche Untersuchung der funktionellen Wiederherstellung von Profilen dieser Interventionen erreicht wird, ist jedoch auffallend abwesend. Proliferationsassays wurden, so weit, die einzige zuverlässige in-vitro-Test in den meisten Studien getestet, aber es ist ein bemerkenswerter Mangel an Beweisen über die Auswirkungen dieser interInterventionen auf: 1) die Tötung Kapazität von zytotoxischen T-Zellen, 2) die antivirale Wirkung von T-Zellen auf die virale Replikation, 3) die Zytokinsekretion Profil und 4) die Wirkung auf CD4-T-Zell-Hilfe für andere Zell-Untergruppen. Intrazelluläre Cytokin-Färbung (ICS) ist eine sehr nützliche und weit verbreitet Durchflusszytometrie basierenden Assay, der verwendet wird, um die Produktion von Zytokinen in verschiedenen Zelltypen sowohl in Mäusen und Menschen zu erkennen. Es wurde auch verwendet, um die Wirkung der Antikörperblockade hemmenden Bahnen zu untersuchen. In ICS Assays wird Zytokinsekretion durch Zugabe von Brefeldin und / oder Monensin blockiert. Zytokine in den Zellen eingeschlossen werden dann mit fluoreszierenden Antikörpern mit polychromatischen Durchflusszytometrie detektiert. Die Dauer des Tests wird in der Regel 6 oder 12 Stunden nach der Antigen-Stimulation beschränkt, da sowohl Brefeldin und Monensin, die typischerweise innerhalb von 2 h von Antigen Zugabe zugegeben werden, sind für die Zellen toxisch. Das ICS-Assay ist eine leistungsfähige Technik, die sich als nützlich erwiesen hat in die Untersuchung der Wirkung der in vivo-Verabreichung von blockierenden Antikörper Eingriff mit Mäusen, wurden die Zellen nach einer gewissen Zeit nach der Antikörper-Belichtungs 9 extrahiert. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen bei der Anwendung dieser experimentellen Ansatz, die Auswirkungen der Blockade der inhibitorischen Rezeptoren im menschlichen Proben auszuwerten. Bei der Durchführung von Antikörper Eingriffe hemmenden Bahnen in einer 6 oder 12 h in-vitro-Stimulation (typischerweise der Fall bei humanen Proben), wird die Blockade der hemmenden Rezeptoren in den meisten Fällen die Frequenz reagiert Antigen-spezifischen T-Zellen nicht zu ändern, wie durch Standardassays gemessen ICS 6, 7. Messungen pro Zelle Zytokinproduktion durch Mittelwert oder Median der Fluoreszenzintensität gemessen, haben widersprüchliche Ergebnisse 6, 7, 10 angegeben. Andererseits, wenn ICS zu einem späten Zeitpunkt nach der Stimulierung durchgeführt (dh 6 Tage), Veränderungen in der Anzahl der Cytokin-sezer cEllen beobachtet werden. Die Unterschiede sind ein kombinierter Effekt der veränderten Proliferation, das Überleben und Veränderungen in Effektor-Funktion, die über den angegebenen Zeitraum 6 ansammeln. Eine Möglichkeit, diese Beschränkungen teilweise zu überwinden, ist für längere Zeiträume (z. B. 36 h, 60 h, etc.) Mit dem Antigen vor der Zugabe der Zytokinsekretion Blocker, ohne auf die Proliferation auftritt inkubieren. Wir haben erfolgreich diese Methode verwendet, um die Kinetik der Zytokinsekretion von HIV-spezifischen CD4-und CD8-T-Zellen zu bestimmen, 11,12, jedoch ist dieser Ansatz nicht in der Lage, kleine Antworten detektieren und ein integriertes Ergebnis die Gesamt Zytokinsekretion vorkommenden nicht geben seit Stimulation. Daher ist ICS nicht ausreichend empfindliches Verfahren, um die Auswirkungen der Blockade der hemmenden Bahnen auf der Anzahl von Zytokinen durch aktivierte T-Zellen produziert, verglichen mit Zytokin-mRNA-Quantifizierung oder Messungen der Cytokin-Sekretion im supernatan erkennent in den gleichen Zeitpunkten. Zusätzlich wirken die meisten der von aktivierten T-Zellen produzierten Zytokine in autokriner Weise durch einen Beitrag zur positiven oder negativen Rückkopplungsschleifen durch die Interaktion mit Antigen-präsentierenden Zellen. Daher Zugabe von Monensin oder Brefeldin im ICS Assay verhindert Zytokinsekretion und somit Stimulation von T-Zellen nicht optimal ist. Schließlich wird die Detektion von mehreren Cytokinen mit ICS durch die Verfügbarkeit und die Empfindlichkeit der Antikörper zum Nachweis von Zytokinen mit Durchflusszytometrie als auch durch Beschränkungen in der Anzahl von Fluorochromen, die gleichzeitig in einem gegebenen Panel verwendet werden können, begrenzt. Wir entwickelten ein hochempfindliches in vitro-Versuchsansatz, um die Auswirkungen von immun Wege der Regulierung der Zytokinsekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen und CD4 Hilfe anschließend auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) zu bewerten. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um die impa evaluierenct Blockade von inhibitorischen Moleküle auf CD8-T-Zellfunktion durch abbau die CD4-T-Zellen aus PBMCs oder durch Stimulation mit optimalen Peptide, die nur von CD8-T-Zellen erkannt werden. Im Gegensatz zu intrazellulären Zytokinfärbung Assays haben wir beschlossen, nicht mit der Cytokin-Sekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen, um in der Lage zu sein, beeinträchtigt: 1) führen eine genauere Quantifizierung der produzierten Zytokinspiegel, 2) Untersuchung eine breitere Platte von Cytokinen oder Effektormoleküle, und 3) die Auswirkungen von von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen auf andere Zellen-Untergruppen produzierten Zytokine. Wir stimulieren CD8 abgereicherten PBMC mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool in Gegenwart von blockierenden Antikörpern für die immun Weg von Interesse. Nach der gewünschten Inkubationszeit, in der Regel 48 Stunden, sammeln wir die Überstände Zytokinsekretion mit Perlenanordnungen messen und sammeln die Zellpellets entweder für phänotypische Analyse der verschiedenen Zelluntergruppen oder für die Transkriptionsanalyse. Von beachten Sie, dass bei tseine 48 h Zeitpunkt haben wir nicht eine bedeutende Population von proliferierenden T-Zellen 12 zu erfassen. Dies ist ein flexibler Ansatz und mehrere Anpassungen dieser Konstruktion kann angewendet werden, um verschiedene Hypothesen zu adressieren. Zum Beispiel können die einzelnen Zelluntergruppen (z. B. HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen oder PD-1 Hoch CD4-T-Zellen, etc..) Nach 12 h Inkubation vor der weiteren Inkubation für 36 Stunden, gefolgt vom Sammeln der Überstände und Zellpellets sortiert um genauer zu untersuchen die Auswirkungen der Blockade auf Interventionen Zytokinsekretion durch definierte Subpopulationen von PBMCs.

<table><tbody><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution ohne Ca2+ oder Mg2+</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum AB</td><td>Gemini BioProducts</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Mediatech</td><td>30 001 CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Mediatech</td><td>25 005 CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Puffer</td><td>Mediatech</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>FcR blockierendes Reagenz, human</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep humane CD8+ Depletion Cocktail </td><td>Stammzelle</td><td>15663</td><td></td></tr><tr><td>LEBEN/TOT Fixierbares Totzellen-Färbekit, für UV-Anregung</td><td>Invitrogen</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Improm-II Reverse Transkriptionssystem</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600830</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixierung/Permeabilisierung Solution Kit</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337100</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&#947; Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>FÜR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td></tr><tr><td>GAPDH Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>FÜR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG</td></tr></tbody></table>

in vitro-test, um die auswirkungen von immun pathways auf die hiv-spezifischen cd4 t-zell-effektor-funktion auswerten

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T-Zell-Erschöpfung ist ein wichtiger Faktor in gescheiterten Erreger Freiheit während der chronischen Virusinfektionen. Immunwege, wie PD-1 und IL-10 sind bei dieser laufenden Antigenexposition hochreguliert und tragen zum Verlust von Proliferation, cytolytische Funktion reduziert und durch CD4-und CD8-T-Zellen-Cytokinproduktion beeinträchtigt. Im Mausmodell der LCMV-Infektion, die Verwaltung der blockierenden Antikörper gegen diese beiden Wege erweitert T-Zellantworten. Allerdings gibt es noch keine in vitro Assay, um die Auswirkungen dieser Blockade Zytokinsekretion in Zellen aus menschlichen Proben zu messen. Unser Protokoll und experimentellen Ansatz ermöglichen es uns, genau und effizient zu quantifizieren, die Wiederherstellung der Zytokin-Produktion von HIV-spezifischen CD4-T-Zellen von HIV-infizierten Patienten. Hier wird ein in vitro-Versuchsanordnung, die Messungen der Cytokin-Sekretion kann durch HIV-spezifische CD4 + T-Zellen und deren Auswirkungen auf andere cel zeigen wirl Teilmengen. CD8-T-Zellen wurden aus Vollblut erschöpft und Rest PBMCs wurden über Ficoll-Trennverfahren isoliert. CD8-abgereicherten PBMC wurden dann mit blockierenden Antikörpern gegen PD-L1 und / oder IL-10Rα und nach Stimulation mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool wurden die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert. Nach 48 Stunden Überstand wurde für die Zytokin-Analyse durch Perlen-Arrays und Zellpellets gesammelt wurden, entweder für phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie oder Transkriptionsanalyse mittels qRT-PCR gesammelt. Für weitere detaillierte Analyse wurden verschiedene Zellpopulationen durch selektive Depletion Teilmenge aus PBMCs oder durch Sortieren mit Durchflusszytometrie, bevor sie in den gleichen Tests untersucht erhalten. Diese Verfahren stellen eine sehr empfindliche und spezifische Ansatz zur Modulation der Cytokin-Produktion durch Antigen-spezifische T-Helferzellen zu bestimmen und funktionellen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Populationen von Immunzellen zu bestimmen.

Bei der Durchführung von Messungen unter Verwendung dieses Zytokin in vitro-System, ist es wichtig, in der Lage, das Antigen-spezifische Reaktionen gegenüber der Kontrolle ohne Stimulation zu unterscheiden. Im allgemeinen betrachtet man positive Reaktionen wie alle Werte der antigenen Stimulation, die mindestens dreifache Zunahme in Zytokinspiegel Vergleich zu der Kontrolle ohne Stimulierung und davon waren innerhalb des linearen Bereichs des Assays zu ergeben. Wir sind mit hoher Empfindlichkeit Bead-Assays, di...

Wir entwickelten ein in vitro Assay, um die Rolle von immunWege in der Regulation der Zytokin-Sekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen zu untersuchen.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zytokinsekretion, Transkription und morphologische Wirkung von stimulierten T-Zellen zu analysieren. Zuerst wird ein FI-Call-Gradient verwendet, um die peripheren CD zu isolieren: acht abgereicherte mononukleäre Blutzellen von den HIV-infizierten Personen inkubieren die Zellen entweder mit der Isotypkontrolle oder dem blockierenden Antikörper von Interesse. Stimulieren Sie dann die Zellen mit dem gewünschten Antigen.Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellkulturen, um Überstände für Zytokinmessungen und Zellpellets für die phänotypische Analyse oder Transkriptionsanalyse zu sammeln, falls gewünscht. Passen Sie dieses Protokoll so an, dass es die Sortierung der einzelnen Zelltypen durch Durchflusszytometrie einschließt. Ergebnisse zur Zytokinsekretion. Phänotypische oder transkriptionelle Analysen können den Einfluss der Antikörperblockade von inhibitorischen Signalwegen auf die Wiederherstellung der Effektorfunktion von HIV-spezifischen Zöliakie-T-Zellen zeigen.Dieser In-vitro-Assay kann effektiv zur Quantifizierung von Zytokinspiegeln verwendet werden, die durch die Blockade von Hemmwegen wiederhergestellt wurden, zur Untersuchung einer breiten Palette von Effektormolekülen und auch zur Bewertung der Auswirkungen von Zytokinen, die von HIV-spezifischem C für T-Zellen produziert werden, auf andere Zelluntergruppen. Megan Hart, eine Forschungstechnikerin aus unserem Labor, wird nun dieses Verfahren demonstrieren: Deplete the CD eight positive T-Zellen durch Zugabe des menschlichen CD 8 positiven Depletionscocktails bei 50 Mikrolitern pro Milliliter Vollblut, mische gut und inkubiere 20 Minuten lang. Mischen Sie bei Raumtemperatur das Vollblut mit dem Puffer des Strangs.Schichten Sie nun das Blut vorsichtig auf das Histo-Pack, dann zentrifugieren Sie den Gradienten bei 540 RCF für 30 Minuten. Sammeln Sie die Schicht der mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Füllen Sie die Zellen in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie sie zweimal mit 45 Millilitern vollständigem RPMI 1640.Suspendieren Sie die gewaschenen Zellen wieder in vollständigem RPMI 1640. Aliquotieren Sie dann 500 Mikroliter Zellsuspension pro Faxschlauch. Je nach untersuchtem Signalweg fügen Sie die blockierenden Antikörper hinzu.Fügen Sie auch die Isotyp-Regler zu den entsprechenden Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 15 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Als nächstes stimulieren Sie die Zellen mit einem HIV-One-Gag-Peptidpool.Fügen Sie auch eine Kontrolle ohne Stimulation für jede Blockierungsbedingung hinzu. Setzen Sie die Kultivierung der Zellen 48 Stunden lang fort. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, ohne das Pellet zu stören.Zweimal 225 Mikroliter Überstand in EOR-Röhrchen für die Luminex Speed Arrays übertragen, um das Virus bei 25 Mikrolitern 0,5 %PBS Tween zu inaktivieren. Messen Sie dann die gewünschten Zytokinkonzentrationen mit dem Millipore-Luminex-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Nachdem Sie die Zellen in drei Millilitern PBS gewaschen haben, färben Sie sie auf Lebensfähigkeit, resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS mit 1 % FBS, wenn Sie auf Monozyten oder andere Antigen-präsentierende Zellen bei 1,4 Mikrolitern FCR-blockierendem Reagenzvortex färben, um sich zu mischen und 10 Minuten bei vier Grad Celsius zu inkubieren.Als nächstes fügen Sie die Oberflächenantikörper hinzu und inkubieren 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Nach einmaliger Wäsche bei 200 Mikrolitern 4%para Formaldehyd und 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach einer Wäsche suspendieren wir die Zellen in 250 Mikrolitern 1%FBS zur Analyse auf einem Multi-Laser-Durchflusszytometer für quantitative R-T-P-C-R, lycieren die Zellen in 300 Mikrolitern Kyogenpuffer, RLT, der 1%Beamer Keto-Ethanol-Isolat-RNA enthält, unter Verwendung eines RNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers.Synthetisieren Sie nun CD NA aus der RNA mit einem CD NA-Synthesekit und nach dem Protokoll des Herstellers. Erstellen Sie als Nächstes eine Primermischung für jeden Primer, einschließlich der Haushaltsgene, indem Sie Primer zu nukleasefreiem Wasser hinzufügen und auf Eis halten. Für jeden Amplifikations-Mastermix fügen Sie 10,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser, 12,5 Mikroliter Cybergrün und einen Mikroliter Primermischung pro Platte hinzu.Nun, pipettieren Sie jetzt 24 Mikroliter Mastermix in jede Reaktion. Nun, fügen Sie auch jeweils einen Mikroliter CD NA hinzu, gut nach der Vorlage. Verschließen Sie die Vertiefungen und zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 1500 RCF.Führen Sie die Platte dann auf einem QRT-PCR-R-Gerät für die Färbung der Zelloberfläche aus. Fügen Sie die Felden- und Monin-Färbungen etwa sechs Stunden vor der intrazellulären Zytokinfärbung hinzu. Waschen Sie dann die Zellen mit 1%FBS in PBS und färben Sie sie nach dem Waschen der Zellen mit einem Fixationspermeationslösungskit und einem Protokoll auf intrazelluläre Zytokine.Nachdem wir die Pellets in 250 Mikrolitern 1%FBS suspendiert haben, führen wir die Proben 16 Stunden nach der Stimulation auf einem Multi-Laser-Durchflusszytometer durch, um die Lebensfähigkeit mit dem Live Dead Fixable Dead Cell Stain-Kit zu gewährleisten. Gemäß dem Protokoll des Herstellers suspendieren wir die Zellen nach einer PBS-Wäsche in 100 Mikrolitern 1%FBS an der Oberfläche des Antikörperwirbels, um die Zellen 20 Minuten lang im Dunkeln auf Eis zu mischen und zu inkubieren. Waschen Sie die Zellen einmal und suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern kalter Nahrung, ergänzt mit RPMI 1640.Anschließend filtrieren die Medien die Zellen durch eine Kappe des Zellsiebs in ein fünf Milliliter schweres Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Als nächstes werden 200 Mikroliter komplementäres RPMI 1640-Medium in jedes Sammelröhrchen gegeben. Halten Sie alle Röhrchen während der Sortierung auf Eis, sortieren Sie die interessierenden Zelluntergruppen auf einem Instrument, das sich in einer Einrichtung befindet, die für die Kultivierung von biogefährlichen Materialien ausgestattet ist.Die sortierten Zellen für die gewünschte Zeitspanne. Nach der Analyse von Luminex- und PCR-Analysen in diesem Experiment führt die Stimulation von CD 8 mit abgereichertem pbmc mit einem HIV V One Gag-Peptidpool zu einer durchschnittlichen 800-fachen Steigerung der Interferon-Gamma-Produktion. Der Spiegel der Interferon-Gamma-Transkripte war nach der Stimulation median um das Zehnfache erhöht.Die Ergebnisse der In-vitro-Analyse der HIV-spezifischen Zölia-Vier-T-Zell-Funktion deuten auf eine starke Korrelation zwischen der Interferon-Gamma-Proteinsekretion und den Interferon-Gamma-mRNA-Spiegeln hin. Interessanterweise führt die Stimulation durch den HIV-Gag-Peptid-Pool zu einer größeren Interferon-Gamma-Sekretion als die bakteriellen Antigene von Tetanus. Weitere Ergebnisse mit dem IL 13-Sekret deuten auf die unterschiedlichen Zytokinprofile von HIV- und Tetanus-spezifischen Zöliakie-4-T-Zell-Antworten hin.Die Blockade des PD-Eins-Signalwegs hat im Allgemeinen keinen signifikanten Einfluss auf die Zytokinsekretion ohne Antigenstimulation, erhöht jedoch die Interferon-Gamma- und IL-2-Sekretion. Wenn Zellen mit HIV stimuliert werden, sammelt sich ein Gag-Peptid. Wenn Zöliakie drei Zellen aus dem pbmc depletiert werden, wird kein Interferon gamma oder IL zwei als Reaktion auf die Antigenstimulation produziert.Diese Daten deuten darauf hin, dass die Sekretion von Interferon, gamma und IL two als Reaktion auf HIV-spezifische CD four-, T-Zell- und Antigen-spezifische Stimulation induziert wird. Dieses Experiment verwendet den demonstrierten Arbeitsablauf mit faktensortierten CD-4-T-Zellen, um den Einfluss der PD-1-Blockade auf Interferon-Gamma und IL zwei zu untersuchen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, zu untersuchen, wie immunregulatorische Moleküle das Zusammenspiel von HIV-spezifischen Zölia-Vier-T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen regulieren.Hier wurde das Protokoll so angepasst, dass eine intrazelluläre Zytokinfärbung 48 Stunden nach der Stimulation durchgeführt wird. Die Ergebnisse zeigen, dass Monozyten nach Stimulation mit HIV-One-Gag-Peptidpools die primäre Quelle für IL 12 sind. Dieser experimentelle In-vitro-Ansatz ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der T-Zell-Immunologie, den Einfluss immunregulatorischer Signalwege auf die Regulierung der effektiven Funktion von Addison-spezifischen T-Zellen in menschlichen Proben zu untersuchen.

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